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Article de méthode

Une méthode pour définir les effets de l’enrichissement environnemental sur la biodiversité le Microbiome du côlon dans un modèle murin de tumeur du côlon

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DOI :

10.3791/57182

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28 février 2018

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1Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

Dans cet article

Résumé

Enrichissement de l’environnement (ERE) est un environnement de logement des animaux qui permet de révéler les mécanismes qui sous-tendent les connexions entre le mode de vie, le stress et la maladie. Ce protocole décrit un procédé qui utilise un modèle murin de la tumorigenèse du côlon et EE pour définir précisément les altérations en biodiversité microbiote qui peut-être influer sur la mortalité animale.

Résumé

Plusieurs études récentes ont révélé les effets bénéfiques de vivre dans un environnement enrichi sur l’amélioration de la maladie humaine. Chez les souris, enrichissement environnemental (EE) réduit la tumorigenèse en activant le système immunitaire de la souris, ou affecte la survie animale de la tumeur roulement en stimulant la réponse de réparation de plaie, y compris amélioré microbiome diversité, dans le microenvironnement tumoral. Fourni ici est une procédure détaillée pour évaluer les effets de l’enrichissement environnemental sur la biodiversité de la microbiome dans un modèle murin de tumeur du côlon. Précautions concernant l’élevage d’animaux et les considérations relatives à l’intégration de colonie animale génotype et de la souris sont décrites, ce qui affecte finalement la biodiversité microbienne. Tenant compte de ces précautions peut permettre plus uniforme microbiome transmission et par conséquent permettra d’atténuer des effets reliés à pas de traitement qui peuvent confondre les résultats de l’étude. En outre, dans cette procédure, microbiote changements sont caractérisés en utilisant 16 s rDNA séquençage de l’ADN isolé dans les selles prélevés dans le côlon distal après enrichissement environnemental à long terme. Déséquilibre de flore microbienne intestinale est associé à la pathogenèse du cancer de l’intestin inflammatoire maladie et le côlon, mais aussi de l’obésité et le diabète entre autres. Ce qui est important, ce protocole pour l’analyse des EE et microbiome peut être utilisé pour étudier le rôle de la pathogénèse de microbiome à travers une variété de maladies où il existe des modèles de souris robuste qui peut récapituler les maladies humaines.

Introduction

Études d’enrichissement environnemental (EE) utilisent des paramètres complexes de logement pour influer sur la stimulation sociale (logement grandes cages, grands groupes d’animaux), stimulation cognitive (cabanes, tunnels, matériaux de nidification, plates-formes) et l’activité physique (marche roues). EE a été utilisé par nombreux laboratoires pour comprendre les effets de l’augmentation de l’activité et l’amélioration des interactions sociales et cognitives sur l’initiation de la maladie et la progression à l’aide d’un large éventail de modèles de souris, y compris de l’alopécie induite coiffeur, la maladie d’Alzheimer, Le syndrome de Rett et plusieurs maladies tumorales et digestif modèles1,2,3,4,5,6.

Plusieurs modèles de souris ont été développés pour étudier la tumorigenèse du colon chez des souris. Le modèle plus bien défini est peut-être la souris ApcMin . La souris ApcMin a été développée dans le laboratoire de William Dove en 19907et a été utilisée comme un modèle de souris de mutations dans le gène APC qui sont couramment associés à un cancer colorectal humain. Contrairement aux humains hébergeant des mutations de l’APC , ApcMin souris développent principalement petites tumeurs intestinales, événement très rare des tumeurs du côlon. Toutefois, un allèle Tcf4Het avec une mutation hétérozygote knockin-knockout en Tcf4, augmente considérablement tumorigenèse du côlon lorsqu’il est combiné avec l' allèle de ApcMin 8. Récemment, ce modèle de souris de la tumorigenèse du côlon a servi à déterminer les effets de l’ERE du côlon tumorigenèse6. Le Bice et al. étudier les effets physiologiques et phénotypiques de l’ERE sur mâles et femelles de quatre lignées de souris différentes (type sauvage (WT), Tcf4Het / + Apc+ / +, Tcf4+ / + ApcMin / +, et Tcf4 Het / + APCMin / +)) ont été définis. Peut-être les plus intéressantes conclusions était que EE augmente de manière significative la durée de vie des animaux de porteurs de tumeur du côlon mâles et femelles. Cela démontre que EE peut réduire au moins certains des symptômes associés à tumorigenèse du côlon et améliorer la santé animale. Remarquablement, cette durée de vie améliorée chez les mâles n’est pas une conséquence directe de la tumorigenèse réduite et au lieu de cela était liée à l’initiation d’une réponse, y compris le microbiome améliorer la biodiversité6tumeur de cicatrisation.

Plusieurs études spécifiques de EE ont été publiées avec des résultats intéressants. Cependant, du point de vue technique, des résultats importants ne sont souvent pas traduisibles aux autres laboratoires. Le maintien des méthodologies EE identiques entre différents laboratoires est une question incroyablement complexe, non seulement en raison des dispositifs d’enrichissement et de l’habitation utilisée, mais également literie, nourriture, ventilation, élevage, génétique, activité dans la salle et le protocole de l’animal exigences, entre autres,9,10,11. Un exemple est intégration animale, où animaux doit être solidement intégrés dans la colonie de souris, donc normaliser composition génétique de fond et le régime alimentaire, afin d’éviter des effets connexes de non-traitement. En outre, de nombreuses études EE sont achevées avant la réalisation de l’importance du microbiome dans la maladie et la façon que les pratiques d’élevage de souris commune peuvent influer sur la composition de l’intestin microbiome10,12.

