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Article de méthode

Souris foetale Cardiovascular Imaging à l’aide d’un système à ultrasons de haute fréquence (30 / 45MHZ)

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DOI :

10.3791/57210

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5 mai 2018

1Neonatal/Congenital Heart Laboratory, Cardiovascular Research Laboratory, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Children's Discovery and Innovation Institute, Department of Pediatrics, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Dans cet article

Résumé

Échographie haute fréquence de la souris fœtale s’est améliorée d’imagerie de résolution et peut fournir une caractérisation non invasive précise du développement cardiaque et vices de construction. Le protocole décrit dans les présentes est conçu pour effectuer en temps réel de souris foetales échocardiographie in vivo.

Résumé

Cardiopathies congénitales (cardiopathies congénitales) sont la cause la plus fréquente de morbidité infantile et de mortalité précoce. Dépistage prénatal des mécanismes moléculaires sous-jacents des cardiopathies congénitales est crucial pour inventer de nouvelles stratégies préventives et thérapeutiques. Modèles de souris mutantes sont des outils puissants pour découvrir de nouveaux mécanismes et modificateurs de stress environnemental qui animent le développement cardiaque et leur altération potentielle dans les cardiopathies congénitales. Toutefois, les efforts pour établir la causalité de ces collaborateurs présumés ont été limitées à des études histologiques et moléculaires lors des expérimentations animales sans survie, dans le contrôle des principaux paramètres physiologiques et hémodynamiques qui sont souvent absent. La technologie d’imagerie Live est devenu un outil essentiel pour établir l’étiologie des cardiopathies congénitales. En particulier, l’échographie peut être utilisé avant la naissance sans exposer chirurgicalement les foetus, ce qui permet de maintenir leur physiologie de base tout en surveillant l’impact des stress environnementaux sur les aspects structurels et hémodynamiques de chambre cardiaque développement. Ici, nous utilisons le système d’ultrasons haute fréquence (30/45) pour examiner le système cardiovasculaire chez la souris foetales à E18.5 dans l’utérus à la ligne de base et en réponse à l’exposition prénatale de l’hypoxie. Nous avons démontré la faisabilité du système pour mesurer la taille de chambre cardiaque, la morphologie, la fonction ventriculaire, du rythme cardiaque fœtal et indices de débit de l’artère ombilicale et leurs altérations foetale souris exposées à une hypoxie chronique systémique dans l’utérus en temps réel temps.

Introduction

Malformations congénitales du coeur sont des défauts de structure hétérogènes qui se produisent au début du développement cardiaque. Les progrès techniques actuels de procédures opérationnelles ont conduit à des améliorations significatives dans les taux de survie des nourrissons atteints de cardiopathies congénitales1,2. Cependant, qualité de vie est souvent compromise secondaire à une hospitalisation prolongée et les besoins pour la mise en scène de réparation chirurgicale procédures1,2,3,4,5. Dépistage prénatal des mécanismes moléculaires sous-jacents des cardiopathies congénitales est cruciale afin de planifier les interventions précoces, pour réaliser de nouvelles stratégies de prévention et d’améliorer les résultats permanente6,7.

Bien que plusieurs facteurs génétiques et environnementaux ont été impliqués dans la pathogenèse des cardiopathies congénitales, établissant le lien de causalité demeure un besoin non comblé pour améliorer le diagnostic, thérapeutique et les stratégies de prévention1,8,9 ,10,11,12. En outre, examinant le rôle des facteurs de stress dans l’utérus et modificateurs épigénétiques ouvre des nouveaux sites pour les recherches futures11,12. La dernière décennie a en effet assisté à des progrès rapides dans la prochaine génération technologie de séquençage notamment nucléotide simple (SNP) de polymorphisme microarray, séquençage de l’exome ensemble et études de méthylation de l’échelle du génome, leur utilisation dans l’étude de la génétique les causes des maladies humaines complexes, dont cardiopathies congénitales1,8,9,10,11 ouvrant la voie à identifier de nouvelles mutations et variants génétiques qui n’ont pas encore été testés pour leur pouvoir pathogène chez les modèles animaux appropriés.

