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Hémisection latérale de la moelle épinière et évaluations comportementales asymétriques chez les rats adultes

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DOI :

10.3791/57126

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24 mars 2020

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1Department of Spinal Cord Injury and Repair, Trauma and Orthopedics Institute of Chinese PLA, 960th Hospital, Joint Logistics Support Force of PLA, 2Institute of Military Cognition and Brain Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, 3Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, Department of Neurological Surgery and Goodman Campbell Brain and Spine, Indiana University School of Medicine, 4Program in Medical Neuroscience, Paul and Carole Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University School of Medicine, 5Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital, Shandong University, 6Beijing Computing Center, Beijing Academy of Science and Technology

Dans cet article

Résumé

Ici nous décrivons des procédures chirurgicales pour produire une hémisection latérale fiable de moelle épinière (HX) au niveau thoracique de 9e dans les rats adultes et évaluations neurocomportementales conçues pour détecter des déficits asymétriques après une telle blessure unilatérale.

Résumé

Les lésions incomplètes de moelle épinière (SCI) mènent souvent à des affaiblissements des fonctions sensorimotor et sont médicalement le type le plus fréquent de SCI. Le syndrome humain de Brown-Séquard est un type commun de SCI incomplet provoqué par une lésion à la moitié de la moelle épinière qui a comme conséquence la paralysie et la perte de proprioception sur le même côté (ou ipsilesional) que la blessure, et la perte de douleur et de sensation de température sur le côté opposé (ou contralesional). Des méthodologies adéquates pour produire une hémisection latérale de moelle épinière (HX) et évaluer des affaiblissements neurologiques sont essentielles pour établir un modèle animal fiable du syndrome de Brown-Séquard. Bien que le modèle d’hémisection latérale joue un rôle central dans la recherche fondamentale et translationnelle, les protocoles normalisés pour créer une telle hémisection et évaluer la fonction unilatéralisée font défaut. Le but de cette étude est de décrire les procédures étape par étape pour produire un HX latéral spinal de rat au niveau9e thoracique (T9) vertébral. Nous décrivons donc une échelle de comportement combinée pour HX (CBS-HX) qui fournit une évaluation simple et sensible des performances neurologiques asymétriques pour SCI unilatérale. Le CBS-HX, allant de 0 à 18, est composé de 4 évaluations individuelles qui comprennent le pas de l’arrière unilatéral (UHS), le couplage, le placement de contact et la marche sur la grille. Pour CBS-HX, les arrière-lignes ipsilateral et contralatérales sont évaluées séparément. Nous avons constaté que, après un T9 HX, le rétrolimb ipsilateral a montré la fonction altérée de comportement tandis que l’arrière contralatéral a montré la récupération substantielle. Le CBS-HX a effectivement discriminé les fonctions comportementales entre les arrière-derniers ipsilateral et contralatéral et la progression temporelle détectée de la récupération de l’arrière-train ipsilateral. Les composants CBS-HX peuvent être analysés séparément ou en combinaison avec d’autres mesures au besoin. Bien que nous ayons seulement fourni des descriptions visuelles des procédures chirurgicales et des évaluations comportementales d’un HX thoracique, le principe peut être appliqué à d’autres SCIs incomplètes et à d’autres niveaux de la blessure.

Introduction

Les lésions incomplètes de la moelle épinière (SCI) conduisent souvent à des déficiences graves et persistantes des fonctions sensorimotrices et sont cliniquement le type le plus fréquent de SCI1. Le syndrome de Brown-Séquard chez l’homme est causé par une lésion à la moitié de la moelle épinière qui entraîne la paralysie et la perte de proprioception sur le même côté (ou ipsilesional) que la blessure, et la perte de la douleur et la sensation de température sur le côté opposé (ou contralesional)2,3,4. Les modèles animaux d’hémisection latérale spinale sont employés largement pour imiter le syndrome humain de Brown-Séquard et ils ont été rapportés chez les rats5,6,7,87,9,opossums10, et singes7,11,12,13 par divers laboratoires à divers niveaux spinals. Cependant, les procédures visualisées détaillées pour produire une hémisection latérale standard n’ont pas été décrites. Fournir des procédures étape par étape pour une hémisection latérale devrait optimiser le modèle et faciliter la comparaison ou la réplication des résultats expérimentaux dans la recherche fondamentale et translationnelle.

Une SCI unilatérale produit des déficits de comportement asymétriques et disproportionnés qui sont difficiles à mesurer à l’aide d’évaluations conventionnelles pour les blessures symétriques. Une méthodologie adéquate pour évaluer les déficiences neurologiques pour une SCI unilatérale est un élément essentiel de l’élaboration d’un modèle unilatéral SCI. Malgré le rôle central d’une lésion unilatérale de la colonne vertébrale, les protocoles normalisés pour évaluer les déficits sensorimoteurs chez les animaux atteints d’une telle blessure font défaut. L’échelle d’évaluation locomotrice Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) a été la mesure la plus fréquemment utilisée de la fonction après SCI pour les rats adultes 14 qui donne une description semi-quantitative de la locomotion dans son ensemble. Cependant, il ne mesure pas chaque arrière-train de façon indépendante.