Élevage animal et la stratégie de placement dans EE peut augmenter le stress si elle n’est pas effectuée correctement. Étant donné que les études EE utilisent un grand nombre de fois des animaux mâles et femelles et plusieurs génotypes, montage expérimental peut être difficile compte tenu de l’exigence pour les animaux provenant de plusieurs portées à combiner. Par conséquent, un élevage et stratégie de sevrage a été développé pour permettre une combinaison des animaux sevrés du génotype correct des portées différentes. La principale raison d’être pour cela est de normaliser la microflore des portées et à réduire le stress lorsque les animaux ont été déplacés vers l’environnement expérimental. Le microbiome a été diffusée par le barrage de10. Afin d’offrir la diversité microbienne dans la colonie, les femelles ont été achetées de Jackson Labs et intégrées dans la colonie pendant un mois avant le début de l’expérience9,10,12. Pour davantage normaliser la biodiversité microbiome entre animaux, les femelles sont conjointement logées avant la reproduction. Après la reproduction, logement communal au cours de l’élevage et la possibilité d’échapper à petits soins infirmiers amélioré le niveau de stress des soins maternels13,14, éventuellement favoriser microbiome normalisation. Pour éviter d’autres effets sur le microbiome liés, ce logement communal de tous les animaux de laboratoire ont empêché combat stress supplémentaire qui s’est produite lors de la combinaison de plusieurs mâles provenant de différentes portées dans une cage expérimentale. Enfin, un nombre égal d’animaux de tous les génotypes ont été inclus dans les cages. Cela a permis aux microbiote améliorer la biodiversité à travers des génotypes et supprimé la contribution de coprophagie (tendance de l’animal à consommer des selles) ou des différences de comportement possibles génotype spécifique à l’étude globale.

Ce protocole prévoit une stratégie qui développe des études antérieures d’EE afin d’inclure les aspects connus de recherche microbiome, y compris l’intégration du microbiote transmission et animal de la colonie microbiote normalisation, pour permettre à des populations plus uniforme microbiome entre les animaux de laboratoire. Tenant compte de ces précautions est essentielle en raison de la capacité des différences de non-traitement microbiote connexes pour confondre les résultats de l’étude. Éliminer les non-EE associés microbiote modifications permettra aux chercheurs de définir précisément le rôle de l’ERE sur la composition de la microflore durant le développement de la maladie et la progression.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été réalisés conformément aux protocoles approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’Université de l’Utah.

1. protocole expérimental et EE et panneau de configuration Cage

Remarque : Pour référence, les grandes lignes du plan expérimental est illustrée (Figure 1).

