Hypofonction de la glande salivaire est une conséquence fréquente du traitement de la maladie et le rayonnement auto-immune. L’évaluation reproductible de fonction des glandes salivaires chez les modèles murins de ces maladies est un défi technique. Ici, on décrit une méthode simple pour la mesure précise et reproductible de la production de salive chez les souris.
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Article de méthode
Une méthode pour la mesure de la fonction des glandes salivaires chez les souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les patients atteints du syndrome de Sjögren, une maladie auto-immune affectant les glandes exocrines, développent une inflammation des glandes salivaires et ont réduit la production de salive. De même, la production de salive est gravement compromise chez les patients recevant des traitements de radiothérapie pour les cancers de la tête et du cou. Les modèles de rongeurs, mis au point pour imiter ces conditions cliniques, facilitent la compréhension de la pathogenèse de la maladie et permettant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par conséquent, la capacité pour mesurer la fonction des glandes salivaires chez les modèles animaux avec précision, de façon reproductible et à plusieurs reprises est essentielle. S’appuyant sur des procédures décrites précédemment dans la littérature, a développé une méthode qui remplit ces critères et a été utilisé pour évaluer la fonction des glandes salivaires chez les souris. Un autre avantage de cette nouvelle méthode est qu’elle est facilement maîtrisée et a peu de variation entre opérateurs. Fonction des glandes salivaires est évaluée comme la quantité (poids ou volume) ou le taux (mL/min) de la salive produite en réponse à la stimulation de la pilocarpine. La salive est une bonne source pour l’analyse de la teneur en protéines, les concentrations de l’immunoglobuline et autres biomolécules.
Introduction
Les glandes salivaires produisent la salive en réponse à divers stimuli neurologiques et mécanique1. Les stimuli sont transportés à travers le système nerveux sympathique et parasympathique sur les récepteurs adrénergiques et cholinergiques dans la glande. Pilocarpine est un agent cholinergique, para-sympathomimétique qui agit principalement sur les récepteurs muscariniques. Dans la glande salivaire, il induit la production de salive en agissant sur les récepteurs muscariniques de l’acétylcholine M31. La production de salive après l’administration de pilocarpine est un indicateur de la capacité des glandes salivaires à répondre à la stimulation et est couramment utilisée comme mesure de la fonction des glandes salivaires.
Une mesure précise de la production de salive est critique dans l’étude des maladies des glandes salivaires, y compris le syndrome de Sjögren2 et rayonnements des blessures suite de traitement du cancer de tête et le cou3. Plusieurs méthodes différentes ont été développées pour mesurer la production de salive chez les rongeurs. Il s’agit de canulation directe du excréteur salivaire conduit4, la collecte de salive de la cavité buccale sous vide5et la collection à l’aide de capillaires de verre6 ou une micropipette7,,8, 9. direct canulation du canal salivaire fournit la plus exacte et pure de salive. Toutefois, il s’agit d’une procédure techniquement difficile, et le potentiel de causer des lésions canalaires n’empêche collections répétitives de salive de l’animal même. Collecte de salive sous vide peut conduire à des résultats variables en raison de l’assèchement de la salive dans le tube. Cette perte est encore exagérée chez les souris avec diminution de la salivation. Capillaires en verre permettent la collecte de salive pour les analyses suivantes, cependant, changements de viscosité de la salive sécrétée dans l’état du malade permet un remplissage efficace du capillaire. Plus loin, tentatives de balayer la cavité buccale afin de recueillir la salive résiduelle peuvent entraîner blessures. La méthode de la pipette permet de collection complète, et pour le même opérateur, il est remarquablement constant entre les expériences. Toutefois, pour des raisons inconnues, cette méthode montre une variation importante entre les différents opérateurs. Par conséquent, pour permettre des comparaisons appropriées, il devient impératif que le même opérateur effectue toutes les expériences liées à un projet spécifique. De toute évidence, il s’agit d’un inconvénient majeur pour un laboratoire.
Pour surmonter ces problèmes, il a développé une méthode que les méthodes de collecte de salive combine utilisé pour les humains et les rongeurs. La méthode de l’écouvillon, décrite ci-dessous pour mesurer le volume de salive induite par la pilocarpine est simple, reproductible, non influencé par l’opérateur et peut être effectuée à plusieurs reprises chez le même animal. En outre, il permet de recueillir la salive pour les analyses subséquentes des protéines, les immunoglobulines ou les autres biomolécules.
