Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux

Les études modernes sur la structure et la fonction du cerveau exigent habituellement une manipulation génétique de gènes spécifiques dans les cellules neuronales. Pour sonder les fonctions des différents gènes, les souris transgéniques porteuses d’allèles mutants, y compris la knockout et knock-in allèles ont été systématiquement générés. Chirurgie du cerveau stéréotaxique pour rongeurs adultes est une méthode standard pour offrir localement des médicaments, des virus, des traceurs et des autres réactifs à des régions spécifiques du cerveau rongeurs^1,2. Appliquant la chirurgie stéréotaxique de cerveau de souris transgéniques permet de manipuler génétiquement la fonction et l’activité neuronale dans certaines populations neuronales du cerveau de souris. La manipulation spécifique au type de cellule fournit une approche puissante pour déchiffrer les fonctions neuronales dans les circuits neurones complexes du cerveau^3,4,5.

Développement neurologique du système nerveux débute aux premiers stades embryonnaires, et les processus de développement continuent après la naissance jusqu'à la période juvénile. La maturation postnatale du système nerveux incluant le câblage synaptique précis des circuits neuraux, qui est essentiel pour les fonctions physiologiques et cognitives du cerveau⁶. Par conséquent, étudier des événements développementaux qui se produisent dans des fenêtres temporelles néonatale est important non seulement pour comprendre le développement neural normal, mais il peut aussi donner un aperçu de la pathogenèse du développement neurologique et maladies neuropsychiatriques^{7 ,},⁸. Bien que les méthodes de chirurgie stéréotaxique cérébrale pour rongeurs adultes sont facilement disponibles^2,9, quelques protocoles sont disponibles sur l’internet pour la chirurgie stéréotaxique cerveau souris néonatales^10,11. En fait, des microinjections stéréotaxiques de réactifs dans le cerveau des souriceaux nouveau-nés sont difficiles, car la tête du chiot nouveau-né est trop fragile pour être fixé à l’appareil stéréotaxique standard. Néanmoins, l’application de la chirurgie stéréotaxique cerveau de souris transgéniques est faisable pour souris néonatales¹². Nous décrivons ici une méthode simple avec l’installation de maison à effectuer une chirurgie stéréotaxique cerveau dans des souriceaux nouveau-nés. Nous démontrons que cette technique permet de supprimer sous condition floxed gènes par microinjecting recombinase exprimant l’AAV Cre ADN dans le striatum de souris de gène de journaliste et conditionnellement floxed souris transgéniques. Cette technique est également applicable pour livrer des réactifs dans le striatum neonatal de souris de type sauvage.

Les protocoles animaux décrits ici ont été approuvés par l’utilisation comités d’Université nationale de Yang-Ming et animalier.

1. préparation du titulaire pour les chiots nouveau-nés dans l’appareil stéréotaxique

1. Faire le plateau de tête : couper le fond d’un tube de centrifugation de 1,5 mL (15 mm de long) dans la forme qui correspond à la tête des ratons nouveau-nés en enlevant 1/5 de la paroi du tube.
2. Prendre une boîte de pointe de pipette avec la bonne taille qui s’inscrit dans le socle de l’appareil stéréotaxique et retirer le couvercle supérieur. Fixer le plateau tête préparé à l’étape 1.1 et une cassette d’incorporation de tissu sur la base du plateau de pointe avec de la colle à chaud-fonte. La hauteur de la cassette d’encastrement tissu est de 7 mm, qui sert à soutenir le cou et le corps du chiot en position fixe à la tête.
3. Mettre l’installation entière dans un appareil stéréotaxique standard.

2. préparation des aiguilles en acier inoxydable à Injection 30G

1. Nettoyage préalable des aiguilles de seringue 30 G en les trempant dans du chloroforme pendant 3 jours.
2. Utiliser forceps prudemment et lentement sortir l’aiguille de son hub de polypropylène sous une hotte chimique.
3. Laver les aiguilles avec de l’éthanol absolu pendant 20 min, suivie de rinçages éthanol 70 % pour 3 x 10 min sur un agitateur à 50 tr/min. Laisser l’air aiguilles sécher et mettre les aiguilles nettoyés dans une boîte propre à température ambiante (RT) jusqu'à utilisation.