  1. Mis en place le contrôle (NE) et de cages à EE (Figure 2).
    1. Pour mettre en place des cages NE, utilisez cages de contrôle conventionnel autoclavés (tableau 1) que le manque de dispositifs d’enrichissement.
    2. Pour les grandes cages, percer un trou par cage qui est assez grand pour accueillir un œillet et tunnel (Table des matières).
    3. Pour configurer d’élevage des petits et des cages EE, connectez deux grandes cages autoclavés avec un tunnel sécurisé stérilisé à œillets et 2 plates-formes stérilisés pour augmenter l’espace de plancher (tableau 1). Pour des expériences EE, contient stérilisé exécutant des roues, tunnels, igloos, cabanes, boules de rampement et matériaux dans les cages EE de nidification.
    4. Placer les cages EE et de NE dans un rack ventilé pour assurer une ventilation égale.
      Remarque : Deux grandes cages avec 2 plateformes (tableau 1) permettent un maximum de 12 femelles enceintes par chiot élevage installation15 (voir Table des matières, 3.2 dans le document et tableau 2).
    5. Se nourrit de souris ad libitum irradiés chow standard et l’eau osmosée autoclavée.
    6. Fournir des souris avec literie stérile.
      Remarque : Toutes les manipulations des cages vides et des cages avec des animaux doivent se faire dans le capot pour éviter la contamination. Pour la manipulation de la cage de grandes cages, recouvrir le trou dans la cage avec un film adhésif.
  2. Préparer les animaux d’élevage. Groupe 15 femelles 2 - mois, de maison en une seule grande cage (tableau 1) pendant 2 semaines avant l’accouplement. Maison séparément 2 - mois vieux mâles de même portée pendant 2 semaines avant l’accouplement.
    Remarque : Le nombre de femelles pour la reproduction dépend de l’expérience et le nombre d’animaux requis. Dans cette étude, 15 femmes ont été utilisées pour obtenir 12 femelles bouchées, qui est le maximum nombre autorisé dans le chiot d’élevage configuration décrite au paragraphe 1.1.2 (tableau 2).
  3. Pour la reproduction, combiner animaux sire et barrage, 1 mâle pour 2 femelles. Le premier chèque le matin devrait être prises vaginale, qui peut être un signe visuel que les animaux ont accouplé au cours de la nuit.
    Remarque : Maison mâles et femelles ensemble jusqu'à ce que chaque femelle a branché. Un plug vaginal peut être identifié visuellement, si elle est externe.
    1. Pour détecter les bouchons intériorisées, une sonde est insérée dans l’orifice vaginal et si la fiche vaginale est présente, la sonde n’est pas facilement insérée (16; Voir la section 4.3.6).
      Remarque : Enregistrer le matin qu'une fiche est détectée comme ½ journée, étant donné que l’accouplement a eu lieu dans la nuit.
    2. Une fois que les femelles ont des bouchons vaginales, transférez-les sur un chiot grand élevage cage pour logement de groupe avec d’autres femelles accouplées (programme d’installation à l’étape 1.1.2 sans matériel d’enrichissement).
    3. Remplacer accouplées femelles avec des nouvelles femelles accouplées groupe logé pour s’accoupler et continuer l’accouplement afin d’obtenir un nombre maximum de portées dans un délai de 7 jours.
      Remarque : Tous les animaux doivent avoir une date de livraison dans les 7 jours d’intervalle.
  4. Laisser les femelles gravides donner naissance au groupe logement afin que toutes les portées sont déclenchées dans un chiot grand élevage cage (programme d’installation à l’étape 1.1.2 sans matériel d’enrichissement).
    1. Garder trace des dates de naissance et numéros de chiot et commencer les chiots de génotypage 7 jours après la naissance.
      1. Tatouage chiots sur leurs orteils 7 jours après la naissance avec un numéro de code pour les identifier13,17.
      2. Nettoyer l’orteil avec l’éthanol à 70 % et insérer délicatement un dispositif micro-tatouage contenant l’encre dans la surface de la peau parallèle à l' orteil17 (voir Table des matières).
      3. Recueillir des tissus avec des ciseaux pour le génotypage depuis le bout de la queue par incision d’un petit morceau de tissu de 7 - jours vieux nouveau-nés.
    2. Isoler l’ADN génomique de tissus et d’effectuer la PCR à l’aide d’une méthode conventionnelle de HotSHOT comme décrit dans 18.
    3. Animaux séparés selon le sexe à 14 à 21 jours dans grandes cages avec les mères.
      Remarque : S’assurer que les chiots plus âgés sont capables de se nourrir de leurs propres, et que les jeunes chiots continuent d’allaiter jusqu’au vieux assez pour se nourrir de leurs propres.
    4. 21-28 jours, distribuer des animaux mâles et femelles séparément par génotype dans les milieux NE ou EE, en veillant à garder les proportions égales de chaque génotype par cage (Figure 2A).
      Remarque : Veiller à ce que le nombre total d’animaux admis dans chaque cage NE ou EE repose sur le nombre maximal autorisé par IACUC (tableau 2). Les cages NE comporter au maximum 5 animaux (tableau 2). Dans des cages EE, stimulation sociale, pas moins de 20 et aux restrictions de l’espace, pas plus de 41 animaux devrait être autorisés dans la cage EE (tableau 2).

2. tabouret Collection à 16 semaines d’âge

  1. Commencer collection de selles 1 à 2 jours avant de sacrifier et recueillir séparément les selles sur le jour du sacrifice au cours de la dissection à l’aide des outils stériles.
    Remarque : Collecte de selles en même temps 1-2 jours ayant précédé le prélèvement peut aider à éviter la perte d’un échantillon en raison de la possibilité qu’aucun tabouret n’est présent au moment de la collecte.
    1. À recueillir selles d’animaux vivants, soigneusement scruff l’animal dans une cage propre. Recueillir les selles à l’aide d’une pince stérile dans un tube à centrifuger stérile.
      Remarque : Animaux éliminera généralement selles lorsque immobilisée, qui permet pour la collection de selles rapide directement dans un tube à centrifuger stérile. Si un animal ne pas immédiatement déféquer lorsqu’immobilisé, placez-le dans une cage propre et attendez que l’animal de déféquer (généralement jusqu'à 1 h).
    2. Recueillir les selles sur le jour du sacrifice.
      1. Pour euthanasier l’animal, placer l’animal dans une cloche de verre contenant un petit récipient avec un tampon d’ouate imbibé d’isoflurane. Une fois l’arrêt de la respiration est observée (habituellement après 2 min), posez l’animal sur son dos pour permettre la dissection du côlon.
      2. S’appliquent à l’éthanol à 70 % à l’abdomen de la souris.
      3. Soulever la peau avant le méat urétral et avec une pince et utiliser des ciseaux pour couper le long de la ligne médiane ventrale jusqu'à arriver à la cage thoracique et couper de la base de la première incision vers chaque jambe. Replier la peau et utiliser des ciseaux pour couper à travers la paroi péritonéale dans le même schéma.
      4. Pince permet de saisir le côlon distal à l’anus de disséquer et détacher le côlon distal du rectum. Tout en tirant sur les deux points verticalement avec une pince, utiliser des ciseaux pour couper à travers le mésentère pour libérer le côlon.
      5. Couper les deux points juste en dessous du caecum et posez-le sur un papier filtre. Forceps permet de soulever le haut du tube du côlon, ouverture de la lumière pour permettre à un côté de ciseaux ouvert à insérer. Coupé longitudinalement, ouverte de distal à proximal et ébrasement du côlon sur la longueur.
      6. Recueillir les selles dans le côlon distal dans un tube à centrifuger stérile à l’aide d’une pince stérile.
  2. Tabouret de magasin dans un tube à centrifuger à-80 ° c jusqu’au moment de l’isolement de l’ADN bactérien.
    Remarque : Le jour du sacrifice, en plus de selles, recueillir des autres échantillons tels que le sang total, sérum, plasma, normal et le tissu tumoral du côlon et l’intestin grêle, microsomes, tissu adipeux, etc.. d’aborder des questions définies dans l’étude.

