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Article de méthode

Approche en deux étapes pour explorer et fin-début de la Formation des organes dans le modèle aviaire : le Thymus et des glandes parathyroïdes organogenèse paradigme

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DOI :

10.3791/57114

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17 juin 2018

 , 
1Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa

Dans cet article

Résumé

Cet article fournit une approche de mise à jour du système classique caille-poulet chimère pour étudier la formation des organes, en combinant les nouvelles procédures expérimentales in vitro et in ovo .

Résumé

L’embryon aviaire, comme modèle expérimental, a été primordial pour séminales découvertes en biologie du développement. Parmi plusieurs approches, la formation des chimères de caille-poulet et l’utilisation de la membrane chorio-(CAM) pour soutenir le développement de tissus ectopiques remontent au siècle dernier. De nos jours, la combinaison de ces techniques classiques avec des méthodologies récentes in vitro offre des perspectives nouvelles pour explorer davantage la formation des organes.

Nous décrivons ici une approche en deux étapes afin d’étudier et de tard-début de l’organogenèse. Brièvement, la région embryonnaire contenant le territoire présomptif de l’orgue est isolée à partir d’embryons de caille et cultivés in vitro dans un système organotypique (jusqu'à 48 h). Des tissus cultivés sont ensuite greffées sur la CAM d’un embryon de poulet. Après 10 jours en ovo développement, organes entièrement formées sont obtenus à partir des tissus greffés. Cette méthode permet également la modulation des voies de signalisation par l’administration régulière d’agents pharmacologiques et manipulation génétique des tissus tout au long des étapes du développement in vitro et in ovo . En outre, des tissus peuvent être collectées à toute fenêtre de temps pour analyser leur profil d’expression génétique (à l’aide de la PCR quantitative (qPCR), puces, etc.) et leur morphologie (évalué avec immunochimie et histologie conventionnelle).

La procédure expérimentale décrite peut servir comme un outil pour suivre la formation des organes à l’extérieur de l’embryon aviaire, depuis le début de l’organogenèse entièrement formé et les organes fonctionnels.

Introduction

Embryons aviaires ont été largement utilisées dans les études de biologie du développement séminal. Les principaux avantages du modèle aviaire incluent la possibilité d’ouvrir le œuf, l’accès relativement facile à l’embryon et la capacité d’exécuter micromanipulation. Quelques exemples comprennent le système classique caille-poulet chimère pour l’étude des cellules sort1, application des facteurs de croissance spécifiques à l' embryon2et la croissance des structures cellulaires ectopiques dans le CAM1,3, 4.

Pour obtenir de nouvelles connaissances en étapes distinctes de la formation des organes, nous avons récemment mis au point une méthode qui combine les techniques de greffage avec in vitro la manipulation des tissus embryonnaires5. L’approche en deux étapes permet à la discrimination et l’exploration de deux et fin-début de l’organogenèse, qui sont souvent limités en raison des tissus hautement dynamique et complexe des interactions2. En outre, l’absence de marqueurs de tissu-spécifique adaptés limite souvent l’utilisation de génétiquement modifiés6de modèles animaux. Cette nouvelle méthode de l’approche en deux étapes surmonte largement ces limites.

Pour étudier le début de la formation des organes, dans la première étape, territoire embryonnaire caille comprenant le rudiment de l’éventuel organe est isolé et cultivé dans un système in vitro organotypique pendant 48 h. Durant cette période, la modulation pharmacologique des voies de signalisation spécifiques peut être effectuée en ajoutant des drogues dans le milieu de culture5,7. En outre, des tissus cultivés soient collectées à tous les stades de la croissance in vitro et sondés pour expression génétique (à l’aide de méthodes telles que qPCR, puces, etc.).

