Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum

Résumé

Efforts pour comprendre en détail le fonctionnement du microgliales ont été entravées par le manque de modèles de culture microgliales qui récapitule les propriétés des matures in vivo de cellules microgliales. Ce protocole décrit une démarche d’isolement et de la culture visant à maintenir la survie robuste des microglies rat mature très ramifié dans des conditions définies et moyen.

Résumé

La microglie représentent 5 à 10 % de toutes les cellules du système nerveux central (SNC) et sont plus en plus attirant l’attention en raison de leurs contributions au cours de développement, l’homéostasie et la maladie. Bien que les macrophages ont été étudiés en détail pour des décennies, des fonctionnalités spécialisées des microglies, les macrophages tissulaires-résident du SNC, sont restés en grande partie mystérieuse, en partie à cause de limitations dans la capacité de récapituler des microglies mature biens immobiliers à la culture. Ici, nous montrons une procédure simple et directe pour l’isolement rapide de pure microglie du cerveau mature rongeur. Nous décrivons également les conditions de culture sans sérum qui prennent en charge des niveaux élevés de viabilité microgliales au fil du temps. Cultivées dans ces conditions de milieu défini la microglie pièce complexes processus ramifiés et comportement dynamique de surveillance. Nous illustrons quelques effets de l’exposition de sérum sur des microglies culture et examiner comment ces cultures sans sérum comparent à la fois exposés au sérum de cultures ainsi que la microglie in vivo.

Introduction

Comme les macrophages du parenchyme CNS, microglie interagir avec une vaste gamme de circuit neuronal et gliales réseaux de signalisation. Ils jouent un rôle vital dans le développement et l’homéostasie du cerveau par élagage synaptique, dégagement de cellules apoptotiques et transitoires interactions avec les processus neuronaux^1,2. Les microglies sont premiers intervenants de lésions neurologiques, étendre leurs processus longs et minces aux sites de la lésion pour coordonner les réactions inflammatoires et de limiter les saignements^3,4. Changements dans la morphologie des microglies et la fonction sont omniprésents dans les blessures de CNS aiguës et chroniques et la microglie pièce modifiée morphologie, localisation et l’expression de médiateurs inflammatoires dans un large éventail d’États de maladie¹. Des études génétiques humains indiquent que les mutations qui modifient le risque de maladies neurodégénératives sont souvent principalement ou exclusivement exprimées par la microglie dans le SNC intact, pointant vers un rôle critique pour la microglie dans la pathogenèse de la maladie ou la progression⁵ . Compte tenu de leur importance dans les blessures et les maladies, favoriser la compréhension de la biologie de la microglie est hautement prioritaire pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Nombreuses avancées essentielles à la compréhension de la biologie des microglies ont surgi en extrapolant des techniques et mécanismes découverts dans les études d’autres populations de macrophage, y compris les méthodes de culture, profils d’expression génique et définitions de fonctionnelle / morphologiques États. Bien que généralisée macrophage fonctions souvent se dérouler de façon surprenante dans le paysage de la CNS, les microglies sont elles-mêmes hautement spécialisé, présentant une morphologie ramifiée et une signature d’expression de gène unique qui les distingue des autres tissus macrophages⁶. La microglie ont une lignée qui se distingue de la plupart des autres macrophages tissulaires ; ils colonisent le système nerveux central au cours d’une vague embryonnaire précoce de l’hématopoïèse primitif et se renouvellement tout au long de la vie, indépendamment des contributions de l’hématopoïèse définitive⁷. La signature d’expression de gène de pleine maturité des microglies adulte n’est pas atteint jusqu'à la deuxième semaine après la naissance⁸. Les signaux environnementaux des tissus environnants jouent un rôle majeur en dictant des macrophages de tissu-spécifiques caractéristiques⁶, qui dans le système nerveux central comprend une exposition limitée à facteurs hématogène accordée par la barrière hémato - encéphalique⁹.