3. Préparez un adaptateur pour les tuyaux de Microinjection

1. Connecter la seringue microlitre d’une aiguille d’injection de 30G avec un tube de polyéthylène PE10 (PE10 tube). Préparer un adaptateur de tube (tube PE20) de polyéthylène PE20 pour combler l’aiguille d’injection et la seringue de microlitre. L’utilisation de l’adaptateur est nécessaire, car le diamètre du tube PE10 est beaucoup plus petit que celle de l’aiguille de la seringue de microlitre de 26G.
2. Préparer le tube de la seringue de microlitre : connecter l’aiguille d’injection de 30 G préalablement nettoyé avec 5 cm de tube PE20 et sceller la jonction avec la colle instantanée. Cet adaptateur de tube est réutilisable.
   Remarque : Si l’aiguille de la seringue de microinjection est 30G, la préparation (étape 3.1) et l’utilisation (étape 3.3) de cet adaptateur n’est pas nécessaire.
3. Branchez l’adaptateur de tuyau (préparé à l’étape 3.1) avec une seringue de microlitre (10 µL).
4. Branchez une extrémité du tube PE10 (pas plu de 60 cm) sur l’aiguille de 30G de l’adaptateur de tuyau PE20. Monter une nouvelle aiguille d’injection de 30G à l’autre extrémité du tube PE10.

4. Chargez le Tube de Microinjection avec eau distillée autoclavé, colorant et virus

1. Retirer le piston de la seringue de microlitre. Utiliser une seringue de 25G pour charger la seringue microlitre et son tube PE connecté avec de l’eau distillée autoclavé pour chasser l’air du circuit respiratoire.
2. Placer le piston vers la seringue microlitre et pousser le piston jusqu'à 2 µL de résidus d’eau distillée dans le Canon. Ne laissez pas le volume d’eau distillée devenir inférieure à 2 µL.
3. Monter soigneusement la seringue de microlitre sur le pousse-seringue flux micro taux.
4. Distribuer de petites quantités de colorant vert rapide de 0,1 % (préparé en solution saline à 0,9 % et filtrée avec 0,22 µm filtre) et les liquides de virus à un morceau de parafilm.
5. Retirer une petite quantité d’air pour faire une bulle d’air visible à la jonction entre l’aiguille d’injection de 30G et tube PE10 suivie de chargement 0.7 µL de vert rapide filtré dans le tube pour tester l’écoulement des fluides dans les tubes de microinjection.
6. Retirer une autre petite quantité d’air pour faire une deuxième bulle d’air puis en chargeant les liquides de virus dans le tube de microinjection.
7. Fixez et fixez l’aiguille 30G de microinjection au bras de l’appareil stéréotaxique.

5. anesthésie de souris néonatales par hypothermie

1. Placez le chiot dans un manchon de gant en latex et l’immerger dans de la glace pilée jusqu’au cou pendant 5 min.
2. Pincer les pieds le chiot avec une pince pour ne s’assurer aucune réponse de retrait de ses pieds.
3. Placez le chiot avec manchon de gant en latex dans le bac principal et mettre la glace concassée dans le manchon de latex pour le maintenir froid pour l’anesthésiologie en hypothermie.
4. Pommade de vétérinaire sur les yeux du pup pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie si possible.

