Une méthode Simple pour l’isolement de protoplastes de soja et Application aux Analyses d’Expression génétique transitoire

Résumé

Nous avons développé un protocole simple et efficace pour la préparation de grandes quantités de protoplastes de soja afin d’étudier les mécanismes réglementaires et signalisation complexes dans des cellules vivantes.

Résumé

Soja (Glycine max (L.) Merr.) est une espèce de culture importante et est devenu un modèle de légumineuses pour l’étude des voies génétiques et biochimiques. Par conséquent, il est important de mettre en place un système d’expression de gène transitoire efficace chez le soja. Nous rapportons ici un protocole simple pour la préparation des protoplastes de soja et sa demande d’analyses fonctionnelles en régime transitoire. Nous avons constaté que les jeunes feuilles unifoliées de semis de soya résulte en grande quantité des protoplastes de haute qualité. En optimisant une méthode de transformation PEG-calcium-négociée, nous avons atteint l’efficacité de transformation élevés à l’aide de protoplastes unifoliées soja. Ce système fournit un modèle efficace et polyvalent pour l’examen des mécanismes de réglementation et signalisation complexes dans les cellules de soja direct et peut aider à mieux comprendre divers processus cellulaires, physiologiques et du développement des légumineuses.

Introduction

Les protoplastes sont des cellules végétales qui ont enlevé les parois cellulaires. Qu’ils conservent la plupart des fonctions et activités des cellules végétales, les protoplastes sont un système de bon modèle d’observer et d’évaluer les divers événements cellulaires et sont des outils précieux pour étudier l’hybridation somatique¹ et²de la régénération des plantes. Protoplastes ont été également largement utilisés pour usine de transformation^3,4,5, puisque les parois cellulaires bloquerait sinon le passage de l’ADN dans la cel....

Protocole

1. la croissance des plantes

1. Semer les graines de soja de 5-10 (82 Williams) dans un pot de 13 cm en serre dans des conditions de jours longs (16 h de lumière à 1 500 µmol m^-2 s^-1) à 25 ° C sur le mélange de sol personnalisé pour le soya (1:1:1 ratio de sable sol, de perlite et de torpilles).

2. préparation d’ADN plasmidique

1. À l’aide d’une pointe de pipette stérile ou un cure-dent, choisir une seule colonie ou stock de glycérol congelés de e. coli portant le plasmide contenant le gène d’intérêt et il inoculer dans 20 mL de milieu liquide de Luria-Bertani (LB) avec des antibiotiques ap....

Résultats

Différents organes de soja vieux de 10 jours, ont été testés pour la préparation de protoplaste (Figure 1) et les rendements ont été observés au microscope (Figure 2). Les parois cellulaires de l’hypocotyle et épicotyles sont difficilement digérés, et certaines cellules sont restés attachés les uns aux autres (Figure 2 b, 2C). Cotylédon (Figure 2D) et ra.......

Discussion

Ce protocole pour l’isolement de protoplastes de soja et de l’application aux études d’expression transitoire a été testé et fonctionne très bien dans notre laboratoire. Les procédures sont simples et faciles et nécessitent des équipements ordinaires et coût minimum. Notre protocole génère de grandes quantités de protoplastes uniforme et de grande qualité par rapport aux méthodes rapportées antérieurement^34,35,36,

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MES	Sigma Aldrich	M8250-100G
Cellulase CELF	Worthington Biological Corporation	LS002611
Pectolyase Y-23	BioWorld	9033-35-6
CELLULASE « ONOZUKA » R-10	yakult	10g
MACEROZYME R-10	yakult	10g
Mannitol	ICN Biomedicals	152540
CaCl2	Fisher	C79-500g
BSA	NEB	R3535S
DTT	Sigma Aldrich	D5545-5G
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-1kg
KCl	Fisher	P217-500g
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G
PEG4000	Fluka	81240
maille de nylon	carolina	652222N
Plaques de culture tissulaire	USA Scientific	CC7682-7506
Lames de rasoir	Fisher	12-640
hémacytomètre	hausserscientific	1483
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
EZNA plasmide miniprep	kit Omega	D6942-01
GeneJET GeneJET Centrifugeuse	Thermo Scientific	K0502
5810	eppendorf	5811000827
Jencons Powerpette Plus Pipeter Controller	Jencons	14526-202
Microscope confocal Zeiss 710	Zeiss	N/A
Tubes microfuges antiadhésifs et sans RNase, 1,5 mL	Ambion	AM12450
15 mL Tubes à centrifuger	Denville	C1018-P
50 mL Tubes à centrifuger	Denville	C1060-P
Sérum pour veau nouveau-né	Thermo Scientific	16010159
Soil	Pépinière
perlite	Vigoro	100521091
Torpedo Sand	JKS Ventures
LB Bouillon, Lennox (poudre)	Fisher	BP1427-500

Centrifugeuse 5424 eppendorf 22620401 Ingram’s