Protocole d’isolement de cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes de souris et leur Activation ultérieure In Vitro avec tumeur Complexes immuns

Nadine Santana-Magal; Diana Rasoulouniriana; Corey Saperia; Amit Gutwillig; Peleg Rider; Edgar G. Engleman; Yaron Carmi

doi:10.3791/57188

Article de méthode

Protocole d’isolement de cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes de souris et leur Activation ultérieure In Vitro avec tumeur Complexes immuns

DOI :

10.3791/57188

⸱

31 mai 2018

Nadine Santana-Magal^*¹ , Diana Rasoulouniriana^*¹ , Corey Saperia¹ , Amit Gutwillig¹ , Peleg Rider¹ , Edgar G. Engleman² , Yaron Carmi¹

¹Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel-Aviv University, ²Department of Pathology, School of Medicine, Stanford University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macrophages dérivés de monocytes DC (RCSCND) peut détecter de petites quantités de molécules associées à risque et sont donc facilement apprêté. Nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des RCSCND de sang et de tumeurs et de leur mise en route avec les complexes immuns tout en soulignant des précautions qui doivent être menées afin d’éviter leur activation prématurée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules dendritiques (DC) sont des populations de cellules hétérogènes qui diffèrent dans leur membrane cellulaire marqueurs, migratoires et leur distribution, ainsi que dans leur présentation de l’antigène et les capacités d’activation des lymphocytes T. Puisque les vaccins la plupart des modèles de tumeurs expérimentales nécessitent des millions de DC, ils sont largement isolés de la moelle osseuse ou de la rate. Cependant, ces DC diffèrent sensiblement du sang et tumeur DC dans leurs réponses à complexes immuns (IC) et probablement d’autres récepteurs couplés Syk lectine. Important, étant donné la sensibilité de la DC aux molécules associées à risque, la présence d’endotoxines ou anticorps récepteurs activation crosslink dans l’un de l’isoler les étapes pourrait entraîner l’amorçage du DC et ainsi influer sur les paramètres, ou du moins la dosage, pour les activer. Par conséquent, nous décrivons ici un protocole détaillé pour isoler le RCSCND de sang et les tumeurs tout en évitant leur activation prématurée. En outre, un protocole est fourni pour l’activation de RCSCND avec tumeur IC et leurs analyses subséquentes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Depuis leur découverte, les cellules dendritiques (DC) ont été au centre de recherches approfondies en raison de leur capacité unique à biaiser la différenciation des cellules de T¹. Depuis les dernières décennies, un effort de recherche approfondie a cherché à définir les divers sous-ensembles de DC et de leur fonction au cours de la progression tumorale et immunité ². Contrôleurs de domaine sont composés de populations de cellules hétérogènes qui ne diffèrent les uns des autres sur leurs récepteurs de reconnaissance de motifs, distribution tissulaire, et migrateurs et antigène présentation fonctionnalités

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les protocoles ci-dessous se référer à l’isolement des souris RCSCND, mais les principes généraux peuvent s’appliquer à d’autres cellules de sous-ensembles de DC, aussi bien. 12 - souris C57Bl/6j 16-semaines ont été maintenus dans une Association américaine pour l’animalerie Accreditation of Laboratory Animal Care accrédité. Tous les protocoles ont été approuvés par l’Université de Stanford et Tel-Aviv University Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme.

1. isolement de la tumeur associée dérivée DC

Dans une hotte à flux laminaire, enlever des tumeurs chez des souris de CO₂ euthanasiés et placer des tumeurs dans ....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au départ, nous avons comparé la capacité des anticorps de souris syngénique et allogéniques naïves pour lier les cellules tumorales. À cette fin, des lignées cellulaires tumorales B16F10 et LMP ont été fixées dans la paraformaldéhyde et lavées abondamment. B16F10 est une lignée de cellules de mélanome malin, qui a été isolée à l’origine de métastases pulmonaires chez les souris C57Bl/6. LMP est une cellule de tumeur du pancréas qui a été isolée chez KrasG12D / +, souris LSL-Trp53R172H / .......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vu le grand nombre de DC requis pour la vaccination de souris (environ 2-4 x 10⁶DC par une souris), la plupart de la vaccination stratégies chez les souris reposent sur l’isolement des DC de la BM et de la rate, suivie de leur activation ex vivo . Cependant, tente d’activer tumeur DC in vivo, en utilisant les mêmes conditions pour l’activation de la rate et BM DC, ont souvent échoué à produire une immunité efficace. Dans deux publications ultérieures, Carmi et al. ont trouvé que san.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts et qu’ils n’ont rien à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ficoll-Paque PREMIUM	GE-Healthcare	17-5442-02
OptiPrep	StemCell Technologies	07820
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-052-301
EasySep Monocyte Isolation	Kit StemCell Technologies	19861
Collagenase IV	Sigma	C9697-50MG	Tester chaque lot pour l’endotoxine
DNase I	Sigma	DN25-10MG
HBSS	ThermoFisher	14025092
FBS	ThermoFisher	16140071	Testez chaque lot pour l’endotoxine
PE-CD11c	Biolegend	117307
APC-CD11b	Biolegend	101211
Brilliant Violet 650 MHCII	Biolegend	107641
AF48- CD86	Biolegend	105017
APC/Cy7-Ly-C6	Biolegend	108423
PE/Cy7-CD15	Biolegend	135523

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
Mildner, A., Jung, S.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Monocyte derived Dendritic Cells Immune Complex Activation Tumor Cell Isolation Blood Cell Isolation Magnetic Bead Separation Density Gradient Centrifugation Flow Cytometry Analysis CD11b Cell Selection CFSE labeled Tumor Complex Dendritic Cell Activation

Protocole d’isolement de cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes de souris et leur Activation ultérieure In Vitro avec tumeur Complexes immuns

Dans cet article

Résumé

Résumé

Introduction

Protocole

Résultats

Discussion

Déclarations de divulgation

Matériaux

Références

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Articles connexes