Un obstacle pour comprendre pleinement microgliales contributions à l’homéostasie du CNS et de la maladie est la difficulté de récapitulant les propriétés spécialisées des microglies mature vu en vivo avec cellules purifiées in vitro. Plusieurs méthodes ont été développées pour isoler et culture microglie intacte, mais la plupart des approches dépendent de sérum à l’appui de la survie des cellules. Nous avons montré que l’addition de sérum, qui est un réactif par nature variable contenant une vaste gamme de molécules bioactives, est particulièrement problématique lorsque travailler avec les cellules microgliales parce qu’elle encourage une morphologie amiboïde, augmente la prolifération, et phagocytose accrue⁹ a souvent vu dans vivo quand microglie sont exposés à des facteurs de diffusion hématogène après la rupture de la barrière hémato - encéphalique. Par ces mesures, exposés au sérum de cellules ressemblent à des microglies de blessures ou de maladies, mais ces altérations sont réduites quand les microglies sont cultivées en milieu défini contenant du CSF-1 (ou IL-34), le TGF-β, cholestérol et sélénite.

Ce protocole fournit des détails pour la culture des microglies rat juvénile dans des conditions sans sérum, associés à des travaux récemment publiés⁹. Ce protocole a été simplifié pour les rats de jour après la naissance 21-30 (P21 - P30), mais peut être adapté pour isoler la microglie de rats et de souris de n’importe quel âge, bien que le rendement et la viabilité globale variera selon l’espèce et l’âge de l’animal. Rendement maximal et viabilité optimale est obtenue lors de l’utilisation des microglies légèrement immatures (~ P9), avec des rendements et de la viabilité s’amenuisant progressivement à un peu plus faibles chez les animaux adultes. Microglies peuvent aussi être isolé chez des souris, mais nous avons trouvé que des cellules de rat montrent des rendements significativement plus élevée, la viabilité et complexité des morphologies ramifiés, comparativement aux cellules de la souris dans les cultures sans sérum. Animaux âgés de plus de P50 n’ont pas été évalués avec ce protocole. Cette procédure d’isolement d’immunopanning a été optimisée afin de minimiser les variations des profils transcriptionnelle microgliales lors de l’isolation et de maximiser la viabilité des cellules en aval. En utilisant ces techniques et les formulations de médias, des cultures primaires de haute-viabilité peuvent être maintenues pendant des semaines. Cultivées dans ces conditions la microglie présentent une morphologie très ramifiée impliquant rapide et la rentrée des processus et relativement faible taux de prolifération. Nous mettre en évidence l’importance du sérum-exposition sur ces propriétés et discuter des points forts et les faiblesses de cette méthode par rapport à d’autres approches.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des rongeurs étaient conformes aux directives de l’Université de Stanford, conformes aux politiques et lois étatiques et nationales. Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par la Commission Administrative de l’Université de Stanford sur la protection des animaux de laboratoire.

NOTE : Toutes les compositions de solution et le tampon sont fournies dans la Table des matières.

1. Préparez une boîte de Pétri CD11b Immunopanning (jour 0)

NOTE : Préparer 1 plat d’immunopanning pour chaque cerveau de rat juvénile 1-2.

1. Ajouter 25 mL de 50 mM Tris solution à pH 9,5 à un plat de Pétri de 15 cm.
2. Ajouter chèvre anti-souris IgG (chaînes de H + L) au plat pour une concentration finale de 6 µg/mL. Agiter la plaque pour répartir uniformément.
3. Incuber le plat pendant 1-3 h à 37 ° C.
4. Plats de rincer trois fois avec SPD⁺⁺ (tampon phosphate salin (PBS) avec Ca^{2 +} et Mg^{2 +}), puis remplacez par une solution de tampon contenant 1 µg/mL d’anticorps OX42 de panoramique. Laisser les plats du jour au lendemain à la température ambiante sur une surface plane.

