Dans cette étude, nous décrivons un système in-ovo comme un outil prometteur aux insulino-mimétiques composés d’essai dans un organisme vivant. Les principaux avantages comprennent un débit adéquat et des coûts acceptables, qui permettent l’identification de composés phytochimiques aux propriétés insulino-mimétiques.
Article de méthode
Un modèle In Ovo pour tester les composés insulino-mimétiques
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Élevées de la glycémie dans le diabète sucré de type 2 (T2DM), une maladie métabolique complexe et multifactorielle, est dus insulino résistance et les cellules β. Différentes stratégies, y compris l’injection d’insuline ou l’utilisation de médicaments insulino-sensibilisateurs, se sont poursuivies à traiter T2DM ou au moins réduire les symptômes. En outre, l’application de composés à base de plantes a attiré une attention croissante. Ainsi, il est nécessaire de trouver des systèmes de test efficace pour identifier et caractériser les composés insulino-mimétiques. Ici, nous avons développé un modèle d’embryon de poussin mis à jour le, qui permet l’essai de composés synthétiques et des extraits de plantes ayant des propriétés insulino-mimétiques. À l’aide d’un fluorescence axée sur la microscopie écran principal, qui quantifie la translocation du transporteur de Glucose (Glut4) de 4 à la membrane plasmique, nous étions en mesure d’identifier les composés, principalement des extraits végétaux, qui conduisent à une augmentation du glucose intracellulaire concentrations dans les adipocytes. Cependant, l’efficacité de ces substances doit encore vérifier dans un organisme vivant. Ainsi, nous avons utilisé une approche in-ovo pour identifier leurs propriétés de réduction du glucose de sang. L’approbation par un Comité d’éthique n’est pas nécessaire puisque l’utilisation d’embryons de poulet pendant les deux premiers tiers du développement embryonnaire n’est pas considéré comme une expérimentation animale. Ici, l’application de ce modèle est décrite en détail.
Introduction
Diabète sucré est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie et est causé par des défauts dans la sécrétion d’insuline ou l’insuline d’action1. Quatre-vingt-dix pour cent des cas de diabète sont catégorie mellitus de diabète de type 2 (T2DM), où les individus démontrent l’insulino-résistance et surtout l’insuline carence en2. Plusieurs facteurs sont connus pour augmenter l’incidence mondiale de T2DM, y compris les changements dans le mode de vie, en particulier celles liées à la suralimentation, le vieillissement et la sédentarité. Environ 400 millions de personnes ont le diabète dans le monde entier selon la Fédération internationale du diabète (FID). Ce nombre devrait atteindre 600 millions dans le prochain 20 ans3.
Complications liées au diabète provoquées par l’hyperglycémie et l’insulino-résistance, tels que l’hypertension, la dyslipidémie, l’intolérance au glucose, cardiopathie ischémique et maladie vasculaire cérébrale, conduisent à une espérance de vie considérablement réduite et qualité4. Les personnes concernées exigent une pharmacothérapie hypoglycémiant ; Cependant, l’utilisation de médicaments comme la metformine5 est souvent associée à des effets secondaires dramatiques6,7,8. Par conséquent, autres antidiabétiques des approches qui sont sûrs, largement disponibles et peu coûteux sont nécessaires.
Nutraceutiques, des extraits, des plantes et des différents composés à base de plantes ont été attribuées à des propriétés insulino-mimétiques de fonctionnalité en modulant les diverses fonctions cellulaires. Une caractéristique importante est la stimulation de la translocation du transporteur de glucose (GLUT4) de 4 à la membrane plasmique des compartiments de stockage intracellulaire, ce qui entraîne une augmentation de l’absorption du glucose dans les muscles et le tissu adipeux en l’absence d’insuline, connu sous le nom propriétés insulino-mimétiques9. Auparavant, nous avons mis en place une approche axée sur la microscopie de fluorescence pour quantifier le processus de translocation de GLUT410. Analyse de nombreux extraits de plantes de bibliothèque extrait11 à l’aide de ce test a permis l’identification de candidats prometteurs. Toutefois, des essais supplémentaires dans les organismes vivants sont requis. L’approche décrite en détail dans le présent document, un modèle d’embryon de poussin mis à jour le, s’est avéré pour être un modèle prometteur pour l’identification des substances ayant des propriétés insulino-mimétiques. Il représente un outil intéressant de combler l’écart entre les études in vitro et in vivo et offre plusieurs avantages par rapport aux systèmes existants tels que des coûts acceptables, procédures de manipulation simple et débits adéquats. En outre, l’autorisation par un Comité d’éthique n’est pas requise.
