Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo

Résumé

Poisson zèbre servaient récemment un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de réplication ADN au cours du développement. Voici détaillées les protocoles d’utilisation des embryons de poisson-zèbre à synchronisation de réplication de profil. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier la synchronisation de la réplication en mutants, types de cellules individuelles, les modèles de maladies et d’autres espèces.

Résumé

Synchronisation de réplication de l’ADN est une caractéristique importante de cellulaire, présentant des relations significatives avec la structure de la chromatine, transcription et taux de mutation de l’ADN. Changements dans le calendrier de réplication se produisent pendant le développement et le cancer, mais la synchronisation de la réplication de rôle joue dans le développement et la maladie ne connaît pas. Poisson zèbre ont été récemment mis en place comme un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de la réplication. Voici détaillée des protocoles permettant d’utiliser le poisson-zèbre pour déterminer le calendrier de réplication de l’ADN. Après le tri des cellules d’embryons et de poisson-zèbre adulte, haute résolution génome ADN réplication calendrier modèles peuvent être construits par la détermination des changements dans le nombre de copies d’ADN grâce à l’analyse des données de séquençage de génération suivante. Le système de modèle zebrafish permet d’évaluer les modifications de calendrier de réplication qui se produire in vivo au cours du développement et peut également être utilisé pour évaluer les changements dans les types de cellules individuelles, les modèles de maladies ou lignées mutantes. Ces méthodes permettront aux études portant sur les mécanismes et les déterminants de la création de synchronisation de la réplication et l’entretien pendant le développement, la synchronisation de la réplication de rôle joue dans les mutations et tumorigenèse et les effets de perturber synchronisation de réplication sur le développement et la maladie.

Introduction

Pour les cellules de diviser avec succès, ils doivent tout d’abord exactement et fidèlement reproduire leur génome entier. Duplication du génome se produit dans un modèle reproductible, appelé l’ADN réplication calendrier programme¹. Synchronisation de réplication de l’ADN est en corrélation avec l’organisation de la chromatine, marques épigénétiques et gene expression^2,3. Changements dans calendrier de réplication se produisent au cours du développement et sont significativement liés à la transcription des programmes et modifications de la chromatine marques et organisation^4,5. En outre, synchronisation de réplication est corrélée avec des fréquences mutationnelles, et on observe des changements dans le calendrier dans divers types de cancer^6,7,8. Malgré ces observations, les mécanismes et les déterminants de la création de synchronisation de la réplication et la réglementation sont encore largement inconnus et le rôle qu’elle joue dans le développement et la maladie n’est pas déterminée. En outre, jusqu'à récemment la réplication du génome calendrier des changements qui se produisent tout au long du développement des vertébrés avait seulement été examinée en modèles de culture de cellules.

Poisson-zèbre, Danio rerio, sont bien adaptés pour étudier la réplication calendrier in vivo au cours du développement, tel qu’un seul couple peut donner des centaines d’embryons qui se développent rapidement avec nombreuses similitudes avec le développement mammifère^{9, 10}. En outre, tout au long du développement du poisson zèbre, il y a des changements pour le cycle cellulaire, organisation de la chromatine et transcriptionnelles programmes qui partagent des relations avec la réplication de l’ADN calendrier¹¹. Poisson zèbre est aussi un excellent modèle génétique, car ils se prêtent particulièrement à la manipulation par transgénèse, mutagénèse et mutations ciblées, et écrans génétiques ont identifié de nombreux gènes requis pour le développement des vertébrés¹². Par conséquent, poisson zèbre peut être utilisé pour identifier les gènes impliqués dans l’entretien et la création de synchronisation de réplication et d’observer les effets de la déréglementation "timing" réplication sur du développement des vertébrés. Les lignées transgéniques permet également d’évaluer la synchronisation de la réplication de types de cellules individuelles isolées à différents points du développement ou dans des conditions de maladie. Ce qui est important, il existe divers modèles de poisson-zèbre de maladie humaine qui peut être utilisé pour étudier le rôle de la synchronisation de la réplication en maladie la formation et la progression^9,13,14.