2. tissu Collection (jour 1)

Remarque : Ce protocole devrait prendre environ 3-4 h.

1. Avant de commencer, s’assurer que toutes les solutions sont stériles et réfrigérés sur la glace. Réfrigérer tous les instruments sur la glace et stériliser avec de l’éthanol avant leur utilisation.
2. À la suite des procédures réglementaires appropriées, sacrifier un rat de laboratoire juvéniles par asphyxie de dioxyde de carbone.
   Remarque : Par ailleurs, les jeunes animaux peuvent être sacrifiés avec une dose létale de kétamine/xylazine (100-200 µL de 24 mg/mL kétamine, xylazine 2,4 mg/mL). La kétamine/xylazine doit être utilisé si les animaux sont moins de 14 jours d’âge. Si vous utilisez plusieurs animaux, extraire le tissu d’un animal et placez-le dans préalablement réfrigérées SPD⁺⁺ sur la glace avant de procéder à des animaux ultérieures.
3. Pincer un hindpaw et veiller à ce problème de blocage complet de l’animal avant de continuer.
4. Transcardially perfuse l’animal avec 10-30 mL de tampon de perfusion glacée à l’aide d’une aiguille 27½-G jusqu'à ce que le tampon soit limpide.
   Remarque : Le Volume de tampon de Perfusion variera selon la taille/âge de l’animal.
5. Immédiatement après la perfusion, sortez la tête de l’animal. En provenance de la moelle épinière du condyle occipital, découpez chaque côté avec des ciseaux de dissection, être attention à ne pas endommager le cerveau. Après avoir coupé avec soin chaque côté, couper un côté le long du pariétal et les os frontal vers l’os nasal. Avec une pince soigneusement tirer vers l’arrière la partie supérieure du crâne, rapidement enlever le cerveau (ou structures de CNS d’intérêt) et placer dans préalablement réfrigérées SPD⁺⁺ sur glace.
6. Répétez pour tous les animaux restants.
   Remarque : Toutes les étapes de la procédure doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire dans de bonnes conditions stériles.

3. mécanique Dissociation (jour 1)

1. Après que tous les cerveaux ont été recueillis, hacher un cerveau en morceaux³ 1 mm dans une boîte de Pétri sur la glace avec une lame de bistouri froid et transférer dans un homogénéisateur dounce glacée avec 5-7 mL de tampon de douncing glacée. Dissocier un cerveau à la fois.
2. Dissocier le tissu à l’aide de traits douces et incomplètes de 10-20 avec un ample dounce homogénéisateur. Prendre soin de ne pas écraser directement le tissu au bas de l’homogénéisateur, mais au contraire poussent le tissu à travers l’espace entre les côtés du piston et l’homogénéisateur.
3. Retirez le piston afin d’éviter l’introduction de bulles d’air. Laisser des morceaux de tissu mal dissociées se déposer au fond de l’homogénéisateur et transférer le surnageant dans un nouveau tube conique réfrigéré de 50 mL.
4. Remplacer le volume enlevé avec un tampon douncing fraîches et répétez les étapes 3.2 et 3.3 pour un total de 3-4 tours, ou jusqu'à ce que tous les tissus a été dissocié. Répétez l’opération pour chaque cerveau.

4. la myéline enlèvement (jour 1)

Remarque : Suppression de la myéline est utilisée pour l’isolement des microglies provenant d’animaux plus vieux que P12.

