Un rapide argent coloration protocole permettant Simple et efficace détection de marqueurs microsatellites à l’aide d’un Gel de Polyacrylamide Non dénaturants

Summary

Nous rapportons ici un protocole qui nécessite seulement trois réactifs et 7 min de traitement et est adapté pour la Géneration rapide des données de SSR de qualité dans l’analyse génétique de coloration à l’argent simple et peu coûteuse.

Abstract

Simple Sequence Repeat (SSR) est un des marqueurs plus efficaces utilisés dans la recherche en génétique animale et végétale et des programmes de sélection moléculaire. Coloration à l’argent est une méthode largement utilisée pour la détection des marqueurs dans un gel de polyacrylamide. Cependant, les protocoles classiques coloration à l’argent sont techniquement exigeants et chronophage. Comme de nombreux autres laboratoires biologiques techniques, protocoles de coloration à l’argent ont été constamment optimisés pour améliorer l’efficacité de la détection. Nous rapportons ici une coloration méthode significativement réduit les coûts de réactif et améliore la clarté de la résolution et la photo de détection simplifié à l’argent. La nouvelle méthode nécessite deux étapes principales (imprégnation et développement) et trois réactifs (nitrate d’argent, d’hydroxyde de sodium et formaldéhyde) et seulement 7 min de traitement pour un gel de polyacrylamide non dénaturant. Par rapport aux protocoles indiqués précédemment, cette nouvelle méthode est plus facile, plus rapide et utilise moins de réactifs chimiques pour la détection de la SSR. Par conséquent, ce protocole de coloration à l’argent simple, peu coûteux et efficace bénéficiera de cartographie génétique et la sélection assistée par une génération rapide de données marqueur SSR.

Introduction

Le développement de marqueurs PCR a révolutionné la science de la génétique des plantes et reproduction¹. Marqueurs microsatellites (SSR) sont parmi les marqueurs d’ADN plus polyvalents et les plus couramment utilisés. Leur génome large couverture, abondance, spécificité du génome et répétabilité sont quelques-uns des mérites des microsatellites en plus de leur héritage codominant pour la détection des hétérozygotes génotypes². Plusieurs études ont utilisé des microsatellites pour étudier la diversité génétique, suivre ascendance, établir des cartes de liaison génétique et cartographier les gènes pour les caractères écon....

Protocol

1. préparation des produits PCR des microsatellites

1. Préparer tous les produits chimiques et réactifs pour les réactions de PCR dont l’ADN modèle (30 ng/µL), mélange maître de PCR × 2 (contenant 2 × PCR tampon, 0,4 mM de chaque dNTP, 3 mM de MgCl₂, 0,1 U/µL de l’ADN polymérase Taq et colorants), 10 µM de chacun avant et marche arrière amorces et eau distillée ou désionisée (dH₂O).
   NOTE : Les marqueurs utilisés dans la présente étude ont été PT51333 (séquence d’amorce en avant : 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' et séquence inverse apprêt : 5 « - TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3 ») et PT50903 (séquence d’amorce en avant : 5 ' - AAATTTCTTTCG....

Results

Les amplicons PCR ont été produits en utilisant les paires d’amorces SSR correspondantes en floraison pak-choï et le tabac. Après électrophorèse, les gels de polyacrylamide sont colorées à l’aide de l’argent qui précède souillant le protocole, qui a détecté sans ambiguïté les patrons des bandes des microsatellites (Figure 1).

Pour comparer l’efficacité de la détection des différent argent souillant .......

Discussion

Le lavage de gel après l’imprégnation est une étape cruciale. Volume de l’eau et le temps lavage insuffisant pourrait l’élimination incomplète des solution d’imprégnation sur la surface de la plaque et le gel et provoquer dans un fond sombre. Le temps de développement approprié est une autre étape clé, développement excessif peut se traduire par un fond brun foncé avec une image de faible contraste de fragments d’ADN. En outre, l’étape d’imprégnation altèrent l’efficacité coloration des fragments d’ADN. Bien qu’allonger .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Master mix PCR (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, Chine	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 Marqueur d’ADN	Takara Bio Inc., Japon	#3590A
Base Tris	Sangon Biotech Shanghai, Chine	#77-86-1
Acide borique	Sangon Biotech Shanghai, Chine	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, Chine	#6381-92-6
Acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, Chine	#79-06-1
N,N'-méthylène-bis-acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, Chine	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sangon Biotech Shanghai, Chine	#110-18-9
Persulfate d’ammonium	Guangzhou Chemical Reagent Factory, Chine	#7727-54-0
Bind-silane	Solarbio Pékin, Chine	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Chine	#7761-88-8
Formaldehyde	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Chine	#50-00-0
Usine	réactifs chimiques NaOH Guangzhou, Chine	#1310-73-2
Acide acétique	Usine de réactifs chimiques de Guangzhou, Chine	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Chine	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory, Chine	#64-17-5
HNO< sub>3	Usine de réactifs chimiques de Guangzhou, Chine#	7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Chine	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Chine	#1787-61-7
Plateau en plastique	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,	China-TS-1
Shaker	Qilinbeter JiangSu,	Chine-BenQ
M800 Scanner	BenQ,
Alimentation	Beijing Liuyi Instrument Factory,	Chine-Haut
tout au long des systèmes de gel verticaux, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Chine	-