3. genomic DNA Isolation dans les selles

Remarque : Utiliser une trousse commerciale pour isoler l’ADN microbien dans les selles suite à un protocole de détection de pathogènes tabouret. Prélèvement d’échantillons directement pour le congélateur ˚C-80 et le magasin sur la glace sèche tout en pesant.

  1. Transférer jusqu'à 220 mg de selles dans un tube à centrifuger propre contenant 1,4 mL de tampon de lyse tabouret température ambiante (RT) (voir la Table des matières).
  2. Échantillon de Vortex pendant 1 min à homogénéiser soigneusement solides (Figure 2B). Faire chauffer la suspension à 95 ° c pendant 5 min à lyser toutes les bactéries (y compris les bactéries à Gram positif).
  3. Échantillons de Vortex pendant 15 s, puis centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min granuler les solides de selles. Transférer surnageant dans un tube à centrifuger de 2 mL. Ajouter une pastille de chaque échantillon d’absorber des inhibiteurs de PCR, vortex jusqu'à ce que le comprimé se dissout et incuber l’échantillon à RT pendant 1 min.
  4. Centrifuger l’échantillon à 20 000 x g pendant 3 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger. Centrifuger à 20 000 g pendant 3 min. Aliquot 15 μl de protéinase K (20 mg/mL de bouillon) dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Pipeter 200 μl de l’échantillon dans le tube contenant la protéinase K.
  5. Ajouter 200 μl de tampon de lyse chlorure guanidinium au tube, vortex soigneusement pendant 15 s (voir Table des matières) et incuber l’échantillon à 70 ° c pour 10 min. Ajouter 200 μL d’éthanol (96-100 %) pour les tubes et mélanger bien au vortex.
  6. Place une silice base de colonne dans un tube de prélèvement de 2 mL et appliquez les échantillons à la colonne. Fermer le couvercle et centrifuger pendant 1 min à 20 000 x g.
  7. Transférer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL et ajouter 500 μl de tampon de lavage 1 à la colonne, cap de la colonne et centrifuger pendant 1 min à 20 000 x g. transfert la colonne vers un nouveau tube de prélèvement de 2 mL et ajouter 500 μl de tampon de lavage 2 à la colonne , fermer le bouchon et centrifuger à 20 000 x g pendant 3 min.
  8. Avec le couvercle fermé, transférer la colonne sur un nouveau tube de prélèvement de 2 mL et centrifuger pendant une supplémentaire de 1 min à 20 000 x g pour retirer le tampon de lavage résiduelle. Transférer la colonne à un 1,5 mL étiqueté tube à centrifuger et éluer l’échantillon en ajoutant 200 μl de tampon d’élution contenant de l’EDTA à la membrane (voir Table des matières).
  9. Fermez le bouchon et laisser incuber à RT pendant 1 min. Centrifuger l’échantillon pendant 1 min à 20 000 x g. jeter la colonne.

4. ADN Concentration dosage et préparation des échantillons pour l’ACP

Remarque : Utiliser un fluorimètre et une immunofluorescence dsDNA commercialement disponible pour déterminer la concentration d’ADN génomique dans chaque échantillon (voir Table des matières). Le colorant fluorescent doit spécifiquement lié à ADN bicaténaire.

  1. Préparer une dilution au 1 : 200 de chaque échantillon (1 µL de chaque échantillon dans 199 mélange maître de µL ADNdb) et un 01:50 dilution des normes. Analyser un fluorimètre au réglage de l’ADN double brin.
    Remarque : Un volume élevé d’ADN par PCR peut être inhibitrice, donc, le volume de l’ADN utilisé ne doit pas être plus de 10 % du volume final de la PCR. Un fluorimètre permet une mesure précise de l’ADN dans l’échantillon, comme seulement les ADN lié à la teinture fluorescente seront réagissent en, éliminant la contribution possible de contaminants à la concentration finale d’ADN calculée. Ce niveau de quantification précise est essentiel pour l’application de séquençage en aval.
  2. Préparer des modèles PCR diluées à 5 ng/μL, avec le volume approprié de 10 mM Tris, pH 8,5 à faire des stocks de modèle de travail de chaque échantillon.
  3. Conserver les échantillons à-20 ° C.