Dans la deuxième étape, les 48 h-cultivées tissus sont ensuite greffées sur la CAM d’un embryon de poulet (c) à jour embryonnaire (E) 8 (cE8) (Hamburger et Hamilton (HH)-met en scène 33-35)8. La came se comporte comme un fournisseur vasculaire de nutriments et permet aux gaz échanges1,3,4 tissus greffés permettant son développement en ovo pour des périodes plus longues. Cette étape expérimentale est particulièrement bien adaptée pour étudier les derniers stades de l’organogenèse, comme organes entièrement formées peuvent être obtenus après 10 jours de ovo développement5,9,10,11 . Analyse morphologique est facilement réalisée par histologie conventionnelle pour confirmer la formation des organes appropriés et origine donneur de cellules peut être identifié par immunohistochimie à l’aide d’anticorps spécifiques d’espèce (c.-à-d., MAb caille périnucléaire (QCPN)). Au cours de la période d’incubation de CAM, greffes peuvent être également cultivés en présence d’agents pharmacologiques et recueillies à n’importe quel stade de développement pour évaluer la progression de l’organogenèse.

L’approche en deux étapes, décrit ici en profondeur, a déjà travaillé en Figueiredo et al. 5 d’envisager l’élaboration de primordium commun aviaire parathyroïde/thymus. En conséquence, les particularités inhérentes des territoires embryonnaires et stades de développement impliqué dans l’organogénèse du thymus et des glandes parathyroïdes seront présentés ci-dessous.

Le thymus et l’épithélium des glandes parathyroïdes, bien que fonctionnellement distinctes, dérive de l’endoderme des sachets pharyngées (PP)12. Aviaire, l’épithélium des ces organes sont originaires de la troisième et quatrième PP endoderme (3/4PP)12, tandis que chez les mammifères l’épithélium thymique dérive de la 3PP et l’épithélium des glandes parathyroïdes dérive de la 3PP et 3/4PP en souris et humains, respectivement13,14.

Une des premières étapes dans la formation de ces organes est l’émergence du thymus discrète et domaines parathyroïdiennes dans le primordium commun. Dans le poulet, ces domaines peuvent être identifiés par hybridation in situ , avec des marqueurs moléculaires spécifiques, à E4.515. Comme développement produit, ces rudiments d’orgue individualiser et séparent du pharynx, alors qu’une mince capsule mésenchymateuse, formée par des cellules neurales de crête, qui les entoure (à E5 ; 27 HH-stage). Plus tard, on l’épithélium thymique est colonisé par des cellules progénitrices hématopoïétiques (à E6.5 ; HH-stage 30)12.

Comme dans les études de caille-poulet classiques1,12, l’approche en deux étapes est particulièrement utile pour étudier la formation des organes hématopoïétiques/lymphoïdes, à savoir le thymus5. Comme la caille explantation, avec le rudiment de l’orgue, est greffée dans l’embryon de poulet avant la colonisation des cellules progénitrices hématopoïétiques, un thymus chimérique est formé avec poulet hématogène progéniteurs infiltrer un homologue épithéliales thymiques caille. Cette méthode est, par conséquent, un outil utile pour étudier la contribution des cellules hématopoïétiques dans le développement du système lymphoïde/hémato aviaire.

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Protocole

Toutes ces expériences suivent les soins aux animaux et les lignes directrices éthiques de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.

1. incubation de caille fécondés et œufs de poule

  1. Incuber caille japonaise (Coturnix japonica coturnix) et des oeufs de poulet (Gallus gallus) fécondé pendant 3 à 8 jours, respectivement.
    1. Placer les oeufs avec la chambre à air (extrémité émoussée oeuf) vers le haut dans un incubateur humidifié à 38 ° C.
    2. Utiliser des oeufs de caille environ 20 et 40 œufs de poule pour réaliser cette expérience.
      NOTE : Ces chiffres devraient être doublés lors de l’établissement de cette procédure pour la première fois.

2. isolement des cailles région embryonnaire contenant le territoire présomptif des Rudiments du thymus et la glande parathyroïdes

Remarque : Effectuez des oeufs des procédures de manipulation en conditions stériles à l’aide d’une hotte à flux laminaire horizontal et les instruments stérilisés et les matériaux.