Dans cette étude, nous rapportons des procédures étape par étape pour produire un HX spinal de rongeur au niveau de 9e thoracic (T9) vertébral. Nous introduisons également une échelle de comportement combinée pour l’hémisection (CBS-HX) qui inclut le pas de l’arrière unilatéral (UHS), le couplage, le placement du contact, et les évaluations de marche de grille pour évaluer des affaiblissements neurologiques et la récupération après une SCI unilatérale. Nous espérons que ce modèle sera un modèle utile pour examiner les mécanismes de blessures et les efficacités thérapeutiques pour les SCIs unilatérales.

Protocole

Toutes les procédures chirurgicales et de manipulation des animaux ont été effectuées sous l’approbation du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council) et des Lignes directrices de l’École de médecine des animaux institutionnels de l’Université de l’Indiana Comité.

1. Considération générale

  1. Utilisez des rats femelles adultes Sprague-Dawley (SD) (pesant 200 g, n-12) pour cette étude. Habituez les animaux à tous les environnements d’essai et collectez des données de base pour tous les tests de comportement une semaine avant la procédure chirurgicale.
  2. Effectuez les évaluations comportementales par deux observateurs qui sont aveuglés par les groupes expérimentaux.

2. Préparation des animaux

  1. Nettoyer la table chirurgicale avec 70% d’éthanol. Déposer un coussin chauffant pré-réchauffé sur la table chirurgicale. Couvrez la zone chirurgicale avec un drapé chirurgical stérile. Placez la gaze stérile, les cotons-tiges et les outils chirurgicaux autoclavés à la surface du drapé chirurgical.
  2. Activer un stérilisateur de microbilles pour la stérilisation interchirurgie des outils chirurgicaux.
    REMARQUE : Un exemple des outils utilisés dans cette expérience est montré dans la figure 1.
  3. Anesthésiez le rat avec une injection intraperitoneal (c.-à-d.) de kétamine (87,7 mg/kg) et de xylazine (12,3 mg/kg). Assurez-vous que le bon plan d’anesthésie est atteint par aucune réponse au stimulus de pincement d’orteil. Appliquer la pommade vétérinaire sur les yeux de l’animal pour prévenir le séchage cornéen pendant la chirurgie.
  4. Enlever les cheveux en trop les vertèbres thoraciques en rasant(figure 2A). Retirer la fourrure rasée avec un aspirateur équipé d’un filtre HEPA.
  5. Nettoyez la zone chirurgicale avec trois gommages alternés de gommage à base d’iode et d’éthanol.
  6. Couvrir l’animal d’un drapé stérile avec une fenestration sur le site d’incision proposé(figure 2B). Note; En vidéo, le drapé chirurgical a été omis à des fins de démonstration.

3. Hémisection spinale

  1. Touchez la 13e côte qui est la côte la plus basse du rat et une côte flottante qui ne se connecte pas au sternum. Suivez la 13e côte dorsale pour identifier son lien avec la vertèbre T13, puis comptez pour identifier la vertèbre T10.
  2. Utilisez une lame de scalpel (#15, figure 1) pour effectuer une incision de 3 à 4 cm de la peau de milieu de ligne sur le dos sur le dos en suralportant les processus spinuxvertébrales 8-11.
  3. Sous un microscope chirurgical, disséquez et séparez latéralement les muscles paraspinaux des processus spinous vers les facettes des vertèbres T9 et T10 des deux côtés à l’aide de la même lame de scalpel.
    REMARQUE : Cette approche taquinera bien le tissu séparé sans causer d’hémorragie.
  4. Stabiliser la colonne vertébrale à l’aide d’un support de stabilisation modifié. Faire une fente des deux côtés de l’os vertébral latéral. Faites glisser les bras en acier inoxydable sous les facettes transversales exposées et serrez les vis pour assurer la stabilité.
  5. Utilisez un rétracteur pour retirer les muscles de la zone chirurgicale (figure 2B) et pour exposer le laminae vertébrale T8-11 et les processus épineux(figure 2C).
    REMARQUE : Il y a un grand écart entre les processus spinux T8 et T9, qui sont des repères pour l’identification de T9(figure 2C, vue dorsale). Du point de vue latéral, le processus épineux des points de vertèbre T9 caudally, les points de processus spinous T10 dorsally, et le processus spinous T11 points rostrally ; ainsi, les 3 processus spinous forment une pyramide et le processus épineux T10 forme le pic(figure 2D, vue latérale).
  6. Effectuer une laminectomie dorsale sur la vertèbre T9 à l’aide d’un rongeur. Éloignez le processus épineux T9 et retirez une petite partie du lamina gauche à la ligne médiane(figure 3A, ligne pointillée), et toute la partie droite de la lamina aussi latéralement que possible(figure 3A, ligne pointillée). Pour la laminectomy, insérer le rongeur doucement sous la lamina et couper un petit morceau d’os à la fois jusqu’à ce qu’une région désirée de laminectomie soit terminée(figure 3B et figure 3C).
  7. Sous un microscope chirurgical, identifier la ligne médiane dorsale de la moelle épinière(figure 3C). Insérez une aiguille (30 G) verticalement à travers la ligne médiane dans la moelle épinière avec le côté biseauté face au côté droit(figure 4A).
    REMARQUE : L’aiguille doit pénétrer toute la moelle épinière pour atteindre la paroi ventrale du canal vertébral.
  8. Arrêtez tout saignement avec un petit morceau de gelfoam stérile.
  9. Insérez un bout d’une iridectomie/ciseaux microchirurgicaux à travers la trajectoire de l’aiguille de la ligne médiane, et l’autre pointe le long de la surface latérale de l’hémi-corde droite, puis faites une coupe complète sur le hémi-corde droite avec les ciseaux(figure 4B).
    REMARQUE : Utilisez un micro-ciseaux pointu pour la coupe de moelle épinière pour minimiser la lésion de compression à la moelle épinière pendant la coupe.
  10. Utilisez le bord latéral de la même aiguille qu’un couteau pour couper à travers l’espace de lésion pour confirmer une hémisection droite complète. Vérifier l’exhaustivité de l’hémisection droite en visualisant le fond du canal vertébral avec le microscope chirurgical(figure 4C, vue transversale; Figure 4D, vue latérale; Figure 4E, vue dorsale).
  11. Placez un petit morceau d’éponge gélatine sur le site de lésion(figure 4F). Utilisez le mélange de ciment et construisez un pont étroit sur l’éponge et les processus épineux de T8 et T10(figure 4G, H).
    REMARQUE : Le but de l’utilisation d’un pont de ciment est double : 1) il sépare la cicatrice développée au site de blessure du reste du tissu, et 2) il facilite la dissection du segment de la moelle épinière après le sacrifice animal.
  12. Suture le muscle et les couches de peau séparément avec 4-0 fil de soie.
  13. Injecter 0,9 % de saline stérile sous-cutanée pour maintenir l’hydratation. Injecter un agent analgésique Buprénorphine (0,05-2,0 mg/kg S) 8-12 h/jour sous-cutanée pendant 2 jours. Appuyez sur la vessie urinaire 2-3 fois par jour pendant la première semaine et 1-2 fois dans les semaines suivantes jusqu’à ce que la vessie spontanée annulant des retours.