5. conception des amorces pour les 16 désiré V régions

  1. Conception des amorces pour amplifier sélectivement les régions de rRNA 16 s V désirées.
  2. Analyser des amorces avec sonde Match, par le projet de base de données Ribosomal19, afin de déterminer le taux d’interception approximatif pour divers embranchements.
    Remarque : Pour les régions de V1-V3, la présente étude utilisée publié amorces Bosshard avant20, qui se lient à la position 8 dans la région de V1 et 533 inverse21, qui se lie au poste 533 au sein de la région de V3. Amorces doivent inclure des séquences Adaptateur porte-à-faux pour l’indexation.
  3. Lors de la conception des amorces, incluent des séquences d’adaptateur aux extrémités 5' de chaque amorce, tel que recommandé pour la métagénomique 16 s, séquençage bibliothèque préparation22 (tableau 3).
  4. Synthétiser ces amorces grandes purification de la cartouche. Reconstituer les amorces desséchées et diluer une PCR en stock à 1 μM 10 mM Tris, pH 8,5.

6. Amplicon PCR pour amplifier l’ou les régions avec des séquences de surplomb adaptateur V joint 22

  1. Mettre en place l’amplicon mélange de réaction PCR comme décrit dans le tableau 4.
  2. Posez un joint de la plaque PCR transparent adhésif sur la plaque et exécutez l’amplicon PCR en utilisant les paramètres dans le tableau 5.
  3. (Facultatif) Exécuter des amplicons produits PCR sur gel d’agarose ou un essai d’ADN de haute sensibilité qui permet une mesure quantitative de la taille de l’amplicon (voir Table des matières).
    Remarque : La taille de l’amplicon de cette étude est de 550 bp (Figure 3A).

7. PCR nettoyage à l’aide magnétique perles 22

  1. Centrifuger la plaque PCR amplicon rapidement à 1 000 x g pendant 1 min recueillir la condensation.
    Remarque : Bandes de tube PCR peuvent être utilisés au lieu de plaques PCR pour minimiser la contamination. Jeter le tube couvercles et ne réutilisez jamais.
  2. Vortex les billes magnétiques pour disperser uniformément et ajouter 20 μL de magnétique perles à chaque amplicon PCR bien, puis Pipetter tout le volume monte et descend lentement 10 fois.
  3. Incuber à RT pendant 5 min. Place la plaque PCR sur un support magnétique pendant 2 min jusqu'à ce que les billes magnétiques sont collectés et le surnageant est clair. Retirer et jeter le surnageant.
  4. Perles de lavage avec 200 μL frais l’éthanol 80 % tandis que la plaque PCR est sur le magnétique stand et incuber pendant 30 s à ta sur le support magnétique. Retirer délicatement le surnageant.
  5. Répéter le lavage pour une deuxième fois. Maintenant, utiliser un embout de la pipette fine pour enlever tout l’éthanol résiduel provenant des puits et de permettre à l’air de séchage pendant 10 min.
  6. Retirer la plaque PCR du support magnétique et ajouter 52,5 μL de 10 mM Tris pH 8,5 à chaque puits. Pipetter vers le haut et le bas de 10 fois de suspendre les perles et incuber à température ambiante pendant 2 min.
  7. Transférer la plaque PCR sur le support magnétique pour recueillir des billes magnétiques et transférer 50 μL de surnageant dans une assiette propre de la PCR. Posez un joint de la plaque PCR transparent adhésif sur la plaque et conserver à-20 ° c pendant une semaine.

8. élaboration d’un schéma de plaque pour Index PCR

Remarque : Pour générer une bibliothèque de V1-V3, une deuxième PCR a été réalisée avec un index nécessaire (voir la Table des matières). Un schéma d’indexation par défaut a été utilisé pour cartographier de combinaisons d’index double unique pour chaque échantillon (Figure 3B et 23).

  1. S’assurer que chaque échantillon a une combinaison unique de 2 amorces d’indice (c'est-à-diredouble indexation).

9. Effectuez Index PCR pour fixer des codes à barres pour les séquences de l’adaptateur comme décrit 22 .

  1. Transférer 2,5 μL d’amplicons PCR (amplicons propre) à une nouvelle plaque de 96 puits et les place dans un appareil plaque d’indice afin de faciliter l’indexation.
  2. Réorganiser l’index 1 et index 2 amorces comme dans l’exemple de l’image de la plaque préparée (Figure 3B).
    Remarque : Repères visuels sont fournis pour éviter les confusions d’apprêt : tubes apprêt index 2 devraient avoir capuchons blancs et une solution claire, tandis que les tubes apprêt index1 devraient avoir casquettes orange et jaune solution.
  3. Monter l’indice de réaction PCR Mix comme décrit dans le tableau 6. La composition de pipetage et descendre de 10 fois. Couvrir avec un joint de la plaque PCR transparent adhésif et centrifuger pour collecter à 1 000 x g à température ambiante pendant 1 min.
  4. Exécutez l’index PCR en utilisant les paramètres dans le tableau 7.

10. purifier PCR Final bibliothèque

Remarque : Ce nettoyage PCR est identique à l’étape 7 ci-dessus et utilise des billes magnétiques pour effectuer une PCR Clean-Up de l’indice PCR22.