  1. Préparer un bol en verre de borosilicate grand environs 3/4 rempli d’une solution froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  2. Ouvrir un oeuf de caille après 3 jours d’incubation en tapant la coquille et découpe d’une ouverture circulaire sur le côté opposé de son extrémité arrondie avec des ciseaux courbes. Soigneusement, enlever des morceaux de coquilles et transférer l’embryon dans le bol en verre bac à froid.
  3. Maintenez l’embryon de caille (q) à l’E3 (qE3) (la scène de caille correspondant au HH-stade 21 du poulet) avec l’aide de pinces fines. Faites une coupe dans la membrane vitelline enveloppant le jaune d’oeuf à l’aide de ciseaux courbes. Continuer à couper autour et à l’extérieur de la circonférence des vaisseaux extra embryonnaire.
  4. Transfert de l’embryon dans un petit bol environ 3/4 de bac à froid à l’aide de pinces fines. Laver soigneusement l’embryon du jaune restant attaché.
  5. Utiliser une écumoire pour transférer l’embryon à un verre de 100 mm boîte de Pétri avec base noire (voir Table des matières) contenant 10 mL de PBS froid.
  6. Placer le plat de Pétri sous un stéréomicroscope.
    Remarque : À partir de ce moment, effectuez les procédures de microchirurgie sous un stéréomicroscope pour grossissement progressif. Comme source d’illumination, il est conseillé d’utiliser des lumières LED intégrées dans le stéréomicroscope ou dans les fibres optiques, compte tenu de la charge de chaleur limitée.
  7. Tenez l’embryon vers le bas de la plaque avec les broches insectes minces. Placez les quatre broches formant une forme carrée dans la région extra embryonnaire.
  8. Retirer les membranes extra embryonnaires de la région céphalique avec l’aide de pinces fines et y placer une goupille de cinquième.
    Remarque : Si l’embryon est correctement positionné, puis la vésicule otique, le tube de coeur et le 1st, 2èmeet 3rd arcs pharyngiens (Fe) doivent être visibles.
  9. Disséquer la région embryonnaire d’intérêt, c'est-à-dire, le 3rd et 4th de région arc pharyngien (3/4PAR), à l’aide de ciseaux œil Wecker.
    1. Commencer à couper longitudinalement et parallèlement à l’axe de l’embryon, entre la zone de tube neural/somite et le PAs.
    2. Retirez le tube de coeur positionnée sur le ventre en le coupant. Garder les ciseaux dans la même position, faire tourner la boîte de Pétri pour repositionner l’embryon selon la direction de la coupe.
    3. Couper entre les 2ème et 3rd PAs et en dessous de la 4ème PA
    4. Détacher les membranes restantes de la 3/4PAR avec l’aide de pinces fines.
  10. Aspirer les tissus isolés (les 3/4PAR) et le transfert à un plat en verre 3/4 bac à froid à l’aide d’une pipette en plastique stérile de 2 mL.
    Remarque : Ci-après, les tissus peuvent être cultivées in vitro jusqu'à 48 heures ou être immédiatement greffés sur la CAM d’un embryon de poulet à E8.
  11. Garder le plat en verre contenant les 3/4PAR isolés sur la glace lors de la préparation du test in vitro .