6. microinjection

1. Préparer une chirurgie stérile en essuyant l’instrument stéréotaxique soigneusement avec l’éthanol à 70 %. Stériliser l’instrument chirurgical en l’immergeant dans l’éthanol à 70 %.
2. Frotter la tête du chiot avec l’éthanol à 70 %. Localiser le lambda de point de repère sur le crâne et marquez le lambda avec un marqueur. Viser la pointe de l’aiguille pour le lambda et l’antéro-postérieur (AP) et les coordonnées de medial-latérale (ML) comme zéro.
3. Déplacez le bras d’injection vers le site cible selon les coordonnées X et Y de l’emplacement de la cible. Pour le striatum de jour après la naissance (P) 2 chiots, les coordonnées sont : AP, +2,4 mm devant le lambda ; ML, ± 1,0 mm latéral de la ligne médiane ; dorsale-ventral (DV), −1, 7 mm sur le crâne. Marquez la position en PE10 tube de colorant vert rapide avec un stylo.
4. Faire baisser l’aiguille d’injection de 30G lentement à traverser la peau et le crâne et ensuite mettre en place la pointe de l’aiguille jusqu'à ce qu’il s’arrête à la surface du crâne. Définir la coordonnée DV comme zéro.
5. Faire baisser l’aiguille d’injection de 30G lentement jusqu'à ce qu’il atteigne la coordonnée DV du site cible. Attendre 1 min permettre le parenchyme reprendre sa forme normale. Exécutez le programme de microinjection (100 nL/min).
6. Assurez-vous que la marque de colorant vert rapide se déplace dans le tube PE afin de s’assurer que le liquide de virus est injecté dans le cerveau.
7. Attendre 1 min après la cessation de la microinjection et ensuite lentement et progressivement mettre en place l’aiguille à hauteur de 1/2 de profondeur DV dans les 30 s. Après 30 s, retirer doucement l’aiguille de la tête du chiot.
8. Répétez l’étape 6.2 à 6.7 jusqu'à ce que les microinjections de tous les sites visés sont terminées.

7. après une chirurgie récupération du chiot

1. Réchauffer le chiot pendant 20 min dans un incubateur à 33 ° C. Vérifier la récupération du chiot de l’anesthésie de l’hypothermie toutes les 5 min jusqu'à ce que le chiot a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
2. Retourner le chiot vers le barrage après que le chiot est complètement rétabli.

Pour la première série d’expérience, nous micro 200 nL des AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, dilution au 1/10 dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco) qui expriment la recombinase Cre ADN fusionnées avec GFP P2 striatum de souris Ai14. Les souris Ai14 expriment le gène rapporteur tdTomato à Cre-mediated suppression des flancs loxP (floxed) STOP cassette (Figure 2F). Les cerveaux ont été récoltés à P14 pour immunostaining des GFP et tdTomato. AAV nombreux transduites cellules GFP-positives ont été présents tout au long du striatum (Figure 2 a, C), indiquant une infection étendue de cellules striatales par d’éventuels virus AAV-eGFP-Cre. Semblable expression étendue de tdTomato a été également trouvée dans le striatum (Figure 2 b, C). Après examen au microscope à fort grossissement, nous avons constaté que presque toutes les cellules striatal de GFP-positives expriment conjointement le gène rapporteur tdTomato (Figure 2 a'-C'). En outre, tdTomato signaux ont été détectés chez vraisemblablement les terminaisons axonales dans le globus pallidus (Figure 2D) et la substantia nigra pars reticulata (Figure 2E), les régions cibles de neurones de projection nigrostriés et striatopallidale 13. ces résultats suggèrent une Cre-loxP réussie médiée par recombinaison de l’ADN induite par l’AAV médiée par expression de l’activité de la Cre dans les neurones striataux néonatale.

Pour la deuxième série d’expérience, nous micro 50 nL du virus AAV-eGFP-Cre dans le striatum de Foxp2fl/fl souris porteuses d’allèles de Foxp2 loxP-flanqué à P2 (Figure 3 a- C, F) et récolté le cerveau à P9. Aucun Foxp2+; GFP+ marqués au double cellules ont été trouvées dans le striatum, i.e., protéine Foxp2 était absent dans des cellules positives GFP (Figure 3 a'-C'). Dans des expériences de contrôle, Foxp2+; Les cellules marquées double GFP+ étaient présents dans le striatum de souris Foxp2fl/fl avec les virus AAV-eGFP contrôle (Figure 3D) et dans le striatum des hétérozygotes Foxp2fl / + souris avec AAV-eGFP-Cre virus (Figure 3E). Ces résultats indiquent que gène Foxp2 est spécifiquement supprimé dans les cellules d’AAV-eGFP-Cre transduite du striatum néonatale.