  1. Centrifuger la plaque PCR de l’étape 10 rapidement à 1 000 x g pendant 1 min recueillir la condensation.
  2. Vortex les billes magnétiques pour disperser uniformément, puis ajouter 20 μL de magnétique perles à chaque amplicon PCR, pipette alors la totalité du volume et descendre lentement 10 fois pour mélanger.
  3. Incuber 5 min à RT.
  4. Plaque PCR place sur un support magnétique pendant 2 min jusqu'à ce que les billes magnétiques sont recueillis et le surnageant est clair. Retirer et jeter le surnageant.
  5. Perles de lavage avec 200 μL frais l’éthanol 80 % tandis que la plaque PCR est sur le magnétique stand et incuber pendant 30 s à température ambiante sur le support magnétique. Retirer délicatement le surnageant.
  6. Répéter le lavage pour une deuxième fois.
  7. Après le deuxième lavage, utilisez une fine de la pipette pour enlever tout l’éthanol résiduel provenant des puits et de permettre à l’air de séchage pendant 10 min.
  8. Retirer la plaque PCR du support magnétique et ajouter 52,5 μL de 10 mM Tris pH 8,5 à chaque puits. Pipetter vers le haut et le bas de 10 fois de suspendre les perles et incuber à température ambiante pendant 2 min.
  9. Transférer la plaque PCR sur le support magnétique pour recueillir des billes magnétiques et transférer 50 μL de surnageant dans une assiette propre de la PCR. Posez un joint de la plaque PCR transparent adhésif sur la plaque et conserver à-20 ° c pendant une semaine.
  10. (Facultatif) Exécuter les indexer des produits PCR sur gel d’agarose ou un essai d’ADN de haute sensibilité qui permet une mesure quantitative de la taille de l’amplicon (voir Table des matières).
    Remarque : La bibliothèque indexé final de cette étude comptait 668 bp (Figure 3-C-D).

11. quantifier, normaliser et mettre en commun les bibliothèques indexés pour le séquençage

  1. Déterminer la concentration d’ADN de chaque échantillon avec un fluorimètre et un kit d’immunofluorescence dsDNA (voir Table des matières).
    1. Préparer une dilution de 1 : 200 de l’échantillon (1 µL de chaque échantillon dans 199 µL dsDNA master mix, qui inclut la mémoire tampon et réactif) pour chacun des échantillons indexées et normes (190 µL dsDNA master mix et 10 µL de la norme). Analyser un fluorimètre au réglage de l’ADN double brin.
  2. Après le calcul de concentration de l’ADN, normaliser les bibliothèques en calculant la taille moyenne de bibliothèque. Cela en additionnant les longueurs de l’adaptateur, indice longueurs et taille amplicon V apprêts et consulter les produits en gel d’agarose pour être certain que la taille réelle est comparable à la taille calculée (voir laFigure 3C, 22).
    1. Vous pouvez également utiliser un test d’ADN de haute sensibilité qui permet une mesure quantitative de l’ADN l’intégrité, la taille de l’amplicon et concentration (Table des matières, Figure 3D).
      Remarque : Dans cette étude, la taille de la bibliothèque moyenne a été calculée en additionnant les longueurs de l’adaptateur, indice longueurs et V1-V3 amplicon taille d’amorces. La taille moyenne était 668 bp.
    2. Les concentrations d’échantillons sont normalisées à l’aide de la formule dans le tableau 8.
  3. Diluer les échantillons à 4 nM et poule 5 μL de chaque échantillon de 4 nM dans un seul tube pour l’ordonnancement.

12. la bibliothèque à l’aide d’un système de séquençage nouvelle génération de séquence et d’analyser les données

  1. Séquence de la bibliothèque.
    Remarque : Pour cette étude, l’Université de l’Utah High Throughput génomique Core effectuée dénaturation de la bibliothèque et le séquençage de l’échantillon (comme décrit dans 6,22).
  2. Analyser les données.
    Remarque : Pour séparer les données des échantillons groupés, indice lectures ont été identifiés et séparés (comme décrit dans le 22).
  3. Générer des fichiers FASTQ et utiliser cela pour une analyse ultérieure des données.

13. analyser les données en séquence de la bibliothèque d’Amplicon 16 s

Remarque : Cette étape est effectuée comme décrit dans Bice et al., 20176.

  1. Installer les outils d’analyse de données librement accessibles (voir Table des matières; 24).
  2. Assemblez des fichiers de démultiplexage fastq d’après les données séquencées (comme décrit dans25,26). Jeter toutes les séquences non montées.
  3. Effectuer des analyses après une de novo ouvert unité taxonomique (UTO) cueillette protocole (tel que décrit dans 27).
    1. Bin les séquences dans un fichier unique fastq par sampleID et des séquences de groupe avec 97 % ou une plus grande similitude dans OTUs, comme décrit dans le 28. Aligner les séquences représentant de cœur serti de longueur de la séquence minimale de 150 et 75 % pour cent identité29,30. Assignez taxonomie comme décrit28.
      Remarque : Les échantillons peuvent être mis en cellule et analysé31, suivie d’attribution taxonomique et OTU tableau construction32.
    2. Créer un fichier de mappage qui identifie les noms descriptifs et les caractéristiques des échantillons pour relier à l’identification des échantillons et de valider la cartographie fichier33,34.
    3. Faire un réseau OTU OTUs aux descriptions d’échantillon à l’aide d’un fichier de mappage35.
    4. Calculer les résumés de taxonomie en termes d’abondance relative en résumant les taxons par parcelles36.
    5. Explorez la diversité alpha des échantillons à profondeur uniforme de séquençage approprié d’échantillons. Pour définir la profondeur appropriée pour la diversité alpha, résumer les comptages totaux observées dans chaque échantillon en utilisant la commande résumer-table de biome, comme décrit dans 37.

