Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

Summary

Les auteurs décrivent une méthode pour étudier la capacité de pointe de plus en plus des cellules végétales, y compris les tubes polliniques, les poils et de la mousse protonéma, à s’allonger à travers des ouvertures très étroites (~ 1 µm) dans un dispositif microfluidique.

Abstract

In vivo, astuce-culture de cellules végétales doivent surmonter une série d’obstacles physiques ; Toutefois, les chercheurs n’ont pas la méthodologie afin de visualiser le comportement cellulaire dans de telles conditions restrictives. Pour résoudre ce problème, nous avons développé des chambres de croissance pour pointe-croissance des cellules végétales qui contiennent une série de lacunes étroits, fabriqués en micro (~ 1 µm) dans un substrat de poly-diméthylsiloxane (PDMS). Ce matériau transparent permet à l’utilisateur de surveiller les processus d’élongation Astuce dans des cellules individuelles lors de la faible pénétration par imagerie de Time-lapse. En utilisant cette plate-forme expérimentale, nous avons observé des changements morphologiques dans les tubes polliniques comme ils ont violé le faible. Nous avons capturé les changements dynamiques sous la forme d’un noyau végétatif fluorescent étiqueté et les spermatozoïdes dans un tube de pollen au cours de ce processus. En outre, nous avons démontré la capacité des poils absorbants et mousse protonéma de pénétrer l’écart de 1 µm. Cette plate-forme in vitro peut être utilisée pour étudier comment les cellules répondent aux espaces physiquement contraints et peut apporter un éclairage sur les mécanismes de croissance apicale.

Introduction

Après que les grains de pollen germent sur un stigmate, chaque grain produit un seul tube pollinique qui transporte les spermatozoïdes à l’oosphère et la cellule centrale de l’ovule pour la double fécondation. Les tubes polliniques s’allongent à travers le style et finissent par atteindre l’ovule en détectant des repères d’orientation multiples le long de leurs voies¹. Au cours de l’élongation, tubes polliniques rencontrent une série d’obstacles physiques ; la voie de transmission est remplie de cellules, et les tubes polliniques doit entrer la minute ouverture micropylaire de l’ovule pour atteindre leur cible (Figure 1 a

Protocol

1. fabrication de la MICRODISPOSITIF PDMS pour étudier la croissance des Tubes polliniques et point de riz protonéma

NOTE : Nous avons utilisé un instrument sans masque photolithographie pour préparer des moules PDMS sur des plaquettes de silicium. Les détails concernant le fonctionnement du système sont omises dans ce manuscrit. Une technique de photolithographie standard⁹ à l’aide d’un photomasque peut également être utilisé pour créer les moules PDMS décrits dans ce manuscrit.

1. Verser 11 g de mélange PDMS prépolymère (élastomère de base : polymérisation agent à un ratio de 10:1) dans chaque moule de 4 pou....

Results

Tel qu’illustré à la Figure 1, pointe-culture de cellules végétales rencontrent une série de barrières le long de leurs voies de croissance in vivo. L’in vitro cell culture plateformes microfluidiques présentés dans cette étude a permis l’examen le de la culture pointe de process en trois types de cellules végétales (tubes polliniques, poils absorbants et mousse protonéma) par des fentes artificielle de 1 µm (Figure 3

Discussion

Plusieurs étapes cruciales dans le protocole doivent être suivies avec précision afin d’obtenir les résultats présentés ci-dessus. Tout d’abord, les PDMS couche verre fond plat des surfaces et doivent tous deux être traités avec plasma pendant une durée suffisante avant collage. Dans le cas contraire, la couche PDMS peut se détacher localement de la surface du verre, tandis que les cellules productrices de pointe traversent le microgaps. Une autre étape cruciale dans le protocole de protonéma de poils absorbants et moss .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
Plat à fond en verre de 50 mm	Matsunami Verre	D210402
plat à fond en verre de 35 mm	Iwaki  ;	3971-035
Lame chirurgicale	Feather	No.11
biopsie poinçons Harris			Uni-Core
Embouts de chargement de gel	Bio-Bik	124-R-204
Microscope inversé	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		Aucun numéro de catalogue n’est disponible pour ce microscope personnalisé
Logiciel d’imagerie MetaMorph	Molecular Devices