Parmi les systèmes de modèle différent de la maladie, la souris est le modèle animal de choix, non seulement pour l’étude des mécanismes des cardiopathies congénitales au cours des premiers cardiogenesis13,14,15,16, mais aussi d’élucider leur impact sur la maturation de la chambre cardiaque et fonction à la fin de gestation dans les facteurs de stress prénatal et périnatal. Exécution en vivo caractérisation phénotypique d’un coeur de souris fœtales mutante, durant les stades précoces et tardifs du développement, est donc important de comprendre le rôle de ces variations génétiques et des facteurs environnementaux sur le développement cardiaque, et le futur potentiel impact sur les processus de maturation particuliers chambre chez la souris.

La détection précoce et un diagnostic précis de malformations cardiaques au cours du développement est essentielle pour interventionnelle planification17,18. Être simple, pratique, portable et reproductibles, l’échographie foetale est en effet devenue la norme technique pour l’évaluation cardiaque dans la clinique d’imagerie. Évaluation de la circulation foetale à l’aide de l’échographie Doppler a été utilisée en pratique clinique non seulement pour la détection des anomalies cardiaques, mais aussi de détecter les anomalies vasculaires, insuffisance placentaire et restriction de croissance intra-utérine et d’évaluer le foetus bien-être en réponse à in utero insultes dont une hypoxémie, maladie maternelle et drogues toxicité17,18. En parallèle à sa valeur dans l’évaluation des maladies et défauts humains, évaluation ultrasonique des souris foetales a gagné utilité croissante en paramètres expérimentaux19,20,21,22, 23. En particulier, l’échographie cardiaque fœtale (échocardiographie) permet séquentiel en vivo la visualisation du cœur en développement. Nombreuses études expérimentales ont utilisé la technologie d’imagerie par ultrasons pour observer le développement foetal cardiovasculaire chez des souris transgéniques foetales. Échographie Doppler a été particulièrement utile pour élucider les paramètres physiopathologiques, tels que les modèles d’écoulement dans la circulation foetale sous problèmes physiologiques ou maladie conditions10,19. Chez les humains et les animaux, anormale sanguine flux ou de l’oxygène dans le fœtus peut résulter de diverses conditions qui peuvent perturber environnement foetal in utero et influer sur l’axe fœtoplacentaire, y compris les anomalies placentaires, hypoxie maternelle, diabète gestationnel et constriction vasculaire induite pharmaceutiquement15,22. Par conséquent, portant fixation de méthodes normalisées permettant d’effectuer des échographies Doppler foetal chez la souris énormément habiliteront les futures études des cardiopathies congénitales en facilitant la surveillance des débits et des indices hémodynamiques clés des circuits cardiovasculaires au cours différents stades de développement cardiaque dans les modèles de souris génétique.

Échographie de haute fréquence est devenue un outil puissant pour mesurer les paramètres physiologiques et de développement du système cardio-vasculaire dans les modèles murins et maladies humaines18. Cette technologie a été encore affinée au cours des dernières années. Autres chercheurs et nous avons démontré la faisabilité de ce système de réalisation d’études ultra-hautes fréquences ultrasons sur les foetus de souris coeur15,19,20,21,22 ,,23. Le système est équipé d’une cartographie des flux Doppler couleur et transducteurs linéaire qui génèrent des images bidimensionnelles et dynamiques à une vitesse haute fréquence (30 à 50 MHz). Ces avantages, par rapport aux systèmes à ultrasons basse fréquence et de la génération précédente de haute fréquence ultrason21,22, fournissent la sensibilité nécessaire et la résolution pour une évaluation approfondie de la fetal circulatoire système, y compris la caractérisation complète des structures du cœur, la fonction de chambre et indices de flux des souris foetales en paramètres expérimentaux. Ici, nous exposons des méthodes permettant d’effectuer une évaluation rapide de la circulation cardio-pulmonaire et circulation fœto-placentaire à jour embryonnaire E18.5 in vivo à l’aide d’un système haute fréquence. Nous avons choisi un transducteur 30/45 MHz qui offre une résolution axiale environ 60 µm et une résolution latérale de 150 µm. Toutefois, un capteur de fréquence plus élevé (40/50 MHz) peut être choisi pour analyser des stades de développement plus tôt en suivant une approche méthodologique similaire. Le M-mode sélectionné permet la visualisation des tissus en mouvement aux niveaux haute résolution temporelle (1 000 images/s). Enfin, nous démontrer la faisabilité de l’échographie haute pour détaillée complète caractérisation phénotypique de l’état hémodynamique cardiovasculaire foetal et la fonction chez les souris au départ et en réponse à un stress prénatal hypoxie.

