Ce protocole donne un aperçu des procédures d’isolement d’ARN pour le profilage de transcriptomique des tissus ganglionnaires de grands animaux, y compris les étapes dans l’identification et l’excision des ganglions lymphatiques du bétail et la faune, échantillonnage des approches pour assurer la cohérence entre plusieurs animaux et des considérations plus des résultats représentatifs pour la préservation de l’après la collecte et le traitement aux fins d’analyse de RNA.
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Article de méthode
Collecte et traitement des ganglions lymphatiques des animaux de grande taille pour l’analyse de l’ARN : préparation pour l’étude de transcriptomique ganglion des grandes espèces animales
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les grands animaux (bétail et la faune) servent d’importants réservoirs d’agents pathogènes zoonotiques, y compris les Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaet e. coliet sont utiles pour l’étude de la pathogenèse et/ou propagation de la bactérie dans ses hôtes naturels. Avec la touche de fonction des ganglions lymphatiques dans la réponse immunitaire de l’hôte, ganglion lymphatique tissus servent comme une source potentielle de l’ARN pour les analyses transcriptomiques en aval, afin d’évaluer les changements temporels dans l’expression des gènes dans les cellules au cours d’une infection. Cet article présente une vue d’ensemble du processus de ganglion lymphatique collection et prélèvement d’ARN en aval traitement du bétail, utilisant des bovins (Bos taurus) comme un modèle, avec des exemples supplémentaires fournis par le bison d’Amérique (Bison bison ). Le protocole contient des informations sur la localisation, l’identification et enlèvement des ganglions lymphatiques de plusieurs sites clés dans le corps. Par ailleurs, une méthode d’échantillonnage de biopsie est présentée qui permet une cohérence de l’échantillonnage à travers plusieurs animaux. Plusieurs considérations pour la conservation de l’échantillon sont examinées, y compris la production d’ARN adapté aux méthodologies en aval comme RNA-sequencing et RT-PCR. Par les longs délais inhérents aux gros animaux vs des études souris temps, des résultats représentatifs de bison et de tissus bovins ganglion sont présentés pour décrire l’évolution temporelle de la dégradation dans ce type de tissu, dans le cadre d’un examen de travaux méthodologique antérieurs sur la dégradation de l’ARN dans d’autres tissus. Dans l’ensemble, ce protocole sera utile pour les deux chercheurs vétérinaires en début du transcriptome projets sur grands échantillons d’animaux et de biologistes moléculaires intéressés par l’apprentissage de techniques pour échantillons in vivo et in vitro de traitement.
Introduction
RNA-sequencing analyse du transcriptome de ganglions lymphatiques offre la possibilité de caractériser la réponse immunitaire des animaux à une variété de pathogènes. Tandis que cette méthodologie a été utilisée intensivement chez les souris, les analyses ont récemment étendu dans les plus grands mammifères1,2. Bétail/gros ganglions animales peut être utilisées pour caractériser les réactions de l’hôte à une infection, non seulement pour leur utilisation dans les vaccins ou les études de susceptibilité génétique et l’identification de cibles pour le développement de médicaments, mais aussi comme systèmes modèl....
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Protocole
Les procédures de nécropsie animale représentées ici relèvent de protocoles IACUC approuvés au Centre National de la maladie animale, Ames, IA. Toutes les expériences ont été menées conformément aux principes directeurs adoptés pour la santé animale et le bien-être.
1. planification préalable avant l’autopsie
- Avant l’autopsie, préparer les documents suivants pour le transport à la suite de l’autopsie :
- rempli de 1,5 ou 2 tubes de microcentrifuge mL ~ 1,0 mL de solution de préservation de RNA, dans un conteneur de grille ou de transport. N’oubliez pas de suivre les directives du fabricant pour le rapport entre le volume de ....
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Résultats
L’utilisation des considérations présentées dans cet article (étapes 1 à 4 du protocole) aidera à la récupération de l’ARN de grands échantillons d’animaux qui convient à une analyse en aval dans les études d’expression génique hôte. La qualité de RNA pour applications en aval est évaluée par plusieurs mesures standards. Pour spectrophotométrie, la A/a260280 ratio donne une mesure de la contamination de la protéine, et l’A260/a230 ratio fournit un autre moyen d’évaluation de pu.......