4. Soins postopératoires pour animaux

  1. Remettre l’animal dans sa cage à domicile à un seul foyer. Fournir du chow ou du gel de rongeur humide au fond de la cage pour aider à la capacité de l’animal à manger ou à hydrater. Placez un coussin chauffant sous la cage pendant la récupération post-chirurgicale. Assurez-vous que le coussin chauffant ne couvre que la moitié du fond de la cage pour éviter la surchauffe.
  2. Injecter 0,9 % de saline stérile sous-cutanée pour maintenir l’hydratation. Injecter un agent analgésique Buprénorphine (0,05-2,0 mg/kg S) 8-12 h/jour sous-cutanée pendant 2 jours. Appuyez sur la vessie urinaire 2-3 fois par jour pendant la première semaine et 1-2 fois dans les semaines suivantes jusqu’à ce que la vessie spontanée annulant des retours.

5. Évaluer le pas d’hémisection unilatérale (UHS)

REMARQUE : Le test unilatéral de marche d’hémisection (UHS) est une mesure directe de la capacité des animaux de SCI à utiliser leur arrière-cour ipsilesional dans le champ ouvert. Comme mentionné dans 1.1, les animaux ont été acclimatés à un environnement de champ ouvert (diamètre 42 pouces) 15 deux fois par jour pendant 7 jours. Deux observateurs aveuglés par les groupes d’animaux effectuent le test. Le score de l’UHS à la fois à la ligne de base (7 jours avant le T9 HX) et les points de temps après une blessure seront recueillis. Les étapes d’évaluation sont décrites comme suivies.

  1. Placez l’animal dans un environnement de champ ouvert et examinez la locomotion de l’animal pendant 4 min.
    REMARQUE : Pendant les essais, on peut encourager l’animal à se déplacer activement.
  2. Avec le formulaire fourni dans le tableau 1, attribuer une valeur de 1 pour Oui et 0 pour le Non pour chaque catégorie de comportement, puis résumer la valeur totale pour donner un score UHS final de 0 à 8.
    REMARQUE : Selon le tableau 1 0 : aucun mouvement observable de l’arrière-pays; 1 à 4 : mouvements isolés de 3 articulations postérieures (hanche, genou et cheville); 5: balayage sans support de poids; 6: placer sans support de poids; 7: placer avec le support de poids; et 8: marcher avec le soutien du poids.
  3. Recueillir des scores UHS à la fois de base (7 jours avant le T9 HX) et des points de temps après une blessure.
    REMARQUE : Les scores seront évalués à divers moments après le T9 HX.