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Protocole

L’Université de Californie, Los Angeles et animalier utilisation Comité a approuvé toutes les procédures indiquées dans le présent protocole. Les expériences ont été menées dans le cadre d’une étude en cours dans le cadre des protocoles animales actifs approuvé par l’animalier institutionnel et l’utilisation Comité de University of California, Los Angeles, Californie, USA. Soin et la manipulation animale suivi les normes du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. préparation de l’échographie de haute fréquence système d’imagerie

  1. Allumez le système d’imagerie à ultrasons et l’unité de surveillance de la physiologie.
  2. Connectez le transducteur 30/45 MHz.
  3. Placez la tête de balayage correspondant sur son porte-près de la plate-forme d’imagerie.
  4. Sélectionnez l’option du Programme de mesure cardiaque .
  5. Place de l’échographie de gel à l’envers dans son conteneur de préchauffage réglé à 37 ° C.
  6. Confirmer le système approprié pour l’anesthésie et vérifier les niveaux d’oxygène et isoflurane.
  7. Désinfecter la plateforme d’imagerie et la zone de travail.
  8. Définir le niveau de chaleur de la plate-forme d’imagerie pour maintenir une température corporelle constante et de fréquence cardiaque des barrages.

2. préparation souris femmes enceintes

  1. Placer le barrage de souris enceintes (C57/BL6) dans la chambre de l’induction de l’anesthésie.
  2. Induire l’anesthésie en utilisant continuellement livrés par inhalation isoflurane (isoflurane 2 % - 3 %) mélangé avec 100 % d’oxygène (100 % O2) à un débit de 200 mL/min dans la chambre de l’induction.
  3. Transférer l’animal sous sédation sur la plate-forme d’imagerie en position couchée.
  4. Fournir la sédation stabilisées à l’aide d’un masque relié à l’anesthésie tube système-livraison isoflurane (1,0 % - 1,5 %) mélangé avec 100 % O2 à 200 mL/min.
    ATTENTION : Contrôler les fuites de gaz anesthésique en utilisant un système de ventilation équipé d’un filtre à charbon contenant le jeu de la cuve.
  5. Ruban adhésif les branches doucement aux électrodes électrocardiographiques incorporés après application du gel électrode pour obtenir un suivi constant du taux respiratoires et cardiaques maternelle.
  6. Réglez le niveau d’isoflurane pour maintenir une fréquence cardiaque moyenne (450 +/-50 battements/minute (bpm)).
  7. Maintenir la température du corps dans une fourchette de 37,0 ° C ± 0,5 ° C. Surveiller la température du corps et la fréquence cardiaque affichée sur le régulateur de la physiologie.
  8. Documenter les signes vitaux de la souris sous sédation toutes les 15 min tout au long de la procédure d’imagerie.
  9. Évaluer le niveau de l’anesthésie en évaluant le maintien de la souris, fréquence cardiaque et les réactions à l’orteil pincées.
  10. Appliquer le baume ophtalmique de (1 goutte dans chaque œil) pour prévenir la sécheresse de le œil et lésions cornéennes.
  11. Enlever la fourrure du niveau de la poitrine moyenne pour les membres inférieurs en utilisant une crème dépilatoire pour minimiser l’atténuation des ultrasons. Retirez la crème 1 à 1,5 min après que application par une alternance de gaze humide et sec lingettes pour éviter d’endommager la peau.

3. Identification de l’embryon

  1. Palper la paroi abdominale doucement pour localiser les foetus et les étaler.
  2. Annoter chaque embryon sur l’abdomen du barrage et de définir leurs orientations antéro-postérieur et dorsale-ventral à l’aide d’un marqueur.
  3. Utilisez le col de l’utérus de la mère sous sédation comme point de repère. Qualifier les foetus sur les cornes utérines droite et gauche de L1, L2, 3 L, etc. (côté gauche) et R1, R2, R3, etc. (à droite), respectivement (Figure 1 a).
    ATTENTION : Éviter la propagation du fœtus avec force. 1-2 foetus dans chaque portée peuvent se chevaucher avec les autres, rendant leur positionnement et d’imagerie non fiable. Exclure ces foetus de l’analyse.