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Discussion
La majorité des études transcriptomique et les protocoles associés se consacrée sur la souris, le rat ou post-mortem des échantillons humains. Cependant, enquêtes du bétail et la faune offrent un large éventail de possibilités pour la caractérisation de la réponse immunitaire à la maladie, tant qu’il y a lieu, à la médecine vétérinaire et, en ce qui concerne les maladies zoonotiques, pour la santé publique humaine. Ce protocole a donné un aperçu des considérations clés pour l’extraction de l’ARN haute intégrité des tissu.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer. Toute la recherche est financée avec des fonds intra-muros de la U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Toutes les références à des produits spécifiques sont fournis dans le but de reproductibilité expérimentale et ne constituent pas un endossement de ces produits par le gouvernement fédéral.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier James Fosse pour son excellent travail sur tous les vidéographie et traitement vidéo ; Michael Marti pour son excellent travail dans la génération des images numérisées de bétail ; Lilia Walther pour son aide avec l’extraction de l’ARN et Bioanalyzer s’exécute ; Mitch Palmer et Carly Kanipe pour leur examen utile et commentaires sur les images de ganglion lymphatique ; et le soin des animaux et du personnel vétérinaire à l’Animal National Disease Center pour l’ensemble de leur travail acharné et l’aide à l’élevage et la préparation des autopsies.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution de conservation de l’ARN (nous avons utilisé RNALater pour toutes les expériences) | ThermoFisher | AM7020 | |
| 1,5 ml ou 2 ml tubes à centrifuger en polypropylène ; | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Scalpels jetables | Daigger Scientific | EF7281 | |
| Pince à tissus, dent de rat | Fisher Scientific | 12-460-117 | Autres pinces à tissus disponibles, y compris pointe incurvée, bord effilé, etc. , dépend de la préférence de l’utilisateur |
| Aiguilles de biopsie à l’emporte-pièce de 3 mm | Fisher Scientific | NC9949469 | |
| Conteneur pour objets tranchants (petit et transportable pour la nécropsie) | Stericycle | 8900SA | Taille de 1 pinte illustrée ici |
| Planches à découper ou plateaux jetables | Fisher Scientific | 09-002-24A | Disponible dans une variété de tailles, selon les préférences de l’utilisateur |
| Équipement | Varie selon l’agent pathogène (gants, masques respiratoires, lunettes, etc.) | ||
| Réactif d’extraction d’ARN à base de phénol (nous avons utilisé le réactif TRIzol pour toutes les expériences) | Kit | ThermoFisher 15596026 | |
| Silica (nous avons utilisé le kit PureLink RNA Mini pour toutes les expériences) | ThermoFisher | 12183018A | Conçu pour jusqu’à 100 mg de tissu |
| 100 % éthanol (200 proof pour la biologie moléculaire) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Homogénéisateur de tissus avec tubes d’homogénéisation fermés (nous avons utilisé le dissociateur gentleMACS pour toutes les expériences) | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Agarose (Général, pour l’électrophorèse sur gel) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 1X TBE | Fisher Scientific | BP24301 | Peut également fabriquer à partir de zéro en laboratoire |
| Formamide déionisé | EMD Millipore | S4117 | |
| Dodécylsulfate de sodium | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Bleu de bromophénol | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Xylène cyanol ; | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| (nous avons utilisé le spectrophotomètre NanoDrop) | Appareil ThermoFisher | ND-2000 | |
| pour l’évaluation quantitative de l’ARN (nous avons utilisé le bioanalyseur, avec les composants et protocoles associés) | Agilent | G2939BA | |
| Kit d’extraction d’ARN FFPE (nous avons utilisé le kit d’isolement d’acides nucléiques totaux RecoverAll pour les tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine) | ThermoFisher | AM1975 | |
| Épandeur en plastique (épandeur en forme de L) | Fisher Scientific | 14-665-231 | Uniquement nécessaire pour les tests de stérilité pour les échantillons d’animaux infectés Couteaux de |
| nécropsie | Livestock Concepts | WI-0009209 |
Références
- Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10 (6), e0131459(2015).
- Miller, L. C., et al.
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Réimpressions et autorisations