6. Couplage

  1. Analyser le CPL (couplage de la démarche) avec une vidéo d’enregistrement d’un animal marchant sur un dispositif de piste étroit ou un simple champ ouvert.
  2. Dans la section couplage du tableau 1, attribuez une note de 0 pour « Non », 1 pour « Irrégulier/maladroit » et 2 pour « Normal » pour chaque catégorie CPL.
    REMARQUE : Le test de couplage (CPL) vise à évaluer la coordination des mouvements alternés de membres, y compris le CPL homologue (membres avant/arrière-arrière, figure 5A), CPL diagonal (avant gauche-arrière droite ou avant droite-arrière gauche gauche, figure 5B), et CPL homolatéral (membres avant-arrière sur le même côté, figure 5C). À la suite d’un T9 HX, les déficits de l’arrière-plan du côté ipsilesional deviennent visibles, ce qui entraîne l’alternance de l’homologue CPL(figure 5D),de la CPL diagonale(figure 5E) et du CPL homolatéral(figure 5F).

7. Contact Placement

REMARQUE : Le test de placement de contact de l’arrière-cour est employé pour évaluer l’intégration motrice des réponses de l’arrièrelimb aux stimulus proprioceptifs 16. La proprioception est considérée comme intacte si l’animal monte avec son arrière-train sur la surface après que l’arrière-cour est tiré vers le bas sous la surface.

  1. Maintenez l’animal en position verticale afin que les deux arrière-lignes soient disponibles pour la réponse de placement.
  2. Badigeonner légèrement la surface dorsale d’un arrière-train vers le bord d’une surface (p. ex., banc de travail animal).
  3. Observez le placement du pied sur la surface et attribuez un score de placement de contact arrière. 0: pas de placement; 1: placement.
    REMARQUE : La surface dorsale reçoit une stimulation et le pied s’étendra et placera le pied à la surface si le réflexe est intact. Le formulaire d’évaluation est également dans le tableau 1.

8. Marche de grille

REMARQUE : L’essai de marche de grille évalue les déficits moteurs spontanés et les mouvements de membre impliqués dans le pas précis, la coordination, et le placement précis de patte.

  1. Placez un rat sur une grille en maille en plastique surélevée (36 à 38 cm avec ouvertures de 3 cm2) et laissez-le marcher librement à travers la plate-forme pendant 30 marches.
  2. Comptez le nombre total de pas et le nombre de faux pas pour chaque membre. Des enregistrements vidéo sont faits pour confirmer le comptage.
    REMARQUE : Deux observateurs aveuglés évaluent le placement des pattes des membres antérieurs et des pattes postérieures pendant que les animaux marchent.
  3. Attribuer les scores de marche de grille pour chaque arrière-cour comme suit - 0 : faux pas plus de 15; 1: faux pas moins ou égal à 15; 2: faux pas moins ou égal à 10; et 3 : faux pas moins ou égal à 5.
    REMARQUE : L’évaluation de la notation est basée sur le tableau 1. Les scores de coupures sont utilisés comme mesures de la gravité des déficits moteurs.

9. Perfusion et traitement des tissus

  1. Après une anesthésie appropriée similaire à l’étape 2.3, perfusez soigneusement les animaux en suivant le protocole de perfusion transcardiale 17.
  2. Disséquer et prélever les échantillons de moelle épinière et les corriger à 4% de PFA pendant la nuit.
  3. Les échantillons peuvent ensuite être transférés à 30% de solution de saccharose.
  4. Couper la moelle épinière en sections transversales et tacher les sections sélectionnées avec un marqueur d’axone SMI-31 et marqueur astrocytique protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) selon les procédures standard18.

Résultats

Les procédures chirurgicales décrites ci-dessus permettent la production d’un HX latéral cohérent et reproductible au T9. Après la perfusion et l’ablation de la peau, le site chirurgical de T9 pourrait être facilement identifié par une suture résiduelle(figure 6A). Une dissection supplémentaire permet l’exposition du pont de ciment(figure 6B) et de l’éponge gélatine(figure 6C) en couches. La moelle épinière est ensuite exposée au canal vertébral ouvert et une hemisection latérale sur le côté droit est confirmée (figure 4D). Le niveau de la blessure peut être confirmé par son association avec les corps vertébraux exposés et les côtes(figure 6D). La coloration d’immunofluorescence d’une section transversale à l’épicentre de blessure montre une perte complète de l’hémicord droit et la préservation du contralatéral d’hémicord gauche à la blessure. La section tachée d’un marqueur d’axone SMI-31 et d’une protéine acide fibrillaire phylaire astrocytique (GFAP)(figure 6E).