4. annotation et visualisation cardiaque fœtale

  1. Appliquer le gel d’échographie préchauffé sur l’abdomen et l’étaler soigneusement pour éviter la formation de bulles. Ajouter une quantité supplémentaire de gel sur la zone de balayage d’imagerie.
  2. Placer la sonde sur son support mécanique et il mobiliser progressivement vers la peau en contact avec la couche de gel épais tout en recherchant le cœur battant à l’aide de la B-Mode de balayage (Figure 1).
  3. Cliquez sur le bouton de numérisation mode B pour obtenir des images 2D. Utiliser la vessie comme un point de repère pour identifier le premier foetus placé à la droite ou la gauche corne utérine et marquez-le comme R1 ou L1, respectivement.
  4. Confirmer l’orientation droite et gauche du fœtus individuel en temps réel par le déplacement de la plate-forme d’imagerie dans le plan horizontal. Scan de la tête à la queue d’annoter le museau, les membres et la colonne vertébrale comme points de repère (Figure 1 b, 1 vidéo).
  5. Visualiser le cœur battant et annoter le ventricule gauche (VG) et le ventricule droit (RV). Utilisez le mode Doppler couleur pour optimiser la visualisation du cœur (Figure 1 C-G, Videos 1 - 2).
  6. Cliquez sur le bouton de numérisation mode B pour obtenir un axe court parasternale-vue, avoir la LV et RV affiché dans leur diamètre maximum au centre de la trame d’acquisition de données. Démarrage direct imaging (Figure 1 b-C).
  7. Modifier l’orientation de la souris en ce qui concerne la numérisation des plans pour obtenir une vue longitudinale de quatre chambres (Figure 1). Tout d’abord, identifiez les structures restantes du cœur tels que les oreillettes, septum interventriculaire et étendues de sortie gauche et droite. Ensuite, ont des chambres ventriculaires et auriculaires affichés dans leur diamètre maximum. Démarrez ensuite l’acquisition d’images.
  8. Exclure les images obliques, non optimale, de l’analyse finale. Cliquez sur le bouton de Cini pour obtenir un enregistrement continu « Ciné-loops » pendant au moins 10 s, puis enregistrer les images enregistrées.

5. évaluation du rythme cardiaque fœtal et la fonction ventriculaire

  1. Cliquez sur le bouton M-mode balayage afin d’obtenir des images cardiaques de quatre avions chambre (vidéo 3).
  2. Afficher la liste des enregistrements pour analyse une fois que les images de tous les embryons sont terminées.
  3. Exclure les images obliques, non optimale, de l’analyse finale.
  4. Cliquez sur le bouton analyse de mesure d’épaisseur et le diamètre interne du ventricule gauche/droite à diastole (LVID, d ; RVID, d) et la systole (LVID, s ; RVID, s), comme illustré à la Figure 2.
  5. Déterminer la fréquence cardiaque foetale moyenne en jouant chacun enregistré M-mode de traçage et calculer la mesure d’un débit cycle pour le flux suivant du cycle (l’espacement entre les sommets adjacents).
  6. Effectuer des mesures multiples (au moins 5 par traçage) pour obtenir la fréquence cardiaque moyenne (Figure 2).
  7. Mesurer les changements temporels entre diamètre diastolique ventriculaire gauche interne (LVID, d) et de diamètre interne ventriculaire gauche en systole fin (LVID, s) tout au long du cycle cardiaque. Puis calculer pourcentage de raccourcissement fractionnaire (FS %) comme suit : % de FS = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
  8. Effectuer des mesures multiples (au moins 5 par traçage) pour obtenir les valeurs moyennes de % FS.

6. évaluer les paramètres de débit cardiopulmonaires

  1. Ajuster le secteur selon un angle d’acquisition inférieure à 60o. Cliquez sur le bouton Doppler pour effectuer des mesures Doppler pulsé vague du plan de quatre chambre-imagerie 2D à l’aide d’un transducteur de 45 MHz.
    1. Tout d’abord, visualiser la bifurcation de l’artère pulmonaire afin d’identifier les voies de sortie droite. Ensuite, cliquez sur le bouton onde pulsée Doppler pour obtenir le modèle de flux à travers la pulmonaire et des valvules aortiques (Figure 3 a, 4 vidéo).
  2. Mesures du débit pulmonaire provenir d’onde pulsée Doppler traçage, y compris la vitesse systolique maximale (PkV), temps d’accélération (AT) et le temps d’éjection (HE).
  3. Effectuer des mesures multiples (au moins 5 par traçage) pour obtenir des mesures moyennes comme le montre la Figure 3 a (à droite).
  4. Calculer le AT / ratio ET pour chaque sortie vanne comme indicateur de la perméabilité de voies de sortie et la circulation sanguine.
  5. Aller de l’avant pour obtenir les modèles de flux mitrales et aortiques de vues de chambre quatre apicale 2D à l’aide de l’onde pulsée Doppler. Tout d’abord, identifiez les cavités ventriculaires gauche gauche et auriculaires. Ensuite, placez le volume d’échantillon Doppler pulsé vague pour l’enregistrement des modes Doppler afflux mitrale et mesure Vitesse diastolique précoce (E) et de la vitesse de contraction auriculaire (A) (Figure 3 b)24,,25.
  6. Ajuster le volume de l’échantillon Doppler pour obtenir le modèle jet Doppler aortique. Utiliser le jet Doppler aortique traçage pour mesurer l’accélération temps (AT) et éjection (HE) comme le montre la Figure 3 b (à droite) (vidéo 5)