Protocole
Selon la directive 2010/63/CE, les expériences avec des embryons d’oiseaux non éclos durant les deux premiers tiers du développement embryonnaire n’ont pas besoin d’autorisation par un Comité d’éthique.
1. conservation et reproduction des oeufs
- Obtenir des œufs de poule fécondés (Table des matières) chez un éleveur local.
Remarque : Les oeufs peuvent être entreposés à 14 ° C en atmosphère humidifiée jusqu'à 10 jours après la pose avant de l’utiliser pour des expériences. - Incuber les œufs à 38 ° C avec une humidité moyenne de 40-60 % pour les 10 ou 11 jours dans un incubateur qui tourne constamment les oeufs.
2. sélection des oeufs
- Vérifier les oeufs à la fertilisation après incubation jusqu'à 11 jours. Utiliser une lampe de Mirage pour cette étape. Tremper la frange de la lampe de Mirage dans un tampon encreur et bougie le côté pointu de le œuf.
- Pour identifier la vessie natatoire, recherchez les différences de luminosité sur le dessus de le œuf.
Remarque : La vessie natatoire apparaît comme une région ronde, plus transparente, tandis que l’albumen est plus sombre quand l’oeuf est miré. - Après la détection de la vessie natatoire, marquer l’emplacement en appuyant sur la lampe légèrement contre le œuf avec l’encre appliquée précédemment.
- Exclure les oeufs non fertilisés à cette étape, qui ne présentent pas une différence de luminosité entre l’albumen et de la vessie natatoire.
3. l’injection de Substances
- Préparer la substance d’intérêt(par exemple, l’extrait de fines herbes ou insuline) en diluant la substance à la concentration désirée dans le tampon de solution saline équilibrée (HBSS) de Hank. Par exemple, 3,3 U/mL d’une analogue en HBSS disponible dans le commerce de l’insuline.
- Pour l’application du composé sélectionné, soigneusement picorer la coquille avec une paire de pointe de pincettes dans la zone marquée de la vessie natatoire. Ne font pas un trou plus grand que le diamètre de l’aiguille de la seringue. Injecter la solution tampon (300 µL) contenant la substance d’intérêt dans la zone piquetée via une seringue.
Remarque : Utilisez des seringues à usage unique stériles, 1 ml, pointes de pipette et navires. Porter des gants et une blouse de laboratoire pour les expériences. - Pour déterminer l’effet de réduction du glucose du sang d’une substance, placer les oeufs dans la couveuse pour 60, 120 et 180 min, respectivement. Pour déterminer le taux de glycémie basale, comprennent au moins 10-15 oeufs de témoins non traités.
4. les essais de toxicité
- Après application du composé sélectionné pendant 24 h, équilibrer la membrane coquillère avec un tampon phosphate salin tamponné (PBS) (assez pour couvrir la membrane coquillère ensemble) pendant au moins 30 s.
- Enlever l’excès de tampon PBS en le versant loin.
- Retirer soigneusement la membrane coquillère avec une paire de pointe de pincettes.
- Vérifiez pour les lésions des vaisseaux sanguins et confirmer la vitalité (p. ex., mouvement) de l’embryon de poulet.
Remarque : Voir la Figure 1 pour la comparaison de l’influence déterminante par rapport aux embryons non vital après application d’un extrait de plantes toxique.
5. mesure de la valeur glycémique
- Au point de temps respectifs, retirez la coquille au-dessus de la vessie natatoire soigneusement et équilibrer la membrane coquillère avec le tampon PBS (assez pour couvrir la membrane coquillère ensemble).
- Enlever l’excès de tampon PBS en le versant loin.
- Retirer soigneusement la membrane coquillère avec une paire de pointe de pincettes.
- Couper et enlever la membrane chorio-avec un micro-ciseaux, pour permettre de bien desservi par les vaisseaux sanguins appropriés. Couper la membrane au moins 2-3 cm. Ne pas couper n’importe quel gros vaisseaux dans la membrane elle-même pour éviter la perte de sang non désirés de l’embryon.
- Repérer le grand navire provenant de l’abdomen de l’embryon. Soulever ce navire hors de l’albumen avec un micro-ciseaux fermé et placez-le sur une bande en plastique-pH. Déplacer la bande pH sous le navire, qui se tient avec le micro-ciseaux, et tirer vers l’arrière du micro-ciseaux loin soigneusement.
- Enlever 1 à 2 mL de liquide sous la membrane chorio-avec une pipette pour éviter la dilution du sang dans l’étape suivante. Sécher le bateau et le pH-bande de papier filtre, avant que le navire est coupé.
- Couper le vaisseau sanguin soigneusement avec un micro-ciseaux sur un côté. Ne coupez pas le navire complètement.