Neurobehaviorally, le système CBS-HX est capable de détecter les déficits asymétriques au fil du temps suivant un T9 HX. Après HX, l’arrière-train ipsilateral a perdu sa capacité à marcher tandis que l’arrière contralatéral a conservé la capacité de marcher. Pour chaque mesure de comportement, nous avons effectué 3 essais et utilisé la moyenne des 3 essais pour la quantification et l’analyse. Nous avons utilisé la mesure pré-chirurgicale comme base de référence que nous considérons comme le contrôle le plus précis par rapport à l’utilisation d’autres rats. Les scores des 4 mesures individuelles, c’est-à-dire UHS, CPL, placement de contact et marche de grille peuvent être analysés séparément(figure 7A-D) ou ils peuvent être combinés dans un CBS-HX composite(figure 7E). Les analyses bidirectionnelles d’ANOVA ont montré des différences significatives dans LE S UHS (F - 23.199, p 'lt; 0.001), couplage (F '8.376, p 'lt; 0,01), placement de contact (F - 17.672, p 'lt; 0.001), grille de marche (F '19.261, p 'lt; 0.001), CBS-HX (F '20.897, p 'lt; 0.001) entre les côtés ipsilateral et contraral. Figure 7A montre les résultats de UHS après un T9 HX. Dans les 3 premiers jours après le suivi, les rats ont perdu la capacité d’étape et ont reçu un score de 0-2 pour l’arrière-limite ipsilesional. Des mouvements en-tête ont commencé à apparaître du côté ipsilesional à 7-10 jours après une blessure, la plupart des étapes étant des étapes dorsales. D’ici 28 jours après le T9 HX, les rats pouvaient prendre des mesures plantaires avec une coordination pratiquement normale avec un score UHS attribué de 8. À titre de comparaison, l’arrière-forme contralesionale a été moins interrompue et le score de l’UHS a chuté dans les 5 premiers jours après le T9 HX et est revenu au niveau de base après le jour 10 après la blessure. Pour l’ensemble du test de CPL (y compris le couplage homoatéral, homologue et diagonal), la stabilité et l’adaptabilité de la coordination après la réduction marquée de T9 HX(figure 7B). À 1-5 jours après une blessure, les animaux HX n’ont montré aucun signe de CPL. Au fil du temps, le CPL de l’arrière-pays ipsilateral est apparu, souvent maladroit, instable et variant de façon inappropriée dans leur vitesse, leur force et leur direction. Le placement de contact(figure 7C) et la marche en grille(figure 7D) de l’arrière-forme ipsilateral ont également été affectés par le T9 HX en particulier dans les 5 premiers jours après la blessure, et se sont généralement rétablis lorsque l’animal a commencé à prendre des mesures plantaires. Le système composite CBS-HX comprend l’UHS, le CPL, le placement de contact et les tests de marche de grille pour un score maximal possible de 18(figure 7E). La fonction motrice des arrière-derniers ipsilateral a démontré une diminution des scores de CBS-HX après le HX latéral de T9, qui est compatible avec les déficits vus dans le syndrome humain de Brown-Séquard. La fonction motrice des arrière-derniers ipsilateral a démontré une diminution des scores DE CBS-HX de 1 jour à 4 semaines après le HX latéral T9 par rapport aux arrière-derniers contralatéraux(figure 7E).

Ainsi, le système composite CBS-HX combinant le UHS, CPL, le placement de contact, et la marche de grille peut être employé pour évaluer la fonction comportementale des rats après la blessure latérale de la moelle épinière thoracique pour un score maximum possible de 18.