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Protocole
Le protocole décrit ci-après a été approuvé par le Comité de l’emploi et d’institutionnels animalier et il suit les directives éthiques établies par le National Institutes of Health. Toutes les données présentées dans ce rapport ont été générées en utilisant des souris femelles qui étaient de 10-12 semaines d’âge. La suite de variétés de souris ont été utilisée : C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S et F1 (B6XA/J). Toutes les souris ont été logés dans des cages de barrière (5 animaux par cage) dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes et fournis nourriture et eau ad libitum.
1. préparation
- Pour préparer une solution mère de chlorhydrate de pilocarpine, peser 10 mg du composé et dissoudre dans 1,776 mL de sérum physiologique isotonique stérile au Vortex, pour donner une solution mère de 5,63 mg/mL. Il n’y a pas besoin de stériliser cette solution. Mais si vous le souhaitez, la filtrer à travers un filtre de 0,2 µM. Enregistrez cette solution-mère dans plusieurs parties aliquotes dans un congélateur à-80 oC pendant 3 mois. Chaque stock congelé est à usage unique. Une fois décongelé, ne pas recongeler la solution de la pilocarpine.
- Prenez 0,6 mL microtubes et soigneusement percez un petit trou dans le fond de chaque tube avec une aiguille de calibre 18 chauffée. La valeur de ces tubes en tubes de 2 mL. Les tubes ne sont pas nécessairement stériles.
- À l’aide d’une lame de rasoir sharp, stérile, dépecée cylindriques écouvillons absorbants environ 2 cm de longueur. Couper chaque morceau de 2 cm en diagonale pour donner 2 écouvillons en forme coniques. Placez un écouvillon dans chacun des microtubes à centrifuger 0,6 mL.
- Peser le tube à centrifuger 0,6 mL contenant l’écouvillon sec.
- Transférer les souris à étudier dans une nouvelle cage propre avec des bouteilles d’eau. Gardez les souris sans nourriture pendant au moins 2 h avant le début du prélèvement de salive pour empêcher les particules alimentaires de contaminer la salive prélevée.
Remarque : Il n’est pas nécessaire de garder 1 souris par cage pour cette procédure. Cependant, le nombre de souris placés dans chaque cage dépend de l’établissement des règles et règlements pour l’utilisation des animaux. - Juste avant la fin de 2 h, préparer la solution de travail de pilocarpine (0,0563 mg/mL) en diluant la solution stock 100 x dans une solution saline stérile. Il n’est pas nécessaire de filtre plu stériliser cette solution. Gardez toujours la solution de pilocarpine de travail sur la glace.
Remarque : Le tableau 1 donne la quantité de pilocarpine à doser pour une gamme de poids de corps de la souris pour donner une dernière dose de 0,375 mg/kg de poids corporel.
2. mode opératoire
- Peser chaque souris et la dose du mélange anesthésique pour chaque souris à l’aide du tableau 1. Injecter la première souris avec le volume approprié du mélange anesthésique par voie intrapéritonéale. Réglez la minuterie pendant 2 min (souches de souris la plupart testés dans ce protocole aller dormir en 2 min). Veiller à ce que la souris est correctement anesthésiée par manque de marche lorsqu’il est placé sur une surface plane. Si la souris est toujours à pied, attendez supplémentaire 2 min avant de passer à l’étape suivante. Appliquez une goutte de lubrifiant pommade ophtalmique à deux yeux pour éviter le dessèchement.
Remarque : Dans le tableau 1, la dose du mélange anesthésique est 0,007 mL/g de poids corporel. La gamme optimale pour cette procédure est de 0,006 à 0,008 mL/g de poids corporel. Cependant, après 4 min, si la souris est toujours marcher ou présentant des mouvements saccadés, consulter le vétérinaire institutionnel pour bien augmenter la dose de l’anesthésique. - Déterminer la dose de pilocarpine pour la souris à l’aide du tableau 1 et injecter la quantité appropriée par voie intrapéritonéale. Réglez la minuterie pendant 2 min et insérez le tube de drisse de 50 mL de la souris jusqu'à ce que la tête et les oreilles s’en tenir sur l’extrémité coupée. Placer le tube à un angle de 45 degrés, avec la tête en bas et la face ventrale vers le haut. Scotchez le tube à l’Office de procédure pour l’empêcher de bouger.