Remarque : Le bateau est environ 1 mm d’épaisseur. Ne pas couper plus de la moitié du navire pour éviter de couper à travers le navire entièrement, car il peut glisser hors de la bande et aucun prélèvement de sang n’est possible. - Recueillir le sang qui fuit sur la bande de pH à l’aide d’une pipette. 10 microlitres de sang sont nécessaires pour déterminer le taux de glycémie à l’aide de l’indicateur de glycémie.
6. statistique Evaluation
- Calculer la valeur moyenne d’au moins 10 oeufs individuels par point dans le temps et normaliser ces valeurs à l’un des oeufs contrôle (oeufs non ou tampon traitées).
- Par la suite, de déterminer le pourcentage de diminution. En outre, utiliser l’insuline comme témoin positif.
Remarque : Répétez chaque expérience au moins trois fois.
Résultats
Description de l’approche de Gluc-HET :
Après incubation avec les substances d’intérêt, les œufs fécondés sont ouvert et préparés pour la collecte de sang par l’enlèvement de la coquille (Figure 2). Préparation supplémentaire comprend l’équilibration et la suppression de la membrane coquillère d’accéder à la membrane chorio. Cette membrane est ensuite coupée avec soin pour donner accès à un vaisseau sanguin adéquat pour la collecte de sang. De préférence, le gros vaisseaux provenant de l’abdomen de l’embryon est placé sur une pH-bande de plastique. Pour éviter la dilution du sang lors de la collecte, le navire et le pH-bande est asséchés avec du papier filtre. Le vaisseau sanguin est alors coupé et sang qui fuit sur la pH-bande est prélevé pour analyse à l’aide d’une pipette.
Effets d’extraits de plantes sélectionnés sur la glycémie :
Avec un récemment créé GLUT4-translocation axée sur l’analyse quantitative écran principal, nous sommes en mesure d’identifier les substances avec une caractéristique insulino-mimétiques10. Dépistage des centaines d’extraits d’herbes solubles dans l’eau a permis l’identification de plusieurs hits. Ces extraits ont été testés dans notre modèle in -ovo. Extraits préparés à partir Combretum indicum (Liane de Rangoon) et un extrait non divulgués (appelés extrait 0845) ont été utilisés pour ces expériences. Nous avons dissous les extraits dans un tampon HBSS à 300 mg/L, une concentration qui s’est avéré approprié dans précédentes études12,13. Substances ont été appliquées sur les embryons incubés pendant 11 jours. Comme il est indiqué dans la Figure 3, l’extrait de plante grimpante Rangoon n’a pas entraîné une importante de sang glucose réduction in-ovo. Toutefois, la concentration de glucose de sang a été avec succès réduite avec extrait 0845, avec une réduction mineure après 60 min, ce qui est comparable à l’effet observé à l’aide d’une analogue de l’insuline disponible dans le commerce. Un effet significatif a été observé lorsque le temps d’incubation des œufs a été prolongé.
Figure 1 : Influence des composés toxiques sur la vitalité de l’embryon. Œufs ont été incubées pendant 11 jours (A et C) ou traités avec un extrait de plantes toxique au jour 10 pour un autre 24h (B et D). Demande de l’extrait a conduit à graves lésions des vaisseaux sanguins dans la membrane chorio- (D) et de l’embryon (B).