Récemment, les profils de synchronisation de réplication premières proviennent du poisson-zèbre, établissant comme un système modèle pour étudier la réplication calendrier in vivo¹⁵. Pour ce faire, les cellules ont été prélevés des embryons de poisson-zèbre à plusieurs étapes de développement et dans un type de cellule isolée du poisson-zèbre adulte. Les cellules ont été ensuite triés par FACS (fluorescence-lancée de cellules tri) basée sur la teneur en ADN pour isoler des populations de phase G1 et S. Utilisez l’exemple de G1 comme un contrôle de nombre de copie, copie numéros variations dans les populations de phase S ont été déterminées et utilisées pour déduire la synchronisation de réplication relative¹⁶. Changements dans calendrier de réplication peuvent être directement comparés entre les différents échantillons de perfectionnement et de types de cellules, et cela a servi à déterminer au moment de la réplication des changements qui se produisent en vivo tout au long du développement des vertébrés. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes de la génomique, surtout qu’il ne nécessite pas d’étiquetage avec les analogues de la thymidine ou immunoprécipitation d’ADN^4,6.

Voici détaillées les protocoles au point de la réplication de l’ADN profil Génome-large à haute résolution chez le poisson zèbre. Ces protocoles ont été utilisés pour déterminer les relations avec les caractéristiques génomiques et épigénétiques dans le génome du poisson-zèbre, ainsi que des changements dans ces relations qui se produisent au cours du développement de profilage. Ces protocoles sont également facilement adaptés pour étudier les changements dans le calendrier de réplication chez les souches mutantes de poisson-zèbre et dans des modèles de la maladie. En outre, ces méthodes fournissent une base qui peut être étendue à d’étudier le calendrier de réplication dans les cellules spécifiques, par un premier tri sur les types de cellules individuelles du poisson-zèbre. Le poisson-zèbre peut servir comme un excellent en vivo système modèle pour étudier la synchronisation de la réplication et de révéler au bout du compte les fonctions biologiques de ce caractère épigénétique important.

Protocole

Tous les animaux ont été traitées en stricte conformité avec les protocoles approuvés par le Comité de l’emploi et de Oklahoma Medical Research Foundation institutionnels animalier.

1. mise en place de poisson-zèbre adulte pour la reproduction

1. Utilisez une grande cohorte d’adult poisson-zèbre, mâle et femelle, d’une seule souche d’élevage. Il y a de petites différences dans la composition génétique du poisson-zèbre de même une seule souche, utilisez une grande cohorte pour s’assurer que les résultats sont représentatifs de la variabilité génétique de la population et non pas seulement à un petit sous-ensemble de la population.
2. La veille, on recueillera les embryons, placer des dizaines d’adultes reproducteurs dans les réservoirs d’élevage, utiliser des nombres approximativement égaux des mâles et des femelles. Selon l’expérience, utilisez l’une des stratégies de reproduction suivant.
   1. Reproduction de stratégie 1 : placer quelques zebrafish mâles et femelles dans les réservoirs d’élevage individuel, séparer les mâles des femelles avec un diviseur. Si cette approche est utilisée, configurer plusieurs réservoirs de reproduction différents et mettre en commun les embryons de chacun pour que la variabilité biologique soit représentatif de la population.
   2. Reproduction de stratégie 2 : combiner des dizaines de poisson-zèbre mâle et femelle dans un réservoir de grand élevage. Utilisez cette stratégie tant qu’il y a un assez grand nombre d’embryons, il est raisonnable de supposer qu’ils provenaient de divers fondateurs et sont donc génétiquement représentatif de la population.

2. timed accouplements - collecte, tri et des embryons de poisson-zèbre pour expériences de logement

1. Effectuer les accouplements chronométré, commençant dès que les cycles de la lumière étant le matin. Jeter les embryons générées pendant la nuit.
2. Permettre aux poissons de se reproduire dans des eaux peu profondes (3-5 cm) pour une période de 10 min, avec un faux fond pour les embryons de s’échapper à travers.
3. Après 10 min, recueillir des embryons en versant à travers une passoire et rincer dans une plaque de 10 cm avec une bouteille de lavage. Piscine tous les embryons prélevés au même moment, les marquer avec le temps de perception et de lieu immédiatement dans un incubateur à 28,5 ° C.
4. Des centaines d’embryons peuvent être attendus d’un seul couple dans une journée. Permettez aux adultes pour se reproduire en 10 min de cycles jusqu'à ce que le nombre d’embryons obtenus est inférieure à vingt ans.
5. Environ 1 à 1,5 h après la collecte, le tri des embryons pour éliminer les embryons morts et non fertilisés. Pour trier les embryons, retirer de l’incubateur et d’observer sous un microscope à dissection.
   1. Compter les embryons et le placer à une densité de 100 embryons par plaque de 10 cm.
   2. Ajouter un milieu frais E3 (5 mM NaCl, KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄0,17 mM) et remettez les embryons dans l’incubateur de 28,5 ° C.