NOTE : Le tableau 1 fournit la posologie pour souris de plus de 17 g, que cette procédure n’a pas été tentée sur des souris pesant moins de 17 g. - À la fin de 2 min, doucement reposer une paire fermée de micro dissection forceps dans la bouche, puis soulever la mâchoire inférieure vers le haut pour ouvrir la bouche. Poussez la pince 1-2 mm plus loin dans la bouche, en vous assurant que la langue est vu reposant sur le bras supérieur de la pince. Avec une autre paire de pinces fines, tenir l’écouvillon sec préalablement pesé près de sa pointe conique.
- Faites doucement glisser l’extrémité conique de l’écouvillon dans la bouche. Retirer les pinces tout en laissant l’extrémité de l’écouvillon dans la cavité buccale.
- Saisissez l’extrémité la plus large de l’écouvillon s’étendant à l’extérieur de la bouche et tourner pour permettre à la superficie maximale de contact avec la bouche. Garder l’écouvillon dans cette position pendant 15 min.
Remarque : Ceci assure que l’écouvillon reste dans la bouche pendant la durée de la collection. Notez que l’extrémité conique de l’écouvillon agit comme une mèche et la partie plus large de l’écouvillon reste en dehors de la bouche. - À la fin de 15 min, doucement tourner l’écouvillon pour collecter une salive qui n’a pas été absorbée et placer l’écouvillon humide dans le tube à centrifuger 0,6 mL. Fermer le tube et mettez-le dans le tube 2 mL mis dans la glace.
NOTE : Pour l’instant, la muqueuse buccale paraîtra complètement sec. La souris peut maintenant être déplacée retour dans sa cage pour la récupération de l’anesthésie. - Transférer la souris dans la cage. Placer les boulettes de nourriture humide dans la cage après prélèvement de salive pour aider plus rapide réhydratation.
Remarque : Les souris réveillent avec 10 min après la fin de la collection. Injection sous-cutanée d’une solution saline isotonique préchauffé 0,2 mL peut également être indiquée pour accélérer la reprise. - Passez à la prochaine souris. Toutes les souris doivent être surveillés jusqu'à ce qu’ils ont complètement récupéré et sont ambulatoires.
3. les mesures
- À la fin de toutes les collections, peser les tubes de 0,6 mL avec l’écouvillon humide. Calculer la différence entre le poids et le poids sec pour obtenir le poids de la salive produite. Placer le tube de 0,6 mL avec de la salive dans le tube 2 mL.
- Couper les bouchons des tubes de 2 ml. Puis, centrifuger les tubes de 2 mL pendant 2 min à 7500 x g, à 4 ° c dans une centrifugeuse micro pour récupérer la salive. Mesurer le volume de salive obtenue à l’aide d’une micropipette.
- Exprimer les résultats comme la salive poids (mg)10 durant 15 min ou en proportion du poids de salive (mg) / poids (g) de la souris.
Remarque : Si on a mesuré le volume de salive extraite hors de l’écouvillon, exprimer les résultats en volume de salive récupéré (mL) ou le rapport du volume de salive (mL) / poids (g) de souris.
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Résultats
Dans les systèmes de modèle expérimental de souris, la capacité à produire de la salive en réponse à la stimulation de la pilocarpine est utilisée comme un indicateur de fonction des glandes salivaires. La production de salive a été mesurée chez des souris femelles C57BL/6 11 semaines par la méthode de l’écouvillon. Dans la Figure 1 a, les résultats sont exprimés comme la quantité de salive (mg) recueillie suite à des doses croissantes de la pilocarpine. À la...
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Discussion
La production de salive est un processus complexe et dépend de nombreux facteurs. Par conséquent, la fonction des glandes salivaires chez les animaux de laboratoire de mesure peut être un défi. Un autre défi est que des mesures répétées de la fonction des glandes salivaires chez le même animal sont tenus d’établir l’apparition de la maladie ou de démontrer la récupération après un traitement.
