Les auteurs décrivent un protocole de chirurgie stéréotaxique avec un dispositif de tête-correction faite maison pour microinjecting réactifs dans le striatum de cerveaux de souris néonatales. Cette technique permet des manipulations génétiques dans les cellules neuronales de régions précises du cerveau de souris néonatales.
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Article de méthode
Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux
Dans cet article
Résumé
Résumé
Plusieurs gènes sont exprimés dans le cerveau embryonnaire, et certains d'entre eux s’expriment en permanence dans le cerveau après la naissance. Pour ces gènes avec persistance, ils peuvent fonctionner pour réglementer le processus de développement et/ou de la fonction physiologique dans le cerveau néonatal. Pour étudier les fonctions neurobiologiques de gènes spécifiques dans le cerveau, il est essentiel pour inactiver les gènes dans le cerveau. Nous décrivons ici une simple méthode stéréotaxique pour inactiver l’expression des gènes dans le striatum des souris transgéniques à des fenêtres temporelles néonatale. Les virus AAV-eGFP-Cre ont été micro dans le striatum de souris de gène pour le journaliste Ai14 jours après la naissance (P) 2 par chirurgie stéréotaxique cérébrale. L’expression du gène rapporteur tdTomato a été détectée dans le striatum P14, suggérant une Cre-loxP réussie médiée par recombinaison de l’ADN dans les cellules transduites AAV striatal. Plus loin, nous avons validé cette technique par microinjecting virus AAV-eGFP-Cre en souris P2Foxp2fl/fl . Double marquage de GFP et Foxp2, a montré que les cellules positives GFP manquaient immunoréactivité Foxp2 dans le striatum P9, suggérant la perte de Foxp2 protéine dans les cellules striatal AAV-eGFP-Cre transduite. Globalement, ces résultats démontrent une délétion génétique efficace par les virus AAV-eGFP-Cre stereotaxically micro-injection dans certaines populations neuronales dans le cerveau néonatal de souris transgéniques floxed. En conclusion, notre technique stéréotaxique fournit une plate-forme facile et simple pour des manipulations génétiques dans les cerveaux de souris néonatales. La technique peut non seulement être utilisée pour supprimer les gènes dans des régions précises du cerveau néonatal, mais il peut également être utilisé pour s’injectent des drogues pharmacologiques, traceurs neuronales, optogenetics génétiquement modifiés et chemogenetics des protéines, des indicateurs de l’activité neuronale et les autres réactifs dans le striatum de cerveaux de souris néonatales.
Introduction
Les études modernes sur la structure et la fonction du cerveau exigent habituellement une manipulation génétique de gènes spécifiques dans les cellules neuronales. Pour sonder les fonctions des différents gènes, les souris transgéniques porteuses d’allèles mutants, y compris la knockout et knock-in allèles ont été systématiquement générés. Chirurgie du cerveau stéréotaxique pour rongeurs adultes est une méthode standard pour offrir localement des médicaments, des virus, des traceurs et des autres réactifs à des régions spécifiques du cerveau rongeurs1,2. Appliquant la chirurgie stéréotaxique de cerveau de sour....
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Protocole
Les protocoles animaux décrits ici ont été approuvés par l’utilisation comités d’Université nationale de Yang-Ming et animalier.
1. préparation du titulaire pour les chiots nouveau-nés dans l’appareil stéréotaxique
- Faire le plateau de tête : couper le fond d’un tube de centrifugation de 1,5 mL (15 mm de long) dans la forme qui correspond à la tête des ratons nouveau-nés en enlevant 1/5 de la paroi du tube.
- Prendre une boîte de pointe de pipette avec la bonne taille qui s’inscrit dans le socle de l’appareil stéréotaxique et retirer le couvercle supérieur. Fixer le plateau tête préparé à l’étape 1.1 et une cassette d’incor....
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Résultats
Pour la première série d’expérience, nous micro 200 nL des AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, dilution au 1/10 dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco) qui expriment la recombinase Cre ADN fusionnées avec GFP P2 striatum de souris Ai14. Les souris Ai14 expriment le gène rapporteur tdTomato à Cre-mediated suppression des flancs loxP (floxed) STOP cassette (Figure 2F). Les cerveaux ont été récoltés à P14 pour immunosta.......
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Discussion
Dans la présente étude, nous démontrons une méthode stéréotaxique simple et fiable permettant d’injecter les virus AAV dans le striatum de cerveaux de souris néonatales. Nous micro virus AAV-eGFP-Cre dans le striatum de souris journaliste Ai14 à P2 et ensuite analysé l’expression du gène rapporteur à P14. Nous avons trouvé QU'AAV transduites cellules GFP-positives dans le striatum Rostro niveaux. En outre, presque toutes les cellules de GFP-positives expriment conjointement le gène rapporteur de tdTomato dans les cellule.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et technologie accorde MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, les instituts nationaux de recherche de santé accorde INRH-EX106-10429NI et le programme de centre de recherche espaces recommandés subvention du le ministère de l’éducation par le biais de Brain Research Center, Université nationale de Yang-Ming à Taïwan, et bourse de recherche postdoctorale accorde MOST106-2811-B-010-031 (Y.C.-S.), MOST105-2811-B-010-036 et MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Aiguille PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroforme | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton Seringue MICROLITER | Hamilton ; | 80300 | Aiguille 30G adaptée pour tube PE10 ; L’aiguille 26G nécessite un adaptateur PE20 |
| Tube en polyéthylène PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Tube en polyéthylène PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Pompe à seringue à micro-débit | Pompe de précision plus longue Co. | TJ-2A (contrôleur) et L0107-2A (unité d’entraînement) | |
| Seringue 25G | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Vert rapide | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0,1 % |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Sans utiliser 68030 Adaptateur souris/rat néonatal |
| Anticorps anti-FOXP2 | Abcam | ab16046 | Lapin polyclonal à FOXP2, 1:4 000 |
| Anticorps anti-RFP | Abcam | ab65856 | Souris monoclonale à RFP, 1:1 000 |
| Microscope BX63 Olympus | BX63 | ||
| LSM 880 Microscope confocal | Zeiss | LSM 880 | |
| Chèvre anti-lapin conjugué Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institut des sciences biomédicales, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Le laboratoire Jackson ; | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | Le laboratoire Jackson ; | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco' s phosphate salin Corning | ; cellgro | 21-030-CVR |
Références
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1
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Réimpressions et autorisations