3. essai in Vitro organotypique avec : Culture de la région embryonnaire contenant le territoire présomptif des Rudiments du thymus et la glande parathyroïdes

  1. Préparer le milieu de culture avec RPMI-1640 additionné de 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine.
    NOTE : Les réactifs pharmacologiques solubles peuvent être ajoutés au milieu (par exemple, LY-411.575 (Ly) et di-benzazépine ou cyclopamine et vismodegib, pour inhiber l’encoche et Hedgehog (Hh), signalisation, respectivement. Pour ce test, utilisez 50-200 nM de Ly ou de 5 à 15 µM de Di-benzazépine pour inhiber la signalisation Notch dans les 3 / 4PAR. Utilisez 20 µM de cyclopamine ou 10 µM de vismodegib pour inhiber la signalisation de Hh dans le 3/4PAR5.
  2. Préparer la culture in vitro de l’explant 3/4PP dans une plaque 6 puits.
    1. Remplir un puits de la plaque 6 puits avec 5 mL de milieu de culture. Placer un Insert Membrane en Polycarbonate de 24 mm (voir Table des matières) sur le puits à l’aide de pinces fines.
    2. Sous le stéréomicroscope, transférer l’explant 3/4PAR du verre plat à la surface de la membrane en glissant doucement à l’aide d’une cuillère de transplantation (ou une spatule) et mince forceps. Placez les explants avec la face ventrale vers le haut et la face dorsale, au contact de la membrane. Ajouter des explants jusqu'à sept par insertion de la membrane. Passez à l’étape 3.4.
  3. Alternativement, la culture des explants en flottant de membranes filtrantes.
    1. Préparer un plat de Pétri avec 5 mL de milieu de culture de 35 mm. Avec l’aide de pinces fines, flotteur une membrane filtre (voir la Table des matières) et garder une surface sèche au contact de l’air.
    2. Sous le stéréomicroscope, transférer l’explant 3/4PAR du verre plat dans le filtre à membrane en glissant doucement à l’aide d’une cuillère de transplantation (ou une spatule) et mince forceps. Placez les explants avec la face ventrale vers le haut et la face dorsale, au contact de la membrane. Ajoutez jusqu'à 8 explants par membrane filtrante.
  4. Placer soigneusement les explants préparés en étapes 3.2 et 3.3 dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2à humidifié.
  5. Après une incubation de 48 h, sortir la plaque 6 puits et le 35 mm boîte de Pétri de l’incubateur.
    1. Recueillir les explants cultivés de l’insertion de la membrane de la plaque 6 puits.
      1. Ajouter PBS à température ambiante (RT) à l’insertion de la membrane.
      2. Détacher les explants de la membrane en la rinçant vigoureux à l’aide d’une pipette en plastique stérile de 2 mL.
      3. Avec l’aide de la spatule et pince fine, transférer les explants cultivés dans un plat de verre 3/4 remplis de PBS à température ambiante.
    2. De même, recueillir les explants cultivés du filtre à membrane flottante dans la boîte de Pétri de 35 mm.
      1. Transférer le filtre à membrane avec une pince fine à nouveau Pétri 35 mm rempli avec du PBS à température ambiante.
      2. Détachez les explants de la membrane filtrante en vigoureux pipetage en utilisant une pipette stérile en plastique de 2 mL.
      3. Avec l’aide de pinces fines, décharge le filtre à membrane exempte d’explant après que confirmant qu’aucun des explants sont restés attachés à elle.
      4. Avec une spatule et pince fine, transférer les explants dans un plat de verre rempli de PBS à température ambiante.
  6. Transférer les explants cultivés avec une spatule à 1 mL de réactif pour l’ARN total et utiliser pour les études de l’expression génique.
    Mise en garde : L’exposition à ce réactif (voir Table des matières) peut être un danger grave pour la santé. Porter des gants, des vêtements et des lunettes de protection appropriées. Suivez les instructions de manipulation et de lire les fiches de données de sécurité fournies par le fabricant.
  7. Sinon, la greffe des tissus cultivés sur CAM d’embryons de poulet à E8. Procédez à l’étape 4.

