Efforts pour comprendre en détail le fonctionnement du microgliales ont été entravées par le manque de modèles de culture microgliales qui récapitule les propriétés des matures in vivo de cellules microgliales. Ce protocole décrit une démarche d’isolement et de la culture visant à maintenir la survie robuste des microglies rat mature très ramifié dans des conditions définies et moyen.
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Article de méthode
Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum
Dans cet article
Résumé
Résumé
La microglie représentent 5 à 10 % de toutes les cellules du système nerveux central (SNC) et sont plus en plus attirant l’attention en raison de leurs contributions au cours de développement, l’homéostasie et la maladie. Bien que les macrophages ont été étudiés en détail pour des décennies, des fonctionnalités spécialisées des microglies, les macrophages tissulaires-résident du SNC, sont restés en grande partie mystérieuse, en partie à cause de limitations dans la capacité de récapituler des microglies mature biens immobiliers à la culture. Ici, nous montrons une procédure simple et directe pour l’isolement rapide de pure microglie du cerveau mature rongeur. Nous décrivons également les conditions de culture sans sérum qui prennent en charge des niveaux élevés de viabilité microgliales au fil du temps. Cultivées dans ces conditions de milieu défini la microglie pièce complexes processus ramifiés et comportement dynamique de surveillance. Nous illustrons quelques effets de l’exposition de sérum sur des microglies culture et examiner comment ces cultures sans sérum comparent à la fois exposés au sérum de cultures ainsi que la microglie in vivo.
Introduction
Comme les macrophages du parenchyme CNS, microglie interagir avec une vaste gamme de circuit neuronal et gliales réseaux de signalisation. Ils jouent un rôle vital dans le développement et l’homéostasie du cerveau par élagage synaptique, dégagement de cellules apoptotiques et transitoires interactions avec les processus neuronaux1,2. Les microglies sont premiers intervenants de lésions neurologiques, étendre leurs processus longs et minces aux sites de la lésion pour coordonner les réactions inflammatoires et de limiter les saignements3,4. Changements ....
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Protocole
Toutes les procédures impliquant des rongeurs étaient conformes aux directives de l’Université de Stanford, conformes aux politiques et lois étatiques et nationales. Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par la Commission Administrative de l’Université de Stanford sur la protection des animaux de laboratoire.
NOTE : Toutes les compositions de solution et le tampon sont fournies dans la Table des matières.
1. Préparez une boîte de Pétri CD11b Immunopanning (jour 0)
NOTE : Préparer 1 plat d’immunopanning pour chaque cerveau de rat juvénile 1-2.
- Ajo....
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Résultats
Ce protocole décrit une méthode de culture haute pureté ramifiée microglie de jeunes rats. Résultats similaires peuvent être obtenus utilisant des animaux immatures, périnatales et adultes, tel que discuté ci-dessous. Étant donné que l’isolement de cellules comprendre souvent des nuances subtiles et nombreuses possibilités pour les cellules à mourir, nous avons utilisé points de contrôle de contrôle de la qualité pour aider à déterminer le succès à différentes étapes. En général, nous avo.......