7. évaluer l’axe fœto-placentaire

  1. L’analyse Doppler couleur permet de visualiser l’artère utérine et l’arbre vasculaire fœto-placentaire à l’aide du transducteur de 45 MHz (Figure 4 a).
  2. Identifier les vaisseaux ombilicaux (deux artères et une veine) dans le segment amniotique du cordon ombilical, juste après que le cordon sort de l’abdomen fœtal.
  3. Lieu vague pulsée volume d’échantillon Doppler afin d’obtenir le modèle de flux de l’artère ombilicale (Figure 4 a).
  4. Mesurer les paramètres de débit pic vasculaire, y compris les temps d’accélération (AT), heure de l’éjection (HE), et pointe de vitesse d’écoulement à la systole fin (PkV, s) à l’aide de l’onde pulsée record balayage Doppler (Figure 4 b).
  5. Obtenir 5 signaux consécutifs dans chaque navire, en l’absence de mouvements foetaux et maternels mouvements respiratoires, à mesurer la vitesse de pointe moyenne pour chaque navire.
  6. Passez à la prochaine embryon.

8. l’imagerie surveillance animale

  1. Désactiver le conteneur isoflurane après l’achèvement du processus d’imagerie.
  2. Continuer de surveiller la température corporelle, la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque au cours de la phase de récupération.
  3. Retirer le masque et le système de tuyau connecté une fois le barrage commence des mouvements spontanés.
  4. Retourner le barrage sur le boîtier approprié et continuer d’observation selon des protocoles standard d’après la procédure institutionnelles.
  5. Document le temps de reprendre toute activité normale.

9. exigences et considérations techniques

  1. Limiter le temps de traitement pour le foetus ~ 8 à environ 1 h pour éviter les effets négatifs de l’anesthésie prolongée sur les signes vitaux et les paramètres physiologiques.
  2. Suivre une formation avec 8-10 souris gravides afin d’optimiser les techniques pour des motifs d’image acquisition et flux de traçage dans un court laps de temps.

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Résultats

Des analyses statistiques des indices cardiaques et hémodynamiques ont été effectuées hors connexion. Les moyennes de 5 mesures consécutives dans les 3 images optimales ont été calculées. Les données sont exprimées en moyenne t de ± SEM. étudiant-test a permis de déduire les comparaisons intergroupes. Valeur P ≤ 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Suite au protocole de plus haut, nous avo...

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Discussion

Maladies et malformations cardiovasculaires sont fondamentalement influencées par des facteurs génétiques et environnementaux éléments19. Nous avons déjà démontré un impact significatif de la restriction calorique maternelle, initié durant le second trimestre, les flux circulatoire fœto-placentaire et la fonction cardiaque foetale9.

Hypoxie prénatale est un autre facteur de stress courants au cours du développement fœtal susceptibles d’affecter c...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Remerciements

Nous remercions le noyau de la physiologie animale, division de médecine moléculaire à l’université UCLA pour fournir le support technique et le libre accès à la biomicroscopie (UBM) de Vevo 2100 échographe. Cette étude a été financée par les NIH/Child Health Research Center (5K12HD034610/K12), l’UCLA-HME Discovery Institute et fonds aujourd'hui et demain pour enfants et David Geffen School of Medicine Research Innovation award à M. Touma.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vevo 2100VisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaN/ABiomicroscopie par ultrasons à haute liberté. L’installation est disponible dans l’installation centrale de physiologie animale, division de médecine moléculaire, UCLA. Souris consanguines des États-Unis
(c57/BL6)Charles River LaboratoriesN/ASouche de souris de type sauvage Inbread

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