3. Dechorionate, deyolk et fixer des embryons de poisson-zèbre

NOTE : Cette section du protocole est conçue pour les embryons avant 48 h après la fécondation (hpf). Il n’y a aucun besoin d’enlever les chorions des embryons à un stade ultérieur du développement (après 48 hpf), comme ils tombent souvent naturellement. Il n’y a pas besoin de deyolk ou de supprimer les chorions de poissons plus âgés les 5 jours après la fécondation (dpf).

1. Quand les embryons atteignent âge développemental désiré, vérifier le bon stade de développement morphologique sous microscope optique selon « Stades du développement embryonnaire de the Zebrafish »¹⁷.
2. Transfert jusqu'à 1500 embryons mis en scène dans un tube conique de 15 mL et laver plusieurs fois à l’E3.
   1. Ajouter 1 mL de l’E3 et 20 µL de solution de Pronase (30 mg/mL) pour chaque 100 embryons et agiter doucement. Jusqu'à 1500 embryons peuvent être déchorionés dans un tube unique avec 15 mL de l’E3.
   2. Déposer le tube sur le côté et organiser des embryons en une couche uniforme pour garantir une surface maximale de rapport volumétrique. Agiter délicatement le tube toutes les 2-3 min jusqu'à ce que tous les chorions sont tombés hors de l’embryon. Le temps total dechorionation variera selon l’activité de la Pronase.
3. Éliminer le surnageant et rincer doucement les embryons 3 fois avec 10 mL de l’E3. Placez les embryons sur glace pour le reste de cette section du protocole.
4. Enlevez l’E3 et lavez les embryons avec tampon de vitellus glacée fraîchement préparés (0,5 x de Ringer Ginzburg poisson, sans calcium : 55 mM NaCl, KCl, 1,25 mM NaHCO₃1,8 mM).
   1. Ajouter 1 mL de tampon de vitellus glacée pour jusqu'à 500 embryons.
   2. En utilisant un P1000, Pipetez doucement embryons haut et en bas 5 - 10 fois pour perturber le sac vitellin.
   3. Transférer 1 mL dans un tube de microtubes de 1,5 mL et centrifuger à 4 ° C et 500 x g pendant 5 min.
5. Supprimer des granulés surnageant et laver avec 1 mL de PBS glacée 1 x (solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,0) pour supprimer une solution de Ringer. Centrifuger à 4 ° C et 500 g pendant 5 min.
6. Soigneusement, éliminer le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 1 mL de PBS 1 x. Placer le tube sur la glace.
7. Ajouter 3 mL d’éthanol glacé (EtOH) dans un tube conique de 15 mL. Tube de Vortex d’EtOH doucement à faible intensité.
   1. En utilisant un P1000, lentement (1 goutte par seconde) goutte à goutte zebrafish embryon suspension cellulaire en EtOH tout en produisant des tourbillons doucement.
   2. Ajouter un total de 1 mL de la suspension de cellules d’embryon, une solution de fixation définitive de 75 % EtOH.
8. Après 1 mL de cellule suspension a été ajoutée, doucement tube tourbillon à mélanger et placer à-20 ° C pendant au moins 1 h. Il est recommandé de placer les tubes de leur coté pour assurer une surface maximale de rapport volumétrique et réduire le nombre d’embryons et les cellules qui se serrer les coudes. Stocker des cellules d’embryon à-20 ° C pendant 2 à 3 semaines.

4. coloration de l’ADN et FACS trier les embryons

Remarque : Cette section du protocole est conçue pour les embryons au 1 dpf.

