Article de méthode

Agrégation de récepteur de Surface cellulaire microscopie confocale révèle par spectroscopie de corrélation d’Image

DOI :

10.3791/57164

⸱

2 août 2018

 ,  ,  , 
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anticorps qui se fixent à des récepteurs sur la surface de la cellule cible peuvent conférer conformation et altérations clusters. Ces changements dynamiques ont des implications pour caractériser le développement des médicaments dans les cellules cibles. Ce protocole utilise la microscopie confocale et spectroscopie de corrélation d’image par le biais de ImageJ/Fidji pour quantifier l’ampleur du récepteur clustering sur la surface de la cellule.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microscopie confocale fournit une méthodologie accessible pour capturer les interactions subcellulaires critiques pour la caractérisation et le développement d’agents précliniques marquées avec des sondes fluorescentes. Avec des avancées récentes en anticorps cytotoxique vecteurs, comprendre les altérations induites par ces agents dans le domaine de l’agrégation des récepteurs et l’internalisation est d’une importance cruciale. Ce protocole s’appuie sur la méthodologie bien établie de l’immunocytochimie fluorescent et la distribution de Fidji open source d’ImageJ, avec son autocorrélation intégrée et des fonctions mathématiques d’image, pour effectuer la corrélation d’images spatiales spectroscopie (ICS). Ce protocole quantitates l’intensité de fluorescence des récepteurs étiquetées en fonction de la zone de la poutre du microscope confocal. Ceci fournit une mesure quantitative de l’état d’agrégation de molécule cible sur la surface de la cellule. Cette méthodologie est axée sur la caractérisation des cellules statiques avec un potentiel d’enquêtes temporelle de l’agrégation des récepteurs. Ce protocole présente une méthodologie accessible pour fournir la quantification du regroupement des événements qui se produisent à la surface cellulaire, utilisant bien mis en place des techniques et des appareils d’imagerie non spécialisés.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement d’anticorps thérapeutiques a montré un succès remarquable dans le traitement des tumeurs multiples types1. Les progrès récents des conjugués anticorps-médicament (ADC) comme les mécanismes de prestation pour les composés cytotoxiques a élargi les conditions requises pour comprendre la dynamique des interactions entre les anticorps : récepteurs à la cellule de surface2. Après le succès de ciblage d’un anticorps dirigé contre le récepteur de surface cellulaire, ces complexes peuvent induire des patrons d’agrégation semblables à celles observées dans d’interactions ligand : anticorps3. Altérations dans l’agrégation des récepteurs peuvent induire des modifications de la membrane et le résultat dans l’internalisation du récepteur et son retrait de la surface de la cellule. Dans le contexte d’un conjugué d’anticorps-médicament, ce processus libère ensuite la charge cytotoxique dans les endosomes intériorisée et par la suite le cytoplasme, entraînant dans la mort cellulaire efficace.

Microscopie confocale a fourni un moyen efficace de visualiser ces interactions importantes des anticorps et leur cible les récepteurs4. Pour explorer les changements de l’agrégation de la molécule cible à la surface cellulaire ce protocole utilise le post-traitement des images de microscopie confocale par une image spatiale corrélation spectroscopie (ICS) technique 5,6,7 .

La Fondation de la spectroscopie de corrélation d’image est l’observation que les fluctuations d’intensité de fluorescence spatiale partagent une relation à l’état de densité et de regroupement des structures étiquetées. Cette relation est établie suivant le calcul d’une fonction d’autocorrélation spatiale d’une image capturée5.

Toutes les variantes de la spectroscopie de corrélation d’image exigent le calcul d’une autocorrélation d’image. Il est suivi en ajustant cette fonction à une courbe gaussienne bidimensionnelle pour extraire des paramètres d’État agrégation quantitative contenue dans l’image. En termes simples le calcul d’une autocorrélation d’image consiste à comparer toutes les paires possibles pixel contenu dans une image et en calculant la probabilité que les deux tout aussi aussi brillant que l’autre. C’est visualisé en fonction de la distance et directions de pixel séparation8.