Disposition des instruments chirurgicaux : scalpel, hémostat, ciseaux, écarteurs ; à des fins éducatives.
Figure 1. Outils chirurgicaux utilisés pour la production d’une hémisection À droite T9. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Configuration de la chirurgie de la colonne vertébrale du rat ; vue disséquée ; lésion de la moelle épinière niveau T8-T11 ; schéma anatomique.
Figure 2. Chirurgie exposure. A) Raser les cheveux sur le dos en sursemanant la région chirurgicale. B) Rétractez les muscles de la zone chirurgicale à l’aide d’un rétracteur. C) Exposez la laminae vertébrale T8-11 et définissez les processus spinous individuels (flèches). Notez qu’il existe un grand écart entre les processus spinous T8 et T9, ce qui est un point de repère pour l’identification T9. D) Le dessin schématique montre la vue latérale des processus épineux. Les processus spinous T9-11 forment une pyramide avec le processus épineux T10 étant le sommet. Encore une fois, un grand écart entre les processus spinous T8 et T9 est clairement considéré comme un point de repère pour identifier T9 où une laminectomie est effectuée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Schéma de laminectomie des vertèbres T9 et image post-opératoire montrant l’exposition de la moelle épinière.
Figure 3. Laminectomy et exposition de l’hémicord droit. A) Le dessin schématique montre la section transversale de la moelle épinière dans la vertèbre T9. La ligne pointillée indique l’étendue de la laminectomie de chaque côté. B) Le dessin schématique montre l’enlèvement d’une petite partie de la lamina sur le côté gauche et l’arc vertébral entier sur le côté droit. Une flèche indique la ligne médiane dorsale du cordon. C) Vue dorsal de la moelle épinière exposée. Notez que la veine dorsale a été localisée au milieu de la moelle épinière divisant les hémicords gauche et droit. Le bon hémicord a été complètement exposé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Processus d’hémisection de la moelle épinière T9 ; Le schéma et les images montrent l’utilisation d’une aiguille, d’une éponge de gélatine, d’un ciment.
Figure 4. Hemisection latérale. A-D) Les dessins schématiques montrent l’insertion d’aiguille de milieu de ligne dans la moelle épinière (A), l’hémisection T9 (B), le revêtement de l’éponge et du ciment de gélatine (C), et la vue latérale d’une hémisection latérale T9 (D). Les lignes pointillées en C décrivent la lamina vertébrale T9 enlevée et le hémicord droit. E) Vue dorsal d’une hemisection droite de moelle épinière. F) Placement d’un petit morceau d’éponge gélatine sur le site d’hémisection. G-H) Un pont en ciment Simplex-P construit sur l’éponge et les processus épineux de T8 et T10. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Schéma de couplage neuronal ; homologue, diagonale, homolatérale ; normale, hémisection ; Voies du SNC.
Figure 5. Dessin schématique du test de couplage (CPL). test. Le test CPL est d’évaluer la coordination des mouvements alternés des membres, y compris A) homologue CPL (avant-avant / membres arrière-arrière), B) CPL diagonale (avant gauche-arrière droite / avant à droite-arrière gauche membres gauches), et C) CPL homolatéral (membres avant-arrière sur le même côté). Après T9 HX (boîte rouge, D-F), le déficit de l’arrière-forme est devenu visible sur le côté ipsilesional et les animaux montrent un manque de coordination dans l’homolog (D), diagonale (E), et homolatéral (F) CPL. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Stades de dissection de la moelle épinière, schéma étiqueté, immunomarquage GFAP/SMI31, analyse microscopique.
Figure 6. Dissection tissulaire et histologie. Après perfusion, les tissus ont été disséqués pour exposer la moelle épinière. Des sections transversales ont été traitées pour la coloration immunofluorescente double de protéine acide fibrillaire gliales (GFAP, un marqueur pour les astrocytes) et SMI31 (un marqueur pour les axones). A) Exposition de la suture comme point de repère pour le site de blessures (flèche jaune). B) Exposition du ciment dentaire (flèche jaune). C) Exposition de l’éponge gélatine (flèche jaune). D) Identifier l’hémisection spinale sur le côté droit (flèche jaune). E) Une section transversale de la moelle épinière à l’épicentre de blessure immunostained avec GFAP (vert) et SMI 31 (rouge). Il montre que l’hémicord spinal droit a été complètement coupé et l’hémicord gauche a été bien conservé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Graphiques de score comportemental après hémisection vertébrale ; controlatérale vs ipsilatérale ; récupération sur plusieurs jours.
Figure 7. Résultats des scores neurocomportementaux. Les graphiques montrent des scores des 5 mesures : A, le score unilatéral d’hémisection (UHS); B, couplage (CPL); C, placement de contact; D, grille de marche, et E, score de comportement combiné (CBS) sur les arrière-bes ipsilateral et contralatéral après un T9 HX. Les données représentent la moyenne de s.e.m. : p 'lt; 0.05, ': p 'lt; 0.01, ': p 'lt; 0.001 entre les arrières ipsilateral et contralatéral (ANOVA à double sens, test de comparaisons multiples de Tukey, n ' 12 rats/groupes). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Nom/Gamme SubscoreDescriptionScore
Marche unilatérale de l’arrière-trainMouvement arrière léger observablenon0
(UHS)Oui1
(0-8)Mouvement de la chevillenon0
Oui1
Mouvement du genounon0
Oui1
Mouvement de la hanchenon0
Oui1
Balayage (pas de support de poids)non0
Oui1
Placement (pas de support de poids)non0
Oui1
Placement (avec support de poids)non0
Oui1
Marchernon0
Oui1
CouplageHomolatéralnon0
(0-6)Irrégulier/maladroit1
Normal2
Homologuesnon0
Irrégulier/maladroit1
Normal2
Diagonalenon0
Irrégulier/maladroit1
Normal2
Placement de contactnon0
(0-1)Oui1
Marche de grilleMiss étapes15 ans0
(0-3)15 euros1
10 euros2
5 euros3
Total CBS-HX
(0-18)

Tableau 1 : Les scores de comportement combinés pour l’hémisection (CBS-HX)

Discussion

Dans cette étude, nous rapportons des procédures étape par étape pour produire un HX spinal T9 simple, cohérent et reproductible chez les rats adultes qui imite le syndrome de Brown-Séquard chez l’homme. Nous introduisons également un système combiné de score de comportement pour l’hémisection (CBS-HX) qui est sensible pour évaluer l’affaiblissement neurologique asymétrique et la progression de la récupération, mesurée par une combinaison de passation unilatérale de l’arrièrelimb (UHS), couplage (CPL), placer le contact et la marche de grille. Bien que nous manifestions la blessure au niveau de T9, cette procédure peut être appliquée à d’autres régions de la moelle épinière comprenant les moelles cervicales et lombaires d’une manière simple et peu exigeante. Nous espérons que ce modèle, ainsi que des évaluations comportementales unilatérales, seront utiles pour examiner les mécanismes de blessures et les efficacités thérapeutiques pour de tels types de SCI.