1. Supprimer des cellules embryonnaires EtOH-correction de-20 ° C et centrifuger à 4 ° C 1500 x g pendant 5 min.
   1. Placer le tube sur la glace et soigneusement enlever le surnageant. En utilisant un P1000, resuspendre doucement les cellules dans 1 mL de froid fraîchement préparée PBS-BSA (solution 1 PBS x, 1 % d’albumine sérique bovine).
   2. Centrifuger à 4 ° C et 1500 x g pendant 5 min, les cellules et les placer sur la glace.
2. Supprimer surnageant et remettre les cellules en iodure de propidium (PI) coloration solution (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0), avec 200 µL pour chaque 1000 des embryons.
   1. Permettre aux cellules d’incubation dans une solution PI pendant 30 minutes sur la glace, en mélangeant doucement toutes les 5 min.
   2. Placez une passoire de cellule de nylon de 40 µm sur un tube conique de 50 mL sur la glace. Pipetez doucement les cellules pour homogénéiser et filtrer à travers les mailles.
      Remarque : Si plusieurs tubes des embryons de la validant même ont été recueillies à l’article 3 du protocole, combiner ces embryons à ce stade alors qu’ils sont tous triés ensemble.
   3. À l’aide de l’appartement à l’intérieur de la fin d’un piston de la seringue, perturber doucement tout autres amas de cellules sur le maillage.
   4. Rincer les cellules à travers le filtre avec 500 µL de PBS-BSA froid pour chaque 1000 embryons.
   5. Placer une maille de 40 µm sur un tube de 15 mL conique sur la glace et filtrer la suspension cellulaire du tube conique de 50 mL une seconde fois dans le tube de 15 mL.
3. À l’aide d’une cellule appropriée instrument de tri, affectez l’excitation de laser détection 561 nm et d’émission à 610/20 pour détecter l’iodure de propidium.
   1. Tube de mélange 15 mL de cellules colorées brièvement par l’agitation et le placer dans l’instrument à 4 ° C.
   2. Exécutez le taux de cellules à un débit lent, idéalement de 1,0 mL/min, afin d’obtenir un profil propre cycle cellulaire et éviter de mélanger G1 ou G2/M cellules avec le S phase population.
   3. Tout d’abord, la porte pour FSC-A x SSC-A (zone de dispersion vers l’avant par zone de dispersion latérale) pour enlever les débris (Figure 1 a).
      NOTE : Cellules des embryons peuvent être différentes tailles selon le type de scène et de la cellule. Le filtre de densité neutre (ND) peut être nécessaire entre 1.0 et 1.5 selon la taille des cellules présentes. Porte une grande surface pour recueillir la plupart des cellules et enlever les débris.
   4. Deuxième, porte pour SSC-zone (SSC-A) de la région de PI (PI-A), d’enlever les doublets de débris et de la cellule (Figure 1 b).
   5. En troisième lieu, la porte pour SSC-A, par la SSC-L (largeur) pour éliminer tout reste doublets de cellules (Figure 1).
4. Afficher les populations fermées sur un histogramme avec le nombre de cellules (comte) sur la zone d’iodure de propidium et de l’axe des ordonnées (PI-A) sur l’axe des abscisses. Pour les 24 embryons hpf, cela devrait donner un profil stéréotypé cycle cellulaire comme dans la Figure 1.
   1. Pour trier la population de phase S, attribuez la porte du côté droit du pic G1 sur le côté gauche de la crête de G2, dont seulement une quantité minimale des populations G1 et G2. Pour les 24 embryons hpf, cela comprendra généralement environ 10-15 % de la population fermée (voir Figure 1).
   2. Pour trier la population G1, attribuez la porte sur le côté gauche de la crête de G1, ne pas pour passer le haut de la crête. Ajuster la largeur de la porte G1 aussi restreinte que possible (voir Figure 1).
   3. Retour porte le G1 et les populations de phase S afin d’assurer la bonne initiale gating (Figure 1E).
5. Trier les populations phase G1 et S en tubes coniques 15 mL avec 3 mL de PBS-BSA. L’objectif serait d’obtenir entre 500 000 et 1 million ou plus de cellules triées par fraction (phase G1 et S).
6. Après que le tri est terminé, les tubes de centrifugeuse à 1500 x g et 4 ° C pendant 10 min.
   Remarque : Le petit culot sera difficile à voir, et il est important de ne pas perturber l’il, donc utiliser de préférence un rotor oscillant de seau sur un rotor à angle fixe.
7. Avec précaution, retirer le surnageant et Resuspendre le culot avec 1 mL de PBS 1 x. Transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL et centrifuger à 6 000 x g et 4 ° C pendant 5 min.
8. Avec précaution, retirer tout le liquide du tube et geler sec granulé à-20 ° C. Stocker les granulés à-20 ° C pendant 2 à 3 semaines.