Le cadre théorique pour la spectroscopie de corrélation d’image a été établi et défini par Petersen et Wiseman et coll.. 5 , 6. dans le présent protocole, les calculs de l’autocorrélation sont effectuées en Fidji/ImageJ comme une application de tableur, la base de la fonction d’autocorrélation spatiale intensité fluctuation peut être décrit comme (Eq 1):

figure-introduction-1     

où F représente la transformation de Fourier ; F−1 l’inverse de Fourier transform ; F * son conjugué complexe ; et le décalage spatial variables ε et η. Dans ICS spatiale, comme décrit dans le présent protocole, la fonction d’autocorrélation peut être calculée à l’aide d’un 2D fast Fourier transform algorithm7,9. L’autocorrélation à zéro séparation spatiale, autrement connue comme zéro lag, g11(0,0), fournit l’inverse nombre moyen de particules présentes par surface de faisceau du microscope. Il peut être obtenu en installant la fonction d’autocorrélation spatiale d’une fonction gaussienne bidimensionnelle (Eq 2):

figure-introduction-2     

Comme les pixels capturés dans une image sont contenus dans une zone définie et ces mesures ne s’étendent pas à l’infini, le terme g∞ est utilisé comme une compensation pour tenir compte des corrélations spatiales à longue distance, contenues dans l’image. Pour les agrégats moléculaires taille, ω est la fonction de point-propagation du microscope et décrite par la pleine largeur à moitié-maximum de la fonction d’autocorrélation spatiale. La zone comprise dans la fonction de point de répandre de l’instrument peut être étalonnée à l’aide de perles fluorescentes sous résolution.

Pour l’image corrélation spectroscopie protocole décrit ci-après, l’autocorrélation et fonctions mathématiques doit remplir l’ICS sont effectuées à l’aide de la plate-forme d’imagerie-traitement de l’open source, Fidji10, une distribution de la ImageJ programme11,12. Fidji/ImageJ utilise le Fourier rapide préinstallée dans la fonction FFT Math. Cette fonction permet de réduire le temps de calcul requis de ce calcul en réduisant l’éventail des données par un facteur de deux dans chaque dimension13. Comme la fonction d’autocorrélation 2D est approximativement symétrique en x, axe y, une parcelle de profil de ligne unique à travers l’image de l’autocorrélation peut être utilisée pour mesurer l’autocorrélation brute en fonction du GAL spatiale. N’importe quel bruit de zéro lag est supprimé avant le calcul plus loin, à l’amplitude résultante de l’autocorrélation (valeur de crête, g(0)T) corrigé pour le fond avec l’expression (Eq 3):

figure-introduction-3     

où j’aib est l’intensité moyenne d’une région de fond, à l’exclusion de la cellule. La densité de cluster, ou la densité des objets fluorescents, est définie par (Eq 4):

figure-introduction-4    

Dans le protocole décrit ci-après, nous avons plus simplement le calcul de la densité de cluster (CD), avec l’hypothèse fondée sur l’observation selon laquelle une fonction d’autocorrélation normalisée décroîtra à une valeur approchante 1.0 avec l’augmentation de décalage spatial. Avec un décalage spatial maximal, il y a non plus aucune corrélation de fluorescence valeurs d’intensité et donc sans une corrélation les calculs dans cette région sont calcul de la valeur d’une intensité multipliée par l’intensité qui est ensuite divisée par le la place de cette intensité, qui, par définition, est égale à 1.0. Ainsi, la densité d’une fonction d’autocorrélation normalisée cluster peut être calculée en soustrayant 1.0 de la fonction d’autocorrélation normalisée avant de prendre sa réciproque (Eq 5):

figure-introduction-5     

Étalonnage supplémentaire de la région de faisceau peut être effectuée afin de quantifier le nombre de clusters contenus dans le domaine de la fonction point de répandre de l’instrument. Cet étalonnage doit être effectué en utilisant les mêmes conditions optiques utilisées lors de l’analyse de la spectroscopie de corrélation d’image.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ensemencement des lignées de cellules adhérentes d’imagerie Experiment