Puisque le modèle latéral HX ne diminue que la moitié ipsilateral du cordon, le côté contralatéral du cordon est largement préservé et peut être utilisé comme un contrôle interne. Beaucoup de voies descendantes et ascendantes sont projetées unilatéralement et une hemisection latérale dans de nombreuses circonstances cause des dommages à une région axonale d’un côté et préserve le même tract sur le côté opposé, permettant la comparaison de la réorganisation et conséquences fonctionnelles de ces tracts chez le même animal. En outre, la production d’une lésion plus localisée peut permettre le ciblage de voies spécifiques. Par exemple, une lésion ventrale et ventrolaterale peut affecter les voies réticulospinal et vestibulospinal. Une lésion dorsale ou dorsale peut affecter les voies corticospinal et rubrospinal. Le modèle d’hémisection ou de blessure partielle peut également être employé pour étudier l’anatomie et la fonction d’autres voies, telles que les voies propriospinal, norarénergic ou sérotonergic. Ainsi, le modèle d’hémisection peut être employé de façon unique pour étudier la compensation par les afferents sensoriels, par les voies descendantes, et par les circuits intrinsèques de la colonne vertébrale. Ce modèle est également approprié pour étudier des mécanismes de récupération locomotrice après HX.

Le HX latéral conduit à des déficiences comportementales évidentes, qui sont évaluables dans les tâches motrices (par exemple, Treadscan ou Tapis roulant) paradigme pour l’analyse automatisée de la démarche 19. En outre, la conductivité des voies axonales sur le côté contralatéral à la lésion pourrait être mesurée à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques, et cette évaluation fournit la possibilité d’établir une réorganisation fonctionnelle après divers traitements. En outre, les injections unilatérales des traceurs anatomiques dans les neurones d’une voie particulière permettent la visualisation des fibres de croisement de ligne intermédiaire antélimé étiquetées et leur connexion avec les neurones étiquetés rétrograde20,21,22,23,24,25.

Bien qu’une chirurgie HX spinale typique prend moins de 20 minutes pour terminer, il faut une certaine pratique pour atteindre un HX précis et cohérent. Tout d’abord, il est important que le niveau de HX spinal soit cohérent d’un animal à l’autre. Par conséquent, il est essentiel que le segment vertébral approprié pour le laminectomy soit identifié. Deuxièmement, assurez-vous que le HX est terminé. Pour faire un HX complet, on peut utiliser une aiguille de calibre 30 insérée verticalement à travers la ligne médiane pour guider la coupe à l’aide de microsciseurs. L’insertion d’aiguille évite également des dommages aux vaisseaux spinals postérieurs ou à la moelle au-dessus de la lésion. La deuxième fonction de l’aiguille de calibre 30 est qu’elle peut servir de couteau pour tracer la coupe pour s’assurer qu’il n’y a aucune ambiguïté de la lésion. Troisièmement, placer la gélatine sur le site de lésion peut minimiser la fuite de liquide céphalo-rachidien, et placer le ciment sur le dessus de la gélatine et combler le lamina vertébral peut renforcer la stabilité des vertèbres vertébrales au site de lésion et faciliter la cicatrisation des plaies. Pour éviter l’interférence du signal avec l’application d’enregistrements électrophysiologiques, les muscles, le fascia et la peau doivent être suturés en couches avec 4-0 fil de soie. Enfin, tous les efforts doivent être faits pour minimiser les dommages à la moelle épinière contralatérale. Une vérification histologique devrait être établie pour confirmer une hémisection latérale complète d’un côté et la préservation de l’autre moitié du cordon de l’autre côté (comme le montre la figure 6E).

Pour améliorer la locomotion après SCI, des études antérieures ont utilisé un large éventail de stratégies, y compris la transplantation cellulaire, la régénération d’axone 8,18,26,27, et la réhabilitation basée sur l’activité 28,29,30. Pendant ce temps, plusieurs tests comportementaux ont été établis pour l’évaluation fonctionnelle et pour dépister les meilleurs traitements suivant SCI. L’échelle d’évaluation locomotrice BBB a été conçue pour l’évaluation locomotrice des blessures symétriques spinales telles qu’une contusion de mi-ligne ou des dommages transection qui affectent les hindlimbs bilatéraux 14,31. Certains paramètres de BBB, tels que la coordination et le dégagement des orteils, sont enregistrés en observant les deux arrière-ci. Si un arrière-plan est intact et que l’autre montre des déficits comme on le voit dans les blessures asymétriques, alors l’arrière-forme intacte confondra le score de l’arrière-forme affectée. Étant donné que la notation BBB ne tient pas compte d’un score postérieur de l’autre après la blessure unilatérale, il n’est pas idéal pour évaluer les blessures unilatérales de la moelle épinière. Toutefois, si le mouvement articulaire et le soutien du poids de chaque côté sont évalués séparément et ne sont pas calculés dans le cadre du BBB, alors l’arrière-forme intacte (semblable à un contrôle fictif) ne confondra pas la partition de l’arrière-forme affectée. En outre, le côté intact ne biaisera pas la note globale de l’animal, parce que l’arrière intact n’a pas de déficits dramatiques dans le mouvement articulaire, le soutien du poids, ou le pas.