5. isolement, RNase traitement et purification de l’ADN

1. Enlever le culot cellulaire de-20 ° C et le déposer sur la glace.
   1. Ajouter 400 µL de tampon de SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5 % SDS) à pellet et remettre en suspension.
   2. Ajouter la protéinase K à une concentration finale de 0,2 mg/mL et mélanger brièvement au vortex.
   3. Incuber les échantillons à 56 ° C pendant 2 h, vortex toutes les 15 min.
2. Après 2 h, effectuer l’extraction de phénol-chloroforme en ajoutant 400 µL de phénol-chloroforme (phénol : chloroforme : isoamylique Alcool 25:24:1, imprégnée de Tris, pH 8,0, EDTA 1 mM à 10 mM).
   1. Vortex pour 20 échantillon s et centrifuger à 16 000 x g pendant 5 min séparer les phases.
   2. Retirez soigneusement la phase aqueuse supérieure (400 µL) et transférez dans un tube de 1,5 mL.
3. Effectuer des précipitations EtOH en ajoutant 40 µL d’acétate de sodium 3M (pH 5,2), 2 µL de glycogène et 1 mL d’éthanol.
   1. Vortex pour bien mélanger et placer au-20 ° C durant la nuit à précipiter l’ADN. Échantillon peut également être précipité à-80 ° C ou sur la glace sèche pendant 1 h.
   2. Échantillon de centrifuger à 4 ° C et 16 000 x g pendant 30 min à l’ADN de pellet.
   3. Défausse pellet surnageant et laver avec 1 mL 70 % EtOH. Centrifuger à 4 ° C et 16 000 x g pendant 5 min.
   4. Jeter les granulés surnageant et séchage à l’air à température ambiante pendant 2-3 min.
4. Dissoudre les granulés dans 96 µL d’eau stérilisés à l’autoclave et ajouter 4 µL de la RNase A (2 mg/mL).
   1. Mélangez bien au vortex et incuber à 37 ° C pendant 1 h.
5. Effectuer l’extraction de phénol-chloroforme en ajoutant 100 µL de phénol-chloroforme et la procédure suivante en étapes 5.2.1 - 5.2.2.
6. Effectuer des précipitations EtOH en ajoutant 10 µL d’acétate de sodium 3M, 1 µL glycogène et 250 µL d’EtOH et en suivant la procédure décrite dans les étapes 5.3.1 - 5.3.5.
7. Resuspendre le culot dans 60 µL de tampon TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) et déterminer la concentration d’ADN à l’aide d’une méthode quantitative basés sur la fluorescence. Banque d’ADN à-20 ° C.
   Remarque : Il est important de quantifier l’ADN à l’aide de colorants de liaison basés sur la fluorescence de l’ADN ou d’autres moyens plus fiables que les méthodes axées sur le spectromètre UV.

6. préparation de la prochaine génération séquençage et de bibliothèques d’ADN

Remarque : Un échantillon de référence numéro G1 copie pour chaque source biologique est nécessaire pour chaque série de séquençage (c'est-à-dire WT, lignée de cellules mutantes, transgénique, etc.). Comparez tous les échantillons en phase S de la même source biologique dans le séquençage de même courir à la même référence de G1. Courir au moins deux réplicats biologiques de chaque échantillon pour assurer la cohérence entre les échantillons.