  1. 10 000 cellules de carcinome épidermoïde A431 par puits pendant la nuit (O/N) à 300 µL de médias de Modified Eagle Medium/nutriments mélange F-12 (DMEM/F-12) de Dulbecco contenant 10 % de graines sérum de veau fœtal, 1 % la pénicilline-streptomycine et 1 % GlutaMAX dans un 8 chambré imaging diapositive adapté aux lentilles d’objectif haute résolution huile d’immersion (p. ex., NuncTM Lab-TekTM lamelles compartimentées).
  2. Stimuler l’agrégation des récepteurs sur les cellules A431 additionné de 100 ligand d’EGF ng/mL dans les médias pendant 10 min à température ambiante (RT).

2. primaire d’anticorps Incubation

  1. Retirer et laver les cellules avec 300 µL d’une solution saline tamponnée au phosphate de température ambiante (RT) (solution de 1 PBS x) deux fois.
  2. Fixer les cellules avec 200 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
    NOTE : Afin d’étudier les changements temporels de l’agrégation de la cible, cette étape de fixation doit être omise.
  3. Retirez les PFA et laver les cellules avec 300 µL de PBS de la température ambiante.
  4. Incuber les cellules avec 200 µL de PBS contenant l’anticorps primaire à une concentration de 10 µg/mL pendant au moins 2 h à 4 ° C.
    NOTE : Pour les calculs de ICS être valides, tous les récepteurs présents à la surface de la cellule doivent être étiquetés avec l’anticorps primaire. Cela nécessite des expériences préliminaires avec une série de dilution de chaque anticorps primaire (01:10, 01:50, 1/100, 1 : 200, 1/500 1 / 1 000, etc.) à réaliser. Concentration en anticorps primaire optimale est déterminée grâce à l’analyse de l’intensité de la fluorescence par rapport à la densité de cluster. La concentration principale sélectionnée se produit lorsque la densité de la grappe des plateaux avec augmentation des concentrations d’anticorps primaire avant une nouvelle augmentation en densité de cluster en raison de la liaison des anticorps non-spécifiques. L’anticorps primaire peut être diluée dans des médias libres sériques si vous effectuez une expérience d’imagerie temporelle.
  5. Issue de la période d’incubation désiré, laver les cellules avec 300 µL de PBS de RT.
  6. Bloquer l’échantillon avec 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS pendant au moins 2 h à 4 ° C.
    NOTE : Échantillons fixes sont régulièrement bloqués toute la nuit (O/N) à 4 ° C.

3. secondaires anticorps Incubation

  1. Préparation d’un stock de 10 µg/mL de fluorescent étiquetée anticorps secondaire (p. ex. Alexa Fluor 488 IgG) dans du PBS. 2 µg/mL de Hoechst 33342 peuvent figurer dans cette dilution permettant la découverte d’échantillons améliorés sur le microscope.
    Remarque : Pour des expériences de Time-lapse, PBS peuvent être échangés contre des médias libres sériques.
  2. Enlevez 5 % BSA/PBS des cellules et incuber avec la solution d’anticorps secondaire pendant 2 h à 4 ° C, tout en protégeant les échantillons de la lumière ambiante.
  3. À la fin du temps d’incubation anticorps secondaire, laver les cellules avec 300 µL de PBS (deux fois) et conserver à 4 ° C, protéger de la lumière ambiante.
  4. Pour empêcher l’évaporation, envelopper les bords de la diapositive de chambre avec du parafilm.