4. préparation de la came

  1. Sortir les oeufs de poule avec 8 jours de développement embryonnaire de l’incubateur.
    Remarque : Les œufs ont été incubés avec chambre à air face vers le haut à 38 ° C dans un incubateur humidifié.
  2. Couvrir l’extrémité arrondie de l’oeuf avec un ruban en plastique transparent pour éviter les morceaux de la coque de tomber dans la chambre à air. Appuyez sur la coquille et coupez une ouverture circulaire dans l’oeuf avec des ciseaux courbes. La chambre à air doit être visible.
  3. Enlever avec précaution la membrane blanche de la chambre à air avec une pince fine. CAM est alors visible et accessible pour la transplantation de tissu ectopique.
    Remarque : N’utilisez pas de PBS pour hydrater le CAM, avant ou après la transplantation, puisque PBS favorise le glissement et l’égarement des explants. Si la membrane se dessèche, jeter l’oeuf.

5. greffage des Explants cultivés sur la CAM

  1. Créer des petites lésions vasculaires/blessures dans les petits navires de la came avec un microscalpel dans un support.
    Remarque : Utilisez la pointe d’une pipette Pasteur pour enlever le sang par capillarité dans le cas d’un saignement excessif.
  2. Utilisez une spatule et pince fine pour transférer les explants cultivés dans la région blessée de la came.
  3. Couper un morceau de papier filtre légèrement plus grand que l’explant et placez-le sur le dessus de l’explant.
    Remarque : Le papier filtre contribue à l’emplacement de l’explant de suivi après son développement dans la came. Il permet également, livraison de drogue quotidienne de l’explant au cours du développement de in ovo , si nécessaire (voir point 5.6).
  4. Fermer la fenêtre de l’oeuf avec du ruban adhésif en plastique transparent et l’identifier à l’aide d’un crayon de charbon de bois.
    Remarque : Le ruban en plastique protège l’embryon de déshydratation au cours de la période d’incubation.
  5. Incuber les œufs manipulé pendant 10 jours dans un incubateur humidifié à 38 ° C. Procédez à l’étape 6.
  6. Étape facultative : Administration de médicaments quotidienne au cours de la période d’incubation.
    1. Pour accéder au filtre, partiellement soulever la bande en plastique. Ajouter 100 µL de solution médicamenteuse, goutte à goutte, sur le papier. Refermer la fenêtre et placez l’oeuf dans l’incubateur humidifié à 38 ° C.
      Remarque : Pour ce test, la dose de 20 µM de cyclopamine nuira à Hh signalisation lors dans ovo développement5.

6. la Formation des organes ectopique dans la came après 10 jours de In Ovo Development

  1. Après 10 jours d’incubation, sortir le œuf de l’incubateur et retirer soigneusement le ruban en plastique.
  2. Couper la CAM autour de la région de filtre à l’aide de ciseaux courbes et transfert l’explant dérivé de CAM avec filtre papier pour un petit verre bol environ 3/4 de bac à froid.
  3. Avec l’aide de pinces fines transférer l’explant dérivé de CAM à une boîte de Pétri de 100 mm avec base noire contenant 10 mL de PBS. Retirez doucement le papier filtre et l’excédent de membrane à l’aide de Wecker oeil ciseaux et pinces fines.
  4. Transférer l’explant-CAM à la solution de fixation (3,7 % PFA dans du PBS) avec une écumoire. Euthanasier les embryons de poulet sans les retirer de l’oeuf en faisant une coupe précise dans la région du cou de l’embryon à l’aide de grands ciseaux.
  5. Évaluer la formation des organes dans les sections de paraffine des explants dérivé de CAM par immunohistochimie et histologie conventionnelle.

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Résultats

Ce qui précède décrit Détails du protocole une méthode qui permet à l’enquête des deux et fin-début de l’organogenèse, souvent limitée par des interactions cellulaires et moléculaires complexes.

Cette méthode a été précédemment employée dans Figueiredo et al. 5 à élucider le rôle de Notch et Hh signalisation dans le développement de primordium commun aviaire parathyroïde/thymus.