1. Diluer 1 µg d’ADN pour un volume final de 50 µL et transférez dans un tube spécialisé pour la sonication.
2. Cisaillement de l’ADN génomique pour un objectif de 250-300 bp dans une ultrasonicator ciblée, selon les spécifications du fabricant et au protocole.
3. Vérifier la qualité et la taille de l’ADN génomique cisaillée à l’aide d’une machine automatisée d’électrophorèse, selon les spécifications du fabricant et au protocole. S’assurer qu’il y a un pic important de ~ 250-300 bp pour l’ADN génomique cisaillé.
4. Préparer les bibliothèques de séquençage en utilisant un kit de préparation ADN bibliothèque avec oligos multiplex pour séquençage sur plate-forme Illumina, selon le protocole du fabricant.
5. Vérifier la qualité de la préparation de bibliothèque à l’aide de machine automatisée de l’électrophorèse, selon le protocole du fabricant. S’assurer qu’il y a un pic important de ~ 400-450 bp, et il existe des pics minimales pour apprêt dimères (bp 80-85) et dimères d’adaptateur (~ 120 bp).
6. Quantifier les bibliothèques à l’aide d’un kit de quantification de l’ADN bibliothèque de séquençage d’ADN de nouvelle génération, selon le protocole du fabricant.
7. Diluer 15 µL de bibliothèque à une concentration de 5 nM et combiner multiplexés bibliothèques comme nécessaire pour atteindre désiré unique cartographie lire comptes par exemple.
   Remarque : Le nombre de manière unique la cartographie lectures par échantillon déterminera la résolution. Utiliser aussi peu que 5 millions mappé lit pour évaluer la synchronisation de la réplication pour le génome du poisson-zèbre. Il est recommandé de commencer avec 10 millions de lectures.
8. Effectuer jumelé-fin 100 bp du génome entier séquençage des échantillons sur une nouvelle génération de plates-formes de séquençage, conformément aux instructions du fabricant.

7. analyse des données de séquençage

Remarque : Les instructions de cette section sont destinées comme lignes directrices pour l’analyse. Utiliser des méthodes supplémentaires pour l’alignement de séquençage, filtration, traitement, etc.. Cette section du protocole traitera de la méthode préférée pour analyse dans cet ouvrage. Si les autres méthodes sont utilisées, ajuster les paramètres et les fonctions en fonction de ces besoins. Les commandes ci-dessous sont entrés au Ubutnu ou Mac terminal, avec les packages appropriés installés.

1. Obtenir les versions les plus récentes du génome du poisson-zèbre (danRer10, à partir de laquelle le présent protocole a été écrit) du navigateur de génome UCSC en utilisant les commandes suivantes :
   wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
   1. Décompressez le fichier fa.gz avec la commande suivante :
      gunzip danRer10.fa.gz
   2. Aligner les données de séquençage de génome à l’aide de BWA-mem en utilisant les commandes suivantes :
      BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
2. Convertir fichier .sam vers .bam en utilisant samtools avec la commande suivante :
   samtools Découvre -ÉC input.sam > output.bam
   1. Trier les fichiers de séquençage aligné à l’aide de samtools avec la commande suivante :
      samtools Trier output.bam > output_sorted.bam
   2. Index du fichier .bam en utilisant samtools avec la commande suivante :
      samtools index output.bam
3. Mark PCR doublons avec Picard en utilisant les commandes suivantes :
   Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
   Input=Input.BAM
   Output=output.BAM
   REMOVE_DUPLICATES = false
   METRICS_FILE=output_metrics.txt
4. Générer des fichiers texte (.txt) se lit comme suit pour chaque chromosome en utilisant la commande suivante :
   car moi dans {1,25} ; faire CHROM = « chr » $i ; echo $CHROM ; samtools Découvre input.bam $CHROM | couper -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i} .txt ; fait
   Remarque : Les colonnes dans le fichier .txt qui en résultent sont drapeau, emplacement, mapQ, paire de chr, paire emplacement et taille du fragment, respectivement.
5. Lire les fichiers .txt dans Matlab (ou tout autre logiciel similaire) à l’aide de la fonction textscan.
   1. Filtrer les lectures de mappage faible qualité en définissant un seuil mapQ de 30.
   2. Supprimer des lectures avec des drapeaux pour alignement non primaire, doublons PCR ou le mappage de la paire à un chromosome différent.
   3. Filtrer les lectures avec leur paire au-delà d’un seuil de distance de 2000 bp.
   4. Évaluer les statistiques qui en résultent se lit comme suit pour déterminer le nombre de statistiques de lecture, couverture, taille de l’insert et la qualité (Figure 2).
6. Établir la couverture en lecture dans 100 windows bp fixée pour chaque échantillon en comptant le nombre de lectures à des intervalles de bp 100 sur toute la longueur de chaque chromosome.
   1. Calculer que la médiane lu comte pour toutes les fenêtres.
   2. Filtrer les régions de couverture élevée en supprimant les fenêtres supérieures à 5 écarts-types de la médiane.
7. Définir des zones pour l’analyse dans les échantillons de référence G1 en trouvant des segments le long de chaque chromosome avec 200 lectures à l’aide de fenêtres coulissantes.
   1. Déterminer la profondeur dans chaque échantillon de phase S en comptant le nombre de lectures de phase S dans les fenêtres de 200 lire nombre défini pour la référence G1 qui l’accompagne.
8. Lisser les données brutes à l’aide de la fonction csaps dans le logiciel, avec un facteur d’interpolation (p) de 10^-16.
9. Normaliser les données lissées de z-score, avec une moyenne de 0 et écart type de 1.