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Résultats

Plusieurs études ont démontré que la pratique de la médecine esprit-corps améliore les résultats de santé. De même, chez la souris, enrichissement environnemental améliore les résultats, y compris la durée de vie améliorée et tumeur plaie réparation6. Par conséquent, une procédure EE a été développée dans le but de définir le rôle du microbiote dans ce phénotype en premier normalisant le microbiome avant le début de l’expérience (Figure 1

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Discussion

Cette procédure permet l’analyse du microbiote isolé dans les selles après enrichissement environnemental normal ou tumeur portant des animaux. Parce que ce sont de grandes expériences qui impliquent des reproducteurs afin d’obtenir de nombreux animaux de sexe différent et de génotypes, normalisant le microbiome entre animaux avant le début de l’expérience est essentielle pour éviter d’autres effets sur le microbiome liés biodiversité.

Par souci de cohérence entre les conditions NE et EE, du p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt.

Remerciements

Nous remercions B. Dalley, dans le centre de génomique de l’Université de l’Utah pour le séquençage de la bibliothèque et K. Boucher dans le noyau de biostatistique de l’Université de l’Utah pour conseils statistiques et l’accès à ces carottes techniques pris en charge par le prix de l’Institut National du Cancer P30 CA042014. Le projet décrit a été appuyé par le National Cancer Institute subventions P01 CA073992 et K01 CA128891 et la Fondation du Cancer de Huntsman.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Teklad Diets/Harlan Labs ChowHarlan Labs3980XChow irradié standard formulé par le Dr Mario Capecchi en collaboration avec Harlan Labs.
Literie Cell-Sorb PlusFangman Specialties82010Autoclave avant utilisation.
Système de tatouage AIMS pour nouveau-nésAIMSNEO-9https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. D’autres systèmes de tatouage et encres de qualité animale peuvent être utilisés avec des résultats similaires, y compris le kit de tatouage Aramis Micro.
Système de micro-isolement pour souris Zyfone One Cage 2100 AllerZone Complet avec cage, dessus de filtre AllerZone et système modulaire d’administration de régimeProduits de laboratoire82120ZFChaque cage EE nécessite un exemplaire de chaque catalogue # 82120ZF, 82100ZF et 82101ZF, ainsi que deux de 82109ZF. La nourriture n’est que d’un côté.
Dispositif d’enrichissement de l’étendue de vie Zyfone One Cage 2100Produits de laboratoire82109ZFChaque cage EE nécessite un exemplaire de chaque catalogue # 82120ZF, 82100ZF et 82101ZF, ainsi que deux de 82109ZF. La nourriture n’est que d’un côté.
Cage Zyfone One Cage 2100 13-7/8 » Longueur x 19-1/16 » Largeur x 7-3/4 » ProfondeurProduits de laboratoire82100ZFChaque cage EE nécessite un exemplaire de chaque catalogue # 82120ZF, 82100ZF et 82101ZF, ainsi que deux exemplaires de 82109ZF. La nourriture n’est que d’un côté.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filtre topLab Products82101ZFChaque cage EE nécessite un exemplaire de chaque catalogue # 82120ZF, 82100ZF et 82101ZF, ainsi que deux modèles 82109ZF. La nourriture n’est que d’un côté.
TunnelBio-ServK3323 ou K3332Connecter les cages ensemble et les utiliser pour l’enrichissement
Œillet pour relier le tunnel aux cagesFabriqué par l’atelier d’usinage de l’Université de l’Utahn/aAssurez-vous que le matériau résiste à la mastication et qu’il est autoclavable
Roue à voie rapideBio-ServK3250 ou K3251À utiliser avec un igloo de souris et un igloo de souris de sol
IglooBio-ServK3328, K3570 ou K3327Utilisation avec la roue Fast-track et la
Sol IglooBio-ServK3244Utilisation avec la souris Igloo et la cabane à
sourisFast-Track Bio-ServK3272, K3102 ou K3271
Crawl BallBio-ServK3330 ou K3329
Bio-hut Bio-ServK3352Cabane en pulpe de bois utilisée pour l’abri et la nidification
Film adhésif  ;VWR60941-072À utiliser pour couvrir temporairement le trou percé dans une grande cage afin d’empêcher les souris de s’échapper
Rack ventilé à flux laminaireTechniplastBio-C36L’armoire que nous avons utilisée dans cette étude n’est pas actuellement fournie. Le Bio-C36 est très similaire.
1,5 mL Tube Microfuge - Sans RNAse ni DNAseTout fournisseur
QIAamp DNA Stool MiniKitQiagen51504Ce kit fournit des réactifs pour 50 préparations d’ADN. Tampon de lyse des selles = ASL ; Tampon de lyse du chlorure de guanidinium = AL ; Tampon de lavage 1 avec chlorure de guanidinium = AW1 ; Tampon de lavage 2 = AW2 ; Tampon d’élution avec bain-marie EDTA = AE
(capable de chauffer à 95)Tout fournisseurPour une incubation à 94 degrés d’échantillons de selles pour lyser les cellules.