4. confocal Microscopy d’échantillons

Remarque : Les paramètres utilisés pour l’analyse confocale vont dépendre de l’équipement et des fluorophores utilisés dans l’expérience individuelle. Les instruments confocal modernes fournissent des mécanismes pour enregistrer tous les paramètres d’imagerie utilisées pour l’expérience dans le format de fichier d’image native de l’instrument. Il est important que ces paramètres sont enregistrés afin de fournir à la réplication appropriée des conditions expérimentales à travers différentes périodes d’acquisition de données.

  1. Au cours de l’imagerie de signaux fluorescents, éviter la sursaturation. Utiliser un regard de l’image vers le haut de tableau qui fournit une représentation en fausses couleurs de saturation de pixel et réduire le gain de détecteur et puissance du laser en conséquence. Instruments confocal de plus incluent un paramètre « voyant » ou une option analogue dans le logiciel d’acquisition pour cela.
  2. Minimiser l’exposition du fluorophore d’intérêt pour la puissance du laser. L’utilisation d’une tache de marquage ADN telles que Hoechst 33342 fournit un mécanisme simple pour détecter et positionner l’échantillon dans le champ de vision avant le prélèvement.
  3. Effectuer l’analyse initiale de l’échantillon à une résolution faible et si le logiciel permet une rapide vitesse de numérisation. Vous limiterez ainsi le photoblanchiment possible de l’échantillon.
  4. Augmenter la résolution de capture et de ralentir la vitesse de balayage lorsque vous êtes prêt à recueillir des données de l’image.
  5. Si l’instrument confocale permet, collecter des données à l’aide d’un photon mode comptage.
    Remarque : Si le comptage de photon n’est pas disponible sur l’instrument : niveaux de gris soient linéaires au cours de l’acquisition d’images.
  6. Définissez le sténopé pour chaque ligne de laser utilisé pour 1 unité aérée (UA).
  7. Ligne ou cadre en moyenne au cours de l’acquisition d’images (x4) pour réduire le détecteur associée bruit.
    Remarque : Dans cette variante de l’ICS comme seul temps-point est capturé temps d’acquisition n’est pas expérimental facteur limitant.
  8. Pour l’image sélection de collection un fort grossissement, objectif de forte ouverture numérique, notamment un objectif Plan-Apochromat, pour fournir la résolution maximale et la correction des aberrations chromatiques et sphériques (exemples : Plan-Apochromat 100 X ou 63 X /1.40 Objectifs de l’huile).
  9. Suréchantillon la taille des pixels contenus dans l’image capturées. Il est recommandé à chaque pixel capturer une région de 50 x 50 nm. Pour ICS efficace, taille de pixel doit être inférieure à 0,1 x 0,1 µm2 par pixel. Ceci est réalisé par une combinaison de zoomer pour balayer une zone relativement restreinte et en sélectionnant un format d’image relativement grand (par exemple 1024 x 1024 ou 2048 x 2048 pixels).
  10. Se concentrer sur la surface apicale ou basale de la cellule dans une région aussi plate que possible. Plusieurs cellules peuvent être collectées dans les régions d’intérêt traités individuellement au cours de l’analyse de l’ICS et une seule image.
  11. Capture d’une région de fond libre de cellule en utilisant les mêmes paramètres de l’instrument à utiliser pour la normalisation de l’échantillon.

5. calcul de la spectroscopie de corrélation d’Image

Remarque : La plate-forme open-source-traitement de l’imagerie, Fidji, une distribution du programme ImageJ, est nécessaire pour effectuer l’autocorrélation et fonctions mathématiques essentielles à ICS. Cette distribution de ImageJ est recommandée car il comprend de nombreux plugins préinstallés et une architecture plus facile de mise à jour qui peut effectuer des opérations à travers de multiples expériences d’imagerie.