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Discussion

Un aspect crucial pour le succès de cette méthode est la qualité de la caille et de poulet oeufs. Étant donné que les périodes d’incubation longue, particulièrement au cours de l’essai in ovo , une bonne qualité des œufs de poule améliore la viabilité tarifs (jusqu'à 90 %) à la fin de la procédure. Pour ce faire, tester les oeufs provenant de fournisseurs différents. Incuber les œufs non manipulés pendant de longues périodes (jusqu'à 16-17 jours) et contrôler leur développement. Pour être considéré comme un lot ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants envers António Cidadão, Isabel Alcobia et Leonor Parreira pour la lecture critique du manuscrit, à Padma Akkapeddi pour la narration vidéo, et de Vitor Proa auprès du Service d’histologie de l’Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, pour le support technique. Nous sommes particulièrement redevables à Paulo Caeiro et Hugo Silva de l’Unidade de audiovisuais (unité de l’audiovisuel), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa pour leur engagement exceptionnel en faveur de la production de cette vidéo. Nous reconnaissons Leica Microsystems pour aimablement un stéréoscope équipé de système vidéo et de Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A de contribuer avec caille fécondés. Ce travail a été soutenu par Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Œufs de poule fécondés (Gallus gallus)Pintobar, PortugalFerme avicole  ;
Oeufs de caille fécondés (Coturnix coturnix)Interaves, PortugalFerme avicole  ;
Tubes à centrifuger en PP de 15 mLCorning430052
Tubes à centrifuger en PP de 50 mLCorning430290
Plats en pyrex de 60 x 20 mmGroupe Duran21 755 41
100 x 20 mm Plats en pyrexGroupe Duran21 755 48
Insert de membrane en polycarbonate.Corning3412Puits de 24 mm avec insert de membrane en polycarbonate à pores de 0,4 mm  ;
Filtre à membraneMilliporeDTTP013000,6 mm Filtre à membrane Isopore
Plaques de culture à 6 puitsNunc, Thermo Fisher Scientific140675 boîte de
Pétri, 35 x 10 mmSigma-AldrichP5112  ;
Bolsdu supermarché  ;
Pipettes de transfertSamco Scientific, Thermo Fisher Scientific2041SPipette en plastique 2 mL
Pipette pasteur en verrenormax5426015
Whatman  ; Papier filtre qualitatifSigma-AldrichWHA1001090Papier filtre
Rubande supermarché  ;
Cytokératine (pan ; acide et basique, cytokératines de type I et II), clone Lu-5BMA BiomedicalsT-1302
Hydrate de cyclopamineSigma-AldrichC4116Inhibiteur pharmacologique de la signalisation Hh
Sérum de bovin fœtalInvitrogen, Thermo Fisher ScientificStandart FBS
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148
Pénicilline-streptomycineInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15140-122
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)GIBCO, Thermo Fisher Scientific10010023
QCPN Anticorps Étudesdéveloppementales Hybridoma BankQCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  ;GIBCO, Thermo Fisher Scientific61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomère 1.1Kg KitELKEM/SilmidRH141001KGPour préparer la base dorsale de la boîte de Pétri
Stemolecule LY411575Stemgent04-0054Inhibiteur pharmacologique de la signalisation Notch
Réactif TRIzolInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15596026réactif pour l’isolement total de l’ARN
Dumont #5 Pinceoutils pour les sciences fines11251-30  ;Pinces fines
Ciseaux Bonn extra-fins, incurvésFine Science Tools14085-08Ciseaux courbes
Épingles à insectes  ;Outils de science fine26001-30
Micro spatule  ;Fine Science Tools10087-12Cuillère de transplantation
Minutien PinsFine Science Tools26002-20Microscalpel
Moria Nickeled Pin PinHolder Fine Science Tools26016-12Holder
Moria Perforated SpoonFine Science Tools10370-17Skimmer
Wecker Eye ScissorFine Science Tools15010-11
Appareil photoLeica Microsystems  ;MC170 HD
StéréoscopeLeica Microsystems  ;Leica M80
Leica Microsystems  ;Réf. DM2500
en pyrex plastique transparent à Microscope

Références

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