L’écouvillonnage décrite dans le présent rapport est techniquement simple à réaliser avec de multiples...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Remerciements
L’étude a été financée par une subvention du National Institutes of Health, National Institute of Dental and Craniofacial Research (DE025030).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Produits chimiques pour la collecte de la salive | |||
| Chlorhydrate de pilocarpine | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Diluer dans une solution saline isotonique stérile. Conservez les aliquotes à usage unique du stock 100X à -80oC |
| Name< | strong>Company | Catalog Number | <>Comments |
| Anesthesia Mix | Mix 1 mL de chlorhydrate de kétamine + 0,5 mL de xylazine + 8,5 mL de solution saline isotonique stérile dans un flacon stérile. Peut être utilisé pendant 3 mois. | ||
| Zetamine (chlorhydrate de kétamine) | Vet One, Boise, Idaho, USA | Le stock C3N VT1 | est de 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock est de 20 mg/mL |
| Saline isotonique stérile | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Utilisé comme diluant |
| Lacune artificielle (pommade ophtalmique lubrifiante) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Utilisé pour empêcher les yeux de se dessécher pendant la procédure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matériaux pour la collecte de salive | |||
| SalivaBio Children’s écouvillon | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Écouvillons emballés individuellement Tubes en |
| polypropylène de 50 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Coupez la partie inférieure du tube de 1 cm. Assurez-vous que le bord de coupe est lisse. |
| Microtubes à centrifuger 0,6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Faire des trous dans le fond du tube avec des aiguilles chauffées de calibre 18 Tubes |
| microcentrifuger 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Seringues à insuline avec aiguilles fixées en permanence | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| Aiguilles | à biseau régulier de calibre 18Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, États-Unis | 305195 | |
| Lame de scalpel stérile #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Pince de microdissection | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Pointe angulaire dentelée de 0,8 mm, longueur 4 |
| Ruban d’étiquette | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| Minuterie 3 canaux | Amazon.com, Seattle, WA, États-Unis | B06W2KCYVN | |
| Balance analytique | Mettler Toledo, Columbus OH, États-Unis | ||
| strong>Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Comments |
| >Chemicals/ réactifs pour induire un dysfonctionnement salivaire | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, États-Unis | tlrl-b5lps | Dissoudre dans de l’eau exempte d’endotoxines et conserver la solution mère à 5 mg/mL . diluer dans un HBSS stérile 100 μg/ml - injecter 100 μl / moue ip |
| Imject Adjuvant d’alun | Thermo Scientific | 77161 | Diluer 1:1 dans une solution saline stérile. Injecter par voie intrapéritonéale 0,1 mL/souris |
| Antisérum anti-Ro52 pour lapin | Généré en laboratoire | Immunisation des lapins avec la souris recombinante Ro52 | |
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Comments |
| >Chemicals/ Kits pour analyses salivaires | |||
| Estimation du lysozyme salivaireEnzChek | |||
| Lysozyme | Assay Kit Molecular Targets, Eugene, OR, USA | E-22013 | Utilisé selon les instructions du fabricant |
| Name | Company | Numéro de catalogue | Comments |
| Estimation des IgA salivaires salivaires par ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, Alabama, États-Unis | 0106-01 | Normes pour les ELISA sandwich - plage de 30 ng/mL à 0,5 ng/mL IgA |
| anti-souris de chèvre non étiquetée | Southern Biotech, Birmingham, Alabama, États-Unis | 1040-01 | Enrobage à 1 ug/mL dans un tampon de bicarbonate |
| IgA anti-souris de chèvre HRP | Southern Biotech, Birmingham, Alabama, États-Unis | 1040-05 | Détection Anticorps utilisé à une dilution 1:4000 |
| Substrat TMB | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, États-Unis | 555214 Utilisé | selon les instructions du fabricant |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 plaques de puits | Thermo Scientific, Rochester, NY, États-Unis | 3855 | |
| Name | Company | Numéro de catalogue | Comments |
| Estimation des protéines salivaires | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | Pour l’estimation des protéines selon les instructions du fabricant |
Références
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
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Réimpressions et autorisations