1. Mesurer le volume de la suspension cellulaire dans le tube conique de 50 mL à l’aide d’une pipette 25 mL, puis ajouter le tampon douncing glacée pour ajuster le volume total à 33,5 mL.
2. Ajouter 10 mL de tampon de séparation de la myéline (MSB) à la suspension cellulaire et mélanger soigneusement en renversant le tube plusieurs fois. Cela se traduira par une concentration finale de 23 % de la MSB dans un volume de 43,5 mL.
3. Centrifuger les cellules pendant 15 min à 500 x g à 4 ° C avec freinage lent.
   Remarque : La centrifugeuse devrait prendre environ 1,5 à 2 min à décélérer. Cela va générer une couche supérieure de la myéline et débris de cellules mortes, un surnageant quelque peu confu et un plus petit granulé qui est enrichie de cellules vivantes.
4. Enlever la couche supérieure de la myéline/débris et le surnageant avec une pipette. Prendre soin lorsque vous retirez la couche supérieure pour s’assurer qu’une grande partie de celle-ci est enlevée que possible.
5. Resuspendre le culot dans 12 mL de tampon de panoramique. Doucement, triturer la suspension cellulaire pour briser tout amas de cellules qui pourraient subsister.

5. Immunopanning (jour 1)

1. Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 70 µm pour éliminer les gros débris ou amas de cellules.
2. Rincer le plat panoramique OX42-couché trois fois avec SPD⁺⁺. Ne laissez pas la plaque complètement sec entre les lavages.
3. Décanter le dernier lavage SPD⁺⁺ et appliquer la suspension de cellules filtrées sur le plat panoramique. Doucement agiter la plaque pour distribuer les cellules, puis incuber la plaque sur une surface plane à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer. Incuber pas plus de 20 min ou cellules deviendra très difficiles de se remettre de la capsule.
4. Rincer le plat panoramique avec SPD⁺⁺ 10 fois pour enlever les cellules non adhérentes. La microglie sera solidement fixé à la plaque, donc agiter la plaque avec chaque rinçage à garantir l’élimination des autres cellules non adhérentes.
5. Décanter le dernier lavage SPD⁺⁺ et remplacez par 15 mL SPD⁺⁺ et 200 μL trypsine (solution mère de 1,25 %).
6. Incuber le plat pour ≤ 10 min à 37 ° C, avec 10 % de CO₂ à trypsinize.
   Remarque : Ne pas continuer plus longtemps que 10 min ou microglie deviendra difficile à enlever.
7. Après 10 min de la trypsinisation, microglie sera toujours collée à la plaque. Décanter la trypsine/SPD⁺⁺ et laver délicatement 2 x avec SPD⁺⁺ pour enlever la trypsine, remplacer avec 12 mL de milieu de culture des microglies glacee (MGM).
8. Lieu panoramique plat sur la glace pendant 2 min afin d’affaiblir l’interaction cellulaire/substrat et assurez-vous que le plat est plat pour éviter les zones du plat panoramique ne se dessèchent pas.
9. Pipetter vigoureusement avec un contrôleur 10 mL de pipette et pipette à haute vitesse pour récupérer des cellules du plat panoramique. Dessiner une grille 16 x 16 avec le flux de liquide de la pipette pour essayer de supprimer toutes les cellules.
10. Vérifier les cellules au microscope au grossissement de X 20 pour s’assurer que les cellules ont détaché de la plaque. Taches de marque sur le dessus de la capsule où les cellules sont toujours coincés et répéter pipetage dans ces domaines.
11. Recueillir les suspension cellulaire et l’aliquote 3 à 4 mL du surnageant par tube conique de 15 mL. Tournez pendant 15 min à 500 x g à 4 ° C avec freinage lent.
    Remarque : La microglie dans un petit volume de filature permet la récupération maximale des cellules.
12. Aspirer le surnageant, en laissant 0,5 mL de la MGM avec le culot cellulaire.
13. Resuspendre chaque culot dans MGM restant et les cellules de tous les tubes de la piscine.
14. Compter les cellules avec hémocytomètre.
15. Cellules de la plaque comme décrit dans les étapes 6 - 7 selon l’application.
16. Cellules de culture à 37 ° C, avec 10 % de CO₂.
    Remarque : Les cellules peuvent être la culture pour jusqu'à 3-4 semaines avec des changements réguliers de médias ou une semaine sans changement de médias.

