Collecte et traitement des ganglions lymphatiques des animaux de grande taille pour l’analyse de l’ARN : préparation pour l’étude de transcriptomique ganglion des grandes espèces animales

Summary

Ce protocole donne un aperçu des procédures d’isolement d’ARN pour le profilage de transcriptomique des tissus ganglionnaires de grands animaux, y compris les étapes dans l’identification et l’excision des ganglions lymphatiques du bétail et la faune, échantillonnage des approches pour assurer la cohérence entre plusieurs animaux et des considérations plus des résultats représentatifs pour la préservation de l’après la collecte et le traitement aux fins d’analyse de RNA.

Abstract

Les grands animaux (bétail et la faune) servent d’importants réservoirs d’agents pathogènes zoonotiques, y compris les Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaet e. coliet sont utiles pour l’étude de la pathogenèse et/ou propagation de la bactérie dans ses hôtes naturels. Avec la touche de fonction des ganglions lymphatiques dans la réponse immunitaire de l’hôte, ganglion lymphatique tissus servent comme une source potentielle de l’ARN pour les analyses transcriptomiques en aval, afin d’évaluer les changements temporels dans l’expression des gènes dans les cellules au cours d’une infection. Cet article présente une vue d’ensemble du processus de ganglion lymphatique collection et prélèvement d’ARN en aval traitement du bétail, utilisant des bovins (Bos taurus) comme un modèle, avec des exemples supplémentaires fournis par le bison d’Amérique (Bison bison ). Le protocole contient des informations sur la localisation, l’identification et enlèvement des ganglions lymphatiques de plusieurs sites clés dans le corps. Par ailleurs, une méthode d’échantillonnage de biopsie est présentée qui permet une cohérence de l’échantillonnage à travers plusieurs animaux. Plusieurs considérations pour la conservation de l’échantillon sont examinées, y compris la production d’ARN adapté aux méthodologies en aval comme RNA-sequencing et RT-PCR. Par les longs délais inhérents aux gros animaux vs des études souris temps, des résultats représentatifs de bison et de tissus bovins ganglion sont présentés pour décrire l’évolution temporelle de la dégradation dans ce type de tissu, dans le cadre d’un examen de travaux méthodologique antérieurs sur la dégradation de l’ARN dans d’autres tissus. Dans l’ensemble, ce protocole sera utile pour les deux chercheurs vétérinaires en début du transcriptome projets sur grands échantillons d’animaux et de biologistes moléculaires intéressés par l’apprentissage de techniques pour échantillons in vivo et in vitro de traitement.

Introduction

RNA-sequencing analyse du transcriptome de ganglions lymphatiques offre la possibilité de caractériser la réponse immunitaire des animaux à une variété de pathogènes. Tandis que cette méthodologie a été utilisée intensivement chez les souris, les analyses ont récemment étendu dans les plus grands mammifères^1,2. Bétail/gros ganglions animales peut être utilisées pour caractériser les réactions de l’hôte à une infection, non seulement pour leur utilisation dans les vaccins ou les études de susceptibilité génétique et l’identification de cibles pour le développement de médicaments, mais aussi comme systèmes modèl....

Protocol

Les procédures de nécropsie animale représentées ici relèvent de protocoles IACUC approuvés au Centre National de la maladie animale, Ames, IA. Toutes les expériences ont été menées conformément aux principes directeurs adoptés pour la santé animale et le bien-être.

1. planification préalable avant l’autopsie

1. Avant l’autopsie, préparer les documents suivants pour le transport à la suite de l’autopsie :
   1. rempli de 1,5 ou 2 tubes de microcentrifuge mL ~ 1,0 mL de solution de préservation de RNA, dans un conteneur de grille ou de transport. N’oubliez pas de suivre les directives du fabricant pour le rapport entre le volume de ....

Results

L’utilisation des considérations présentées dans cet article (étapes 1 à 4 du protocole) aidera à la récupération de l’ARN de grands échantillons d’animaux qui convient à une analyse en aval dans les études d’expression génique hôte. La qualité de RNA pour applications en aval est évaluée par plusieurs mesures standards. Pour spectrophotométrie, la A/a₂₆₀₂₈₀ ratio donne une mesure de la contamination de la protéine, et l’A260/a₂₃₀ ratio fournit un autre moyen d’évaluation de pu.......

Discussion

La majorité des études transcriptomique et les protocoles associés se consacrée sur la souris, le rat ou post-mortem des échantillons humains. Cependant, enquêtes du bétail et la faune offrent un large éventail de possibilités pour la caractérisation de la réponse immunitaire à la maladie, tant qu’il y a lieu, à la médecine vétérinaire et, en ce qui concerne les maladies zoonotiques, pour la santé publique humaine. Ce protocole a donné un aperçu des considérations clés pour l’extraction de l’ARN haute intégrité des tissu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution de conservation de l’ARN (nous avons utilisé RNALater pour toutes les expériences)	ThermoFisher	AM7020
1,5 ml ou 2 ml tubes à centrifuger en polypropylène  ;	Fisher Scientific	05-408-129
Scalpels jetables	Daigger Scientific	EF7281
Pince à tissus, dent de rat	Fisher Scientific	12-460-117	Autres pinces à tissus disponibles, y compris pointe incurvée, bord effilé, etc. , dépend de la préférence de l’utilisateur
Aiguilles de biopsie à l’emporte-pièce de 3 mm	Fisher Scientific	NC9949469
Conteneur pour objets tranchants (petit et transportable pour la nécropsie)	Stericycle	8900SA	Taille de 1 pinte illustrée ici
Planches à découper ou plateaux jetables	Fisher Scientific	09-002-24A	Disponible dans une variété de tailles, selon les préférences de l’utilisateur
Équipement			Varie selon l’agent pathogène (gants, masques respiratoires, lunettes, etc.)
Réactif d’extraction d’ARN à base de phénol (nous avons utilisé le réactif TRIzol pour toutes les expériences)	Kit	ThermoFisher 15596026
Silica (nous avons utilisé le kit PureLink RNA Mini pour toutes les expériences)	ThermoFisher	12183018A	Conçu pour jusqu’à 100 mg de tissu
100 % éthanol (200 proof pour la biologie moléculaire)	Sigma-Aldrich	E7023
Homogénéisateur de tissus avec tubes d’homogénéisation fermés (nous avons utilisé le dissociateur gentleMACS pour toutes les expériences)	Miltenyi Biotec	130-093-235
Agarose (Général, pour l’électrophorèse sur gel)	Sigma-Aldrich	A9539
1X TBE	Fisher Scientific	BP24301	Peut également fabriquer à partir de zéro en laboratoire
Formamide déionisé	EMD Millipore	S4117
Dodécylsulfate de sodium	Sigma-Aldrich	L3771
Bleu de bromophénol	Sigma-Aldrich	114391
Xylène cyanol  ;	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique)	Sigma-Aldrich	EDS
(nous avons utilisé le spectrophotomètre NanoDrop)	Appareil ThermoFisher	ND-2000
pour l’évaluation quantitative de l’ARN (nous avons utilisé le bioanalyseur, avec les composants et protocoles associés)	Agilent	G2939BA
Kit d’extraction d’ARN FFPE (nous avons utilisé le kit d’isolement d’acides nucléiques totaux RecoverAll pour les tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine)	ThermoFisher	AM1975
Épandeur en plastique (épandeur en forme de L)	Fisher Scientific	14-665-231	Uniquement nécessaire pour les tests de stérilité pour les échantillons d’animaux infectés Couteaux de
nécropsie	Livestock Concepts	WI-0009209