  1. Installez le programme Fidji (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Charger les ensembles de données acquises.
  3. Indiquez la région apicale ou carcinome baso-cellulaire de surface membranaire des intérêts et des duplicata de taille de pixel de 2n (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). « Menu : Image > Dupliquer... »
  4. Calculer l’intensité moyenne de la zone recadrée d’intérêt « Menu : analyser > mesures. »
  5. Identifier une zone de fond et de reproduire à la même taille de pixel de la membrane de surface cellulaire capture (2n: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). « Menu : Image > Dupliquer... »
  6. Calculer l’intensité moyenne de l’arrière-plan recadrée domaine d’intérêt. « Menu : analyser > mesures. »
  7. Soustraire l’intensité moyenne de l’arrière-plan de l’image contenant la région d’intérêt. « Processus > Calculatrice d’Image > soustraire. »
  8. Effectuer le calcul de l’autocorrélation. Ce calcul est contenu dans la Structure de Menu : « processus > ttf > FD Math. »
    1. Dans le calcul de la FD sélectionner de la boîte de dialogue : Image 1 : nom de l’Image recadrée, opération comme corrélation, Image 2 : nom de l’Image recadrée, la transformation Inverse.
  9. Normaliser l’image obtenue en divisant par le nombre total de pixels. « Menu : processus > mathématiques > diviser... » (c'est-à-dire: 64 x 64 pixels = 4096)
  10. Normaliser à nouveau en divisant par l’intensité moyenne de le normalisée recadrée zone au carré. « Menu : processus > mathématiques > diviser... »
    NOTE : Ceci est possible en divisant l’image par la valeur d’intensité moyenne, deux fois.
  11. Tracez une ligne grâce à la fonction de point propagation.
  12. Tracer le profil de cette ligne pour calculer la valeur de crête. « Menu : analyser > tracer le profil. »
  13. Calculer les grappes par zone de faisceau par le transfert de la valeur de crête (résultat de 5.12) dans une feuille de calcul et d’effectuer le calcul suivant (Eq 6) :
    figure-protocol-1

6. traitement des datasets ICS des lots

Remarque : La création d’une macro de Fidji/ImageJ est recommandée pour répliquer les procédures décrites dans le protocole ci-dessus. Cela permet l’analyse cohérente et rapide de plusieurs fichiers d’images au cours de l’analyse de la spectroscopie de corrélation image.

  1. Mettre en place un workflow ICS macro en enregistrant chaque commande de menu dans le protocole ICS
    « Menu : Plugins > Macros > Record... ».
  2. Sélectionnez « Créer » pour créer la Macro.
  3. Sélectionnez « langue > IJ1 Macro. »
  4. Enregistrez la Macro.
  5. Ajouter les boîtes de dialogue aux diverses étapes de la macro, fournissant des rappels aux opérateurs de chaque fonction. Boîtes de dialogue servent également de méthode pour interrompre le processus d’analyse pour permettre les sélections appropriées à effectuer avant la poursuite de la procédure (c'est-à-dire la région de recadrer)
    1. Boîte de dialogue Macro Code
      titre = « Titre de la boîte dialogue » ;
      MSG = « Dialogue boîte/protocole étape Message » ;
      waitForUser (titre, msg) ;
      Remarque : Les économies additionnelles peuvent être établies en vous inscrivant sur le site de mise à jour de BAR au sein de l’Updater de Fidji (Instructions https://imagej.net/BAR). Cette disposition offre Fidji « une collection de Routines largement Applicable » 14. Une telle routine est de trouver des pics. Structure du menu : « BAR > analyse de données > Find pics. » Ce script fournit que moyen rapide de calculer que la valeur de crête dans le profil du point spread function.

7. Protocole Extensions : Calcul de superficie de faisceau de Microscope

Remarque : La fonction de transfert optique du microscope s’assure que les objets même moléculaire taille apparaissent sous forme d’images avec un rayon d’environ 200-300 nm dans le plan x-y. Le protocole ICS permet la détermination de la fonction de point-propagation en effectuant les étapes 4 et 5 sur perles fluorescentes sous résolution. Plus précisément :