6. repérer le revêtement des plaques de Culture de tissus/lamelles couvre-objet (jour 1)

1. Plaque 15 µL de revêtement de collagène IV directement au centre d’une plaque de culture de tissu enduit 24 puits anionique/cationique (voir Table des matières pour plus de détails) et incuber à 37 ° C, avec 10 % de CO₂pendant 15 minutes.
2. Après avoir compté un hémocytomètre cellules diluées à 2,3 x 105/ml au MGM. Aspirer la tache de collagène IV et immédiatement plaque 15 µL de suspension cellulaire à cet endroit ; Cela vous donnera 3. 5 x 10³ cellules/spot. Incuber pendant 5-10 min à 37 ° C, avec 10 % de CO₂ pour permettre aux cellules d’adhérer, ajouter 500 µL de CO_{2 -}équilibrés contenant milieu de croissance TGF-β2/IL-34/cholestérol (TIC) doucement dans le puits.
3. Si le placage sur les lamelles, premier manteau lamelles de verre stériles avec 10 µg/mL stratagème-D-lysine (PDL) en H₂O pendant 1 h à RT, laver 3 fois avec H₂O et laissez sécher dans un capot sous la lumière UV. Une fois que les lamelles soient secs, procéder avec placage spot sur les lamelles comme décrit dans l’étape 6.2.

7. placage pour l’isolement de l’ARN/protéines

1. Jour 1, manteau toute la zone d’un 24 puits anionique/cationique enduit plaque de culture tissulaire avec revêtement de collagène IV et incuber pour 10 min - 1 h à 37 ° C, avec 10 % de CO₂, puis retirez et immédiatement plaque 3-5 x 10⁴ cellules/puits dans CO₂ équilibrés Médias TIC.
2. Au jour 2, effectuer un changement de support de 50 % pour chacun bien le jour après la préparation. Les cellules mortes ont tendance à regrouper dans le centre du puits, afin de prendre médias de là.
3. Effectuer un changement de support de 50 % tous les 2-3 jours afin de maintenir les cultures. Si le milieu change introduire une variable non désirée pour les cultures, les cellules peuvent survivre pendant environ 1 semaine sans aucun changement de médias, par opposition à plus de 3 semaines avec un entretien régulier.

Résultats

Ce protocole décrit une méthode de culture haute pureté ramifiée microglie de jeunes rats. Résultats similaires peuvent être obtenus utilisant des animaux immatures, périnatales et adultes, tel que discuté ci-dessous. Étant donné que l’isolement de cellules comprendre souvent des nuances subtiles et nombreuses possibilités pour les cellules à mourir, nous avons utilisé points de contrôle de contrôle de la qualité pour aider à déterminer le succès à différentes étapes. En général, nous avo...