Figure 2 : Description du modèle in-ovo . De gauche à droite : ouverture et enlèvement de la coquille (1 - 2); l’équilibration et la suppression de la membrane coquillère avec membrane chorio-exposés (3); bateau préparé sur une bande de pH (4); la collecte du sang et mesure de la concentration de glucose à l’aide d’un mètre de glucose (5). Adapté de Haselgruebler et al., 201712. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : effet d’extraits de plantes sur la glycémie, comparée aux oeufs non traités ou traités à l’insuline. Œufs sont incubés pendant 11 jours et traités avec les substances indiquées (analogue de l’insuline disponible dans le commerce : 3.3 U/mL ; extraits : 300 mg/L) dissoute dans un tampon HBSS (volume de 300 µL) pendant jusqu'à 3 h sang glycémie ont été déterminée à l’aide d’un lecteur de glycémie. Résultats sont indiqués sans l’effet de la mémoire tampon. Barres d’erreur sont basées sur l’écart-type de la moyenne. * P < 0,05 et *** P < 0,0001, importante diminution en ce qui concerne les oeufs HBSS traitées de la même période d’incubation. Adapté de Haselgruebler et al., 201712. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Le test de HET-CAM est un système de rechange largement utilisé pour les essais à l’expérimentation animale dans l' industrie12. Le système in-ovo décrit ici représente une version modifiée du test HET-CAM. Alors que dans sa forme originale, HET-CAM expériences réalisées afin d’étudier les propriétés irritantes de composés et de la formulation ou l’analyse de l’angiogenèse14,15,16, nous avons adapté l’approche pour tester composés avec caractéristiques insulino-mimétiques putatif12. Selon la directive 2010/63/CE, expériences avec des embryons d’oiseaux non éclos durant les deux premiers tiers du développement embryonnaire n’ont pas besoin l’autorisation par un Comité d’éthique étant donné que ces expériences ne sont pas considérés comme des expérimentations animales. Des études récentes ont démontré la pertinence du système in-ovo pour caractériser l’efficacité des extraits de plantes sélectionnées, qui ont été identifiées dans un écran principal GLUT4-translocation à base10, afin de réduire le taux de glucose sanguin dans les absence d’insuline12,13. Points critiques pour une bonne performance du système en-ovo incluent : tout d’abord, un éleveur fiable offrant les œufs fécondés. La poule brune classique Lohmann est un bon choix de race. Deuxièmement, la mise en œuvre de toxicité teste d’exclure les effets toxiques de l’enquête composé doit être fait. En outre, la préparation d’un vaisseau sanguin adéquat pour la collecte de sang est importante. Il est important d’éviter la découpe de gros bateaux dans la membrane chorio-lui-même, car cela peut entraîner une perte non-préférable de sang. En outre, avant que le navire est coupé sur la bande de pH, il doit être tapoté sèche à l’aide de papier filtre pour éviter la dilution du sang recueilli. Enfin, un nombre suffisant d’expériences semble être important. Nous vous recommandons d’utiliser au moins 10 oeufs pour chaque point dans le temps et une triple répétition de l’expérience respective.
Naturellement, il y a certaines limites de cette approche dans-ovo . Puisque cela prend jusqu'à 30 minutes, jusqu'à ce que les substances sont absorbés à travers la membrane coquillère et entrent en contact direct avec la membrane chorio-, il n’est pas possible de quantifier une réponse rapide de l’embryon à la pâte appliquée. En outre, certains composés peuvent être toxiques dans la concentration appliquée, ce qui entraîne fréquemment des lésions des vaisseaux sanguins dans la membrane chorio. Ainsi, il semble raisonnable de cytotoxicité test basé sur la longue durée d’incubation des composés pendant environ 24 heures. Enfin, nous avons constaté que le système de tampon utilisé pour l’application des composés a un effet significatif sur la performance du test. 12 actuellement, tampon HBSS est utilisée car elle se traduit par le plus petit effet sur le taux de glucose sanguin de l’embryon.
Pour de futures applications, systèmes tampon supplémentaire comme une alternative aux HBSS pourraient être testés. En outre, l’influence d’extraits de plantes sur les paramètres sanguins supplémentaires tels que le taux de cholestérol, de triglycérides ou de lipoprotéines pourrait être une question attrayante.
Notre nouveau système de dans-ovo est un outil prometteur et important pour tester les substances possédant des caractéristiques insulino-mimétiques dans un organisme vivant sans la nécessité d’une expérimentation animale. Par conséquent, il comble le fossé entre les approches in vitro et in vivo . En comparaison de l’existant en-ovo modèle systèmes17 il n’y a aucun besoin pour induire le diabète par le traitement de la streptozotocine (STZ), car nous utilisons des embryons au jour 10 ou 11 de l’incubation. À ce stade, la production d’insuline n’a pas commencé, mais les embryons sont déjà sensibles de l’insuline. En outre, l’autorisation par un Comité d’éthique peut être nécessaire si les embryons âgés de 14 à 17 jours sont utilisé17. En outre, par rapport aux stratégies alternatives18, l’application composée tel que décrit ici est moins nocive et laborieux, augmentation des taux d’à travers-put expérimentales.
Pris ensemble, cette in-ovo approche est un système attrayant si un effet de diminution de sang d’une substance insulino-mimétiques doit être testée dans un organisme vivant.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été financé par l’Agence de Promotion de recherche autrichienne (FFG ; numéro du projet 850681), l’University of Applied Sciences Upper Austria base financement initiative (projet GlucoSTAR) et le Centre pour l’Innovation technologique en médecine (TIMed Center) qui reçoit un financement de base de la province de Haute-Autriche.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank' s solution saline équilibrée (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Oeufs de poules (poulet brun classique Lohmann) | Éleveur | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche ; | ||
| 5942861 Incubateur ; HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgerä ; te | ||
| Seringue Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S ; | |
| d’extraits | PEKISH | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
Références
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Réimpressions et autorisations