  1. Monter sous résolution (i.e. < 100 nm de diamètre) perles fluorescentes sur un 8 chambre diapositive d’imagerie.
  2. Perles d’image selon le protocole décrit à l’aide de microscope confocal utilisé pour des expériences de l’ICS.
  3. Calculer la fonction ICS de l’image résultante comme par les Etapes protocole 5.1-5,13.
  4. Du profil tracé, calculer le rayon de faisceau (r) comme la largeur totale à une valeur maximale de la moitié de la fonction ICS.
  5. Calculer l’aire du faisceau (BA) (Eq 7) :figure-protocol-2

8. Protocole Extensions : Calcul des grappes par unité de surface

  1. Calculer la densité de cluster (CD) par unité de surface (Eq 8) :
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
  2. Diviser les clusters surfacique de faisceau (résultat de 5.13) par la zone de la poutre (résultat de 7,5).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une expérience de spectroscopie de corrélation d’image réussie dépend de la bonne application des contrôles de traitement. Ces groupes de traitement comprennent l’examen de la fluorescence dans aucun anticorps primaire et aucun groupe de traitement d’anticorps secondaire. Une fois les réglages optimum laser confocale sont établies pour une expérience, les images doivent faire parties de ces groupes de contrôle pour confirmer l’absence de fluorescence non spécifiques au sein de l’échantill...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technique de spectroscopie de corrélation d’image (ICS) que nous décrivons dans ce protocole utilise des microscopes confocaux standards sans besoin de détecteurs spécialisés. La technique ICS décrite applique des méthodes immunocytochimie bien établi à fournir pour l’échantillonnage rapide de multiples conditions de traitement pour l’analyse statistique accrue. Cette méthodologie fait avec une légère réduction de précision absolue par rapport aux techniques alternatives molécule unique basé sur la corrélation entre l...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Andrew M Scott recherche aide financière de AbbVie pharmacie, EMD Serono et Daiichi-Sankyo Co. et dont une consultance et actionnariat des produits pharmaceutiques de sciences de la vie. Les auteurs n’ont aucun autre affiliation pertinente ou participation financière avec toute organisation ou entité ayant un intérêt financier dans ou conflit financier avec le sujet ou les matières discutées dans le manuscrit en dehors de celles indiquées.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs reconnaissent le soutien financier du NHMRC (1084178 de bourses et subventions 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), Cancer Australie, Ludwig Cancer, John T Reid Trusts, Cure Brain Cancer Foundation, La Trobe University et l’Agence du Cancer de Victoria. Financement du programme de soutien opérationnel Infrastructure fournie par le gouvernement de Victoria, l’Australie est également reconnu.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Verre de protection chambre Nunc Lab-Tek II - 8 puitsThermoFisher Scientific155409
DPBS, sans calcium, sans magnésiumThermoFisher Scientific14190144
Sérum fœtal bovinThermoFisher Scientific10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), sans rouge de phénolThermoFisher Scientific12604021
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Supplément GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061
Anticorps secondaire anti-IgG humaines (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphère Étalons 0,1µ ; mThermoFisher ScientificT7279
CetuximabMerck Serono3023715501
Parafilm M 38mx100mmMerck MilliporeBRND701605
16 % Paraformaldéhyde (formaldéhyde) solution aqueuseProSciTechC004
Recombinant Humain EGFR& Système D236-EG

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
  2. Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14(2016).
  3. Sorkin, A., Waters, C. M. Endocytosis of growth factor receptors. BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).
  4. Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. (2006).
  5. Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).
  6. Wiseman, P. W., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells. Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).
  7. Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).
  8. Claire Robertson, S. C. G. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801(2012).
  9. Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).
  10. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  12. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  13. Rappaz, B., Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization. Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).
  14. Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/495245 (2017).
  15. Elson, E. L. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future. Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).
  16. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).
  17. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).
  18. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  19. Nohe, A., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. Sci. Signal. (417), pl7(2007).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Fluorescent ImmunocytochemistryEGF Receptor ClusteringPoint Spread Function AnalysisFiji ImageJ ProcessingA431 Epidermoid Carcinoma CellsSpatial Intensity QuantificationBeam Area Measurement

Articles connexes