Discussion

Parce que les cellules microgliales servent de cellules immunitaires sentinelles du SNC, ils sont très sensibles aux changements environnementaux ; par conséquent, grand soin est nécessaire pour minimiser les réactions inflammatoires dans les cellules au cours de leur isolement et de culture⁸. Ceci est accompli dans le présent protocole par le biais de vitesse et de température. Chaque fois que possible réduit considérablement l’activation, donc toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 4 ° C...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Rat : Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
souris anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panoramique : 1:1 000 ; Coloration : 1:500
Chèvre polycoloniale anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Coloration : 1:500
Lapin polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Coloration : 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-souris 594	Invitrogen	Cat# 11055	Coloration : 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-chèvre 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Coloration : 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Coloration : 1:500
Triton-X (détergent dans la coloration ICC)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Sulfate d’héparane	Galen Fournitures de laboratoire	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma  ;	Cat# M3149
Peptone à partir de solides de lait	Sigma	Cat# P6838
TGF-&beta ; 2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R& D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Cholestérol de la laine ovine	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning  ;	Cat# 354233
Acide oléique	Cayman Chemicals  ;	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoïque (Gondoïque) Acide	Cayman Chemicals  ;	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Pénicilline/ Streptomycine	Gibco Cat	# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acétyl cystéine  ;	Sigma	Cat# A9165
Insuline	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin  ;	Sigma	Cat# T1147
Sélénite de sodium	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (haute teneur en glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20  ;
Poly-D-lysine  ;	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plaques  ;	VWR	Cat# 62406-456
Name	>Company	Numéro de catalogue	Comments
Stock reagents  ;
Apo-transferrine			Reconstitution : 10 mg/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:100 Stockage : -20° ; C
N-acétylcystéine			Reconstitution : 5 mg/mL dans H2O Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20° ; C
Sélénite			Reconstitution : 2,5 mg/mL en H2O Concentration utilisée : 1:25 000 Conservation : -20° ; C
Collagène IV			Reconstitution : 200 &mu ; g/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:100 Stockage : -80° ; C
TGF-b2			Reconstitution : 2 mg/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20° ; C
IL-34			Reconstitution : 200 &mu ; g/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -80° ; C
		de laine ovine	Reconstitution : 1,5 mg/mL dans 100 % éthanol Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20° ; C
		d’héparane	Reconstitution : 1 mg/mL dans H2O Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20° ; C
Acide oléique/Acide			Reconstitution : Gondoïque : 0,001 mg/mL ; Oléique : 0,1 mg/mL dans de l’éthanol à 100 % Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20° ; C
de l’héparine			: 50 mg/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:100 Stockage : -20° ; C
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Solutions  ; Recette de
		perfusion	: 50 &mu ; g/mL d’héparine dans DPBS++ (PBS avec Ca++ et Mg+ +) Commentaires : À utiliser en cas de
tampon			Recette : 200 &mu ; L de DNaseI à 0,4 % dans 50 mL de DPBS++ Commentaires : À utiliser en cas de cuisson glaciale
Recette			: 2 mg/mL de peptone provenant de solides de lait dans
milieu de croissance microgliale (MGM)			DPBS++Recette : DMEM/F12 contenant 100 unités/mL de pénicilline, 100 &mu ; g/mL de streptomycine, 2 mM de glutamine, 5 &mu ; g/mL de N-acétylcystéine, 5 &mu ; g/mL d’insuline, 100 &mu ; g/mL d’apo-transferrine et 100 ng/mL de sélénite de sodium Commentaires : Utilisez du MGM glacé pour retirer la microglie du plat d’immnopanning.
Recette d’enrobage			: MGM contenant 2 &mu ; g/mL de collagène IV
Recette de tampon			: 9 mL de Percoll PLUS, 1 mL de 10x PBS sans Ca++ et Mg++, 9 &mu ; L 1 M CaCl2, 5 &mu ; L 1 M MgCl2 Commentaires : Bien mélanger après l’ajout de  ; CaCl2 et MgCl2
TGF-b2/IL-34/Milieux de croissance contenant du cholestérol (TIC)  ;			Recette : MGM contenant 2 ng/mL de TGF-b2 humain, 100 ng/mL d’IL-34 murin, 1,5 &mu ; g/mL de cholestérol de laine ovine, 10 &mu ; g/mL de sulfate d’héparane, 0,1 &mu ; g/ml d’acide oléique, et 0,001 &mu ; g/ml d’acide gondoïque Commentaires : Assurez-vous d’ajouter du cholestérol aux milieux chauffés à 37 ° ; C et ne pas ajouter plus de 1,5 &mu ; g/mL ou il précipitera. Ne filtrez pas les milieux contenant du cholestérol. Équilibrez les milieux TIC avec 10 % de CO2 pendant 30 minutes à 1 heure avant de les ajouter aux cellules pour assurer un pH optimal.

de sodium Cholestérol Sulfate gondoïque Reconstitution tampon de de cuisson glacial un de collagène IV de séparation de la myéline