Globalement les résultats de AAV-eGFP-Cre ; Ai14 et AAV-eGFP-Cre ; Foxp2fl/fl souris, la technique de chirurgie stéréotaxique cérébrale néonatale que nous avons développés se prête pour conditionnellement suppression de gènes dans des régions précises du cerveau de souris néonatales.

Figure 1. Appareil stéréotaxique et porte-tête-correction fait maison pour souris néonatales. (A) le système d’injection stéréotaxiques comprend les appareils suivants : pompe à seringue i. (contrôleur) ; II. pousse-seringue (motorisée). III. microlitre seringue (10 µL) ; adaptateur de tuyau PE20 IV. ; v. PE10 tube ; aiguille d’injection VI. 30G ; VII. stéréotaxiques appareils ; VIII. une boîte de pointes de pipette converti en plate-forme pour les chiots nouveau-nés ; XI : glace pilée. (B) la hauteur de la cassette d’encastrement tissu est d’environ 7 mm. Le bouton du tube à centrifuger de 1,5 mL est environ 15 mm de long. (C) le dessus de la souris est fixé dans le support de tête-correction faite maison. La flèche indique le lambda de point de repère dans la tête de souris néonatales. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Expression de tdTomato dans le striatum de souris P14 Ai14 après AAV-eGFP-Cre médiée par recombinaison de l’ADN de Cre-loxP. Les virus AAV-eGFP-Cre étaient sterotaxically injecté dans P2 striatum de souris Ai14. Le cerveau a été analysé à P14. (A) plusieurs cellules de GFP-positives sont présents partout dans le striatum (Str). (B) nombreuses cellules tdTomato positives sont également présents dans le striatum. (C) les images fusionnées montrent une vaste co-localisation des GFP et tdTomato dans le striatum. Images confocales des régions en boîte en A-C sont indiquées à fort grossissement dans A "-C", respectivement. Toutes les cellules de GFP-positives (verts) expriment co tdTomato (rouge) dans le striatum. (D, E) Les signaux de tdTomato sont détectés dans les régions cibles de neurones de projection striatale, y compris le globus pallidus (GP ; D) et la substantia nigra pars reticulata (SNr ; E). (F) des schémas de constructions transgéniques AAV-eGFP-Cre et Ai14. CTX : cortex ; Sep : cloison ; Hipp : Hippocampe ; MB : mésencéphale. Barre d’échelle en A (A-C), 200 µm ; A' (a '-C "), 10 µm ; D (pour D et E), 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 3. Suppression conditionnelle du gène Foxp2 dans le striatum néonatal par intrastriatale injecions du virus AAV-eGFP-Cre. Intrastriatale injections de virus AAV-eGFP-Cre ont été réalisées en P2 Foxp2fl/fl (A-C ") et Foxp2fl / +souris (E). Les cerveaux ont été analysées à P9. (A-C) Des cellules positives GFP (A, C, vert) n’ont pas l’immunoréactivité Foxp2 (B, C, rouge) dans le striatum de souris Foxp2fl/fl avec virus AAV-eGFP-Cre. Les régions en boîte en A-C sont affichées à fort grossissement dans A "-C", respectivement. (D) les cellules Striatal express co GFP et Foxp2 sont présentes dans le striatum qui a été injecté avec des virus AAV-eGFP contrôle. (E) des cellules positives GFP expriment co Foxp2 (pointes de flèche) sont présents dans le striatum de Foxp2fl / + souris avec virus AAV-eGFP-Cre. (F) des schémas du virus AAV-eGFP-Cre et Foxp2fl/fl souris transgéniques. Barre d’échelle en A (A-C), 200 µm ; A' (a '-C', D et E), 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.