Le score de comportement combiné pour l’hémisection est conçu pour être une évaluation sensible et facilement exécutée de la récupération comportementale dans le modèle de rat de l’hémisection latérale. Il peut être utilisé pour évaluer les comportements des phases précoces et tardives de récupération. La première phase est dans les 7-10 jours après le préjudice. Dans les 3-5 premiers jours post-HX, l’activité de l’arrière-courrier ipsilateral a augmenté régulièrement et devrait être évaluée plus fréquemment pour enregistrer des rétablissements spontanés ou de mouvement d’arrière-médiation de traitement. À 5-7 jours après HX, les rats ont commencé à faire des mouvements arrière-limites de balayage sans soutien de poids. Par 7-10 jours, les rats ont généralement commencé à se tenir debout et à marcher. Au cours de cette phase, l’attention portée au modèle de marche doit être accordée. À la phase tardive (14-28 jours), l’activité de l’arrière-courrier ipsilateral était stable et proche de la normale.

Une attention particulière devrait également être accordée à la capacité de couplage (CPL). Le test CPL (couplage de la démarche) peut être effectué soit avec une vidéo (p. ex., Treadscan/Catwalk) ou une vidéo de tournage lors d’un essai en plein champ. La deuxième option offre de la souplesse si les chercheurs n’ont pas accès au système d’analyse de la démarche. Pour les deux sessions d’enregistrement vidéo, un minimum de deux touchdowns consécutifs pour chaque pied est nécessaire pour ce test. Pour l’analyse, il existe trois paramètres de couplage : l’accouplement homologue, homogène et diagonal (étape 6.2). Chaque couplage implique un pied de référence et le pied donné. Prenez le couplage homologue (avant gauche-avant droite, ou arrière gauche-arrière droit) par exemple, c’est le premier temps de toucher du pied donné divisé par un temps de foulée entier du pied de référence. Étant donné que le pied gauche et droit devrait être hors phase, le couplage parfait devrait être de 0,5. C’est le même cas dans le couplage homolatéral (arrière gauche front-gauche, ou arrière droit avant-droite). Cependant, pour le couplage diagonal (arrière gauche avant-droite, ou arrière avant-gauche de droite), le couplage parfait devrait être de 0 ou 1 puisque les deux pieds devraient être en phase. Dans l’étape 6.4, nous attribuons un score pour chaque CPL de 0 à 2. Dans les détails, un score 0 doit représenter le pied donné est incapable de se déplacer pour terminer un touché, donc pas de CPL; un score 1 représente tout CPL irrégulier ou maladroit puisque le pied donné termine un touché, mais pas dans le couplage parfait; un score 2 signifie un couplage parfait de 0,5. Les trois concepts de paramètre de couplage sont bien décrits dans les publications précédentes32,33. Le CPL peut être combiné avec les évaluations du placement de contact et de la marche sur la grille. Les composants individuels du système combiné de notation de comportement seront plus ou moins efficaces dans différents modèles de rat de SCI. Pour CPL, les déficits sont devenus évidemment visibles dans le taux d’alternance et l’exhaustivité de la séquence. L’arrière proprioceptif plaçant des déficits pourrait être clairement révélé après HX unilatéral. Dans notre étude, tous les rats ont montré l’arrière-limite ipsilesional plaçant des déficits tandis que le placement contralatéral de l’arrière-cour n’a montré aucun déficit. L’essai de marche de grille devrait être considéré quand le placement de contact, qui implique le tractus corticospinal, commence à récupérer. Pour écarter tout problème de fatigue possible, la séquence de tests comportementaux pourrait être randomisée à chaque test.

En conclusion, nous rapportons des procédures étape par étape pour créer un modèle reproductible de rat in vivo du HX spinal T9 qui imite le syndrome de Brown-Séquard chez l’homme. Le système combiné de notation de comportement pour l’hémisection offre une mesure plus discriminante des résultats comportementaux arrières individuels pour évaluer des mécanismes et des traitements de blessure après une SCI unilatérale. Bien que nous fournissions seulement une description visuelle des procédures chirurgicales et des évaluations comportementales d’un HX thoracique, les méthodes décrites ici peuvent être appliquées à d’autres SCIs incomplètes à différents niveaux de blessure.

Déclarations de divulgation

Nous n’avons rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions M. Jeffrey Recchia-Rife pour son excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation du Directeur de l’Hôpital Général de la Région Militaire de Jinan de Chines PLA 2016ZD03 et 2014ZX01 (XJL et TBZ). La recherche dans le laboratoire Xu est soutenue par NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481, et Merit Review Award I01 BX0002356, I01 BX003705, IX002687 du ministère des Anciens Combattants des États-Unis.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Baby-Mixter HemostatFST13013-14Peut être n’importe quelle marque de choix
Grille en treillis métallique enduite de plastique surélevéeN’importe quel36& fois ; 38 cm avec ouvertures 3 cm2
Mousse gelMoore Medical2928Peut être n’importe quelle marque de choix.
Kit de ciment de préhension, poudre et solvantDentsply675570Peut être n’importe quelle marque de choix.
Stérilisateur de microbillesFSTNAPeut être n’importe quelle marque de choix
Pearson RongeurFST16015-17Peut être n’importe quelle marque de choix.
Écarteurs Outilschirurgicaux Jinxie6810Peut être n’importe quelle marque de choix
Poignée de scalpelFST10003-12Peut être n’importe quelle marque de choix
Ciment Simplex-PStrykerPeut être n’importe quelle marque de choix.
Analyse automatique de la marche TreadScanCleverSys IncNAPeut être n’importe quelle marque de choix

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