Bain d’eau (capable de chauffer à 70 degrés)Tout fournisseurPour l’incubation à 70 degrés d’échantillons de selles  ;
Éthanol (200 proof)Sigma AldrichE7023
Fluorimètre : QubitThermoFisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA large gamme Kit de dosageThermoFisher ScientificQ32850
EB Tampon ou 10 mM Tris pH 8.5Qiagen19086
Amorces spécifiques à l’expérienceTout fournisseur Qualité
PCR eau N’importequel fournisseur
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix  ;Kapa BiosystemsKK2601pour l’amplification d’amplicon (1,25 mL permet 100 rxns).
Agarose pour l’exécution de gels de diagnosticTout fournisseur
TapeStation Haute sensibilité D1000 Screen Tape TraceAgilent5067-5583TapeStation ou Bioanalyzer Les instruments sont courants dans les noyaux de génomique institutionnelle pour analyser la qualité des banques . Alternativement, un bioanalyseur DNA1000 puce (Agilent, 5067-1504) peut être utilisé.
Perles magnétiques Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880Perles magnétiques Pour le nettoyage par PCR - 5 mL nettoiera 250 réactions PCR
Support magnétiqueLife TechnologiesAM10027
bibliothèqueIlluminaIllumina. 16S Préparation de la bibliothèque de séquençage métagénomique : Préparation des amplicons de gènes d’ARN ribosomique 16S pour le système Illumina MiSeq. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
Logiciel unique à double indexationIlluminaIllumina Experiment ManagerDisponible gratuitement sur : https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 Index KitIlluminaFC-131-1002Utilisé pour ajouter des codes-barres aux amplicons
MicroAmp Optical 96-well reaction plateApplied Biosystems/ThermoFisherN8010560
TruSeq Index Plate FixtureIlluminaFC-130-1005
Joint adhésif transparentApplied Biosystems /ThermoFisher4360954Applied Biosystems/ThermoFisher Film adhésif Microamp
Séquençage par MiSeq avec réactifs v3 et double lecture 300 pbIlluminaMS-102-3003
Kit de contrôle PhiXIlluminaFC-110-3001
Protéinase K (600 mAU/ml)Qiagen19131Équivalent à 20 mg/ml de protéinase K. Fourni avec le kit QiaAmp
Outils d’analyse de donnéesLogiciel QiimeQIIMEL’installation peut différer en fonction de votre système et le site Web QIIME décrit plusieurs options (http://qiime.org/install/install.html). Pour cette étude, le progiciel MacQIIME 1.9.1 a été utilisé (compilé par Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime
Étape 13.2.QiimeFastQ, méthode Join  ;( http://code.google.com/p/ea-utils   ;).   ; Pour cette étude, plusieurs extrémités appariées ont été utilisées http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils : Outils en ligne de commande pour le traitement des données de séquençage biologique. Analyse d’expression, Durham, Caroline du Nord. (2011).
Étape 13.3.QiimeDe-Novo OTUhttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Étape 13.3.1.Unités taxonomiques ouvertes (UTO) à l’aide d’UclustEdgar, R.C. La recherche et le regroupement d’ordres de grandeur sont plus rapides que BLAST. Bioinformatique. 26 (19), 2460-2461, doi :10.1093/bioinformatics/BTQ461 (2010).
Étape 13.3.1.PynastPynastCaporaso, J.G. et al. PyNAST : un outil flexible pour aligner des séquences sur un alignement de modèle. Bioinformatique. 26 (2), 266-267, doi :10.1093/bioinformatics/BTP636 (2010).  ;
Étape 13.3.1.PynastPynast_GreengenesDeSantis, T.Z. et al. Greengenes, une base de données de gènes d’ARNr 16S vérifiée par chimère et un atelier compatible avec l’ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi :10.1128/AEM.03006-05 (2006). La version 13_8 de Greengenes a été utilisée dans cette étude
13.3.1. Remarque :  ;Qiimeplusieurs bibliothèques diviséeshttp://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Remarque :  ;QiimePick de novo OTUs scripthttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html  ;
Étape 13.2.2.QiimeCréez un fichier de mappagehttp://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Étape 13.2.2.QiimeValider un fichier de mappagehttp://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.
Étape 13.3.3.Lienentre l’OTU et l’exemple de description pour mapperle fichier http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Étape 13.3.4.Synthétisez les taxons à l’aide de graphiqueshttp://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Étape 13.3.5.QiimeBiome Résumer le tableauhttp://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  ; Dans cette étude, tous les échantillons ont été raramenés à 20 000 UTO suivis d’une analyse à l’aide d’un script de raréfaction alpha dans QIIME.
souris au sol Guide de préparation de la Le protocole de prélèvement

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