Résultats

À l’aide de données de calendrier de réplication publiées, les profils de synchronisation de réplication représentatifs et des mesures de contrôle de la qualité sont fournis¹⁵. Les premières étapes de transformation impliquent en alignant les données de séquençage pour le génome, calculer la longueur de lecture et les statistiques de couverture du génome et le filtrage de faible qualité, impair et les lectures en double PCR. Statistiques de lecture pour un échantil...

Discussion

Poisson zèbre fournissent un système de modèle nouveau et unique le in vivo pour étudier la synchronisation de réplication de l’ADN. Quand chronométrés croisements sont effectués comme détaillé dans le présent protocole expérimental, des milliers d’embryons peuvent être rassemblées en une seule journée pour des expériences. Ces embryons se développent de façon synchrone par précisément chronométrés et nettement caractérisées des stades de développement. Poisson zèbre peut être facilement et précisément mis en sc...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Fisher Scientific	P217-500
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
MgSO4	EMD Millipore	MMX00701
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Pronase	Sigma	10165921001	solution de protéase
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma	D1408
Éthanol (EtOH)	KOPTEC	V1016
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma	A9647-100G
Iodure de propidium (PI)	Invitrogen	P3566
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-500
EDTA	Sigma	E9844
SDS	Santa Cruz	sc-24950
Protéinase K	NEB	P8107S
Phénol :Chloroforme	Sigma	P3803-100ML
Acétate de sodium	J.T.Baker	3470
Glycogène	Ambion	AM9510
RNase A	Thermo Scientific	EN0531
Quanit-iT	Invitrogen	Q33130	Réactifs pour la quantification de l’ADN par fluorescence
Covaris AFA microTUBE	Covaris	520045	tube spécialisé pour la sonication
Sonicateur Covaris E220	Échoiseur focalisé	Covaris	E220
Agilent 4200 Tapestation	Agilent	G2991AA	machine d’électrophorèse automatisée
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582	Réactifs pour machine d’électrophorèse automatisée
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit pour Illumina	NEB Cat	#E7370L	DNA
preparation kit NEBNext Multiplex Oligos pour Illumina (Index Primers Set 1)	NEB	Cat#E7335S	multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit pour Illumina (Index Primers Set 2)	NEB	Cat#E7500S	additionnel multiplex oligos pour la bibliothèque d’ADN
Kit NEBNext Library Quant pour Illumina	NEB	E7630L	kit de quantification pour la préparation de bibliothèque
Agencourt AMPure XP perles	Beckman Coulter	A63882	perles magnétiques
Illumina HiSeq 2500	Illumina	SY&ndash ; 401&ndash ; 2501	plateforme de séquençage d’ADN de nouvelle génération
40 & micro ; m Falcon Nylon Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
VWR Boîte de Pétri jetable 100 x 25 mm	VWR	89107-632
Seringue de 6,0 mL pour Nichiryo Modèle 8100	VWR	89078-446
Tubes Posi-Click, 1,7 mL, couleur naturelle	Denville Scientific	C2170 (1001002)	Dnase/Rnase free
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Flacons de toilette	VWR	16650-022	Polyéthylène basse densité, passoire à large ouverture
	VWR	470092-440	6,9 cm, maille fine
Cuve de Corssing	Aquaneering	ZHCT100	cuve d’élevage individuelle
iSpawn	Techniplast	N/A	grande cuve d’élevage
FACSAria II	BD biosciences	N/A	machine de tri cellulaire
Steromicroscope Wild M5a	Microscope de dissection	Wild Heerbrugg	N/A
Fluorimètre Qubit 3 Thermo	Scientific	Q33216	méthode quantitative basée sur la fluorescence pour déterminer la concentration d’ADN
Matlab	Mathworks	version 2017a
Matlab Statistics Toolbox	Mathworks	version 11.1
Matlab Curve Fitting Toolbox	Mathworks	version 3.5.5