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Discussion
Parce que les cellules microgliales servent de cellules immunitaires sentinelles du SNC, ils sont très sensibles aux changements environnementaux ; par conséquent, grand soin est nécessaire pour minimiser les réactions inflammatoires dans les cellules au cours de leur isolement et de culture8. Ceci est accompli dans le présent protocole par le biais de vitesse et de température. Chaque fois que possible réduit considérablement l’activation, donc toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 4 ° C.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent que la recherche a été effectuée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprété comme un conflit d’intérêts potentiel.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Christopher et Dana Reeve Foundation International Consortium de recherche sur la moelle épinière, le Dr Miriam et Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, la Fondation de JPB, l’Institut Novartis de la recherche fondamentale, contributions généreuses de Vincent et Stella Coates et la Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Rat : Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| souris anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panoramique : 1:1 000 ; Coloration : 1:500 |
| Chèvre polycoloniale anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Coloration : 1:500 |
| Lapin polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Coloration : 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-souris 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Coloration : 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-chèvre 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Coloration : 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Coloration : 1:500 |
| Triton-X (détergent dans la coloration ICC) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Sulfate d’héparane | Galen Fournitures de laboratoire | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma ; | Cat# M3149 | |
| Peptone à partir de solides de lait | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-&beta ; 2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R& D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Cholestérol de la laine ovine | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning ; | Cat# 354233 | |
| Acide oléique | Cayman Chemicals ; | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoïque (Gondoïque) Acide | Cayman Chemicals ; | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Pénicilline/ Streptomycine | Gibco Cat | # 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acétyl cystéine ; | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insuline | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin ; | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sélénite de sodium | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (haute teneur en glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 ; | |
| Poly-D-lysine ; | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plaques ; | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Name | >Company | Numéro de catalogue | Comments |
| Stock reagents ; | |||
| Apo-transferrine | Reconstitution : 10 mg/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:100 Stockage : -20° ; C | ||
| N-acétylcystéine | Reconstitution : 5 mg/mL dans H2O Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20° ; C | ||
| Sélénite | Reconstitution : 2,5 mg/mL en H2O Concentration utilisée : 1:25 000 Conservation : -20° ; C | ||
| Collagène IV | Reconstitution : 200 &mu ; g/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:100 Stockage : -80° ; C | ||
| TGF-b2 | Reconstitution : 2 mg/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20° ; C | ||
| IL-34 | Reconstitution : 200 &mu ; g/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -80° ; C | ||
| de laine ovine | Reconstitution : 1,5 mg/mL dans 100 % éthanol Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20° ; C | ||
| d’héparane | Reconstitution : 1 mg/mL dans H2O Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20° ; C | ||
| Acide oléique/Acide | Reconstitution : Gondoïque : 0,001 mg/mL ; Oléique : 0,1 mg/mL dans de l’éthanol à 100 % Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20° ; C | ||
| de l’héparine | : 50 mg/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:100 Stockage : -20° ; C | ||
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Comments |
| Solutions ; Recette de | |||
| perfusion | : 50 &mu ; g/mL d’héparine dans DPBS++ (PBS avec Ca++ et Mg+ +) Commentaires : À utiliser en cas de | ||
| tampon | Recette : 200 &mu ; L de DNaseI à 0,4 % dans 50 mL de DPBS++ Commentaires : À utiliser en cas de cuisson glaciale | ||
| Recette | : 2 mg/mL de peptone provenant de solides de lait dans | ||
| milieu de croissance microgliale (MGM) | DPBS++Recette : DMEM/F12 contenant 100 unités/mL de pénicilline, 100 &mu ; g/mL de streptomycine, 2 mM de glutamine, 5 &mu ; g/mL de N-acétylcystéine, 5 &mu ; g/mL d’insuline, 100 &mu ; g/mL d’apo-transferrine et 100 ng/mL de sélénite de sodium Commentaires : Utilisez du MGM glacé pour retirer la microglie du plat d’immnopanning. | ||
| Recette d’enrobage | : MGM contenant 2 &mu ; g/mL de collagène IV | ||
| Recette de tampon | : 9 mL de Percoll PLUS, 1 mL de 10x PBS sans Ca++ et Mg++, 9 &mu ; L 1 M CaCl2, 5 &mu ; L 1 M MgCl2 Commentaires : Bien mélanger après l’ajout de ; CaCl2 et MgCl2 | ||
| TGF-b2/IL-34/Milieux de croissance contenant du cholestérol (TIC) ; | Recette : MGM contenant 2 ng/mL de TGF-b2 humain, 100 ng/mL d’IL-34 murin, 1,5 &mu ; g/mL de cholestérol de laine ovine, 10 &mu ; g/mL de sulfate d’héparane, 0,1 &mu ; g/ml d’acide oléique, et 0,001 &mu ; g/ml d’acide gondoïque Commentaires : Assurez-vous d’ajouter du cholestérol aux milieux chauffés à 37 ° ; C et ne pas ajouter plus de 1,5 &mu ; g/mL ou il précipitera. Ne filtrez pas les milieux contenant du cholestérol. Équilibrez les milieux TIC avec 10 % de CO2 pendant 30 minutes à 1 heure avant de les ajouter aux cellules pour assurer un pH optimal. |
Références
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development ....
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Réimpressions et autorisations
