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Article de méthode

Préparation du murin des glandes salivaires sous-maxillaires pour la microscopie intravitale verticale

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DOI :

10.3791/57283

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7 mai 2018

 ,  ,  , 
1Theodor-Kocher Institute, University of Bern, 2Center for Infectious Diseases, Integrative Virology, University Clinic of Heidelberg

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole pour chirurgicalement exposer et stabiliser les glandes salivaires sous-maxillaires murine intravitale imagerie microscopie intravitale verticale. Ce protocole est facilement adaptable à d’autres glandes exocrines de la tête et la région du cou de la souris et autres petits rongeurs.

Résumé

La glande salivaires sous-maxillaire (SMG) est l’une des trois principales glandes salivaires et présente un intérêt pour nombreux domaines de la recherche biologique, immunologie, oncologie, médecine dentaire et la biologie cellulaire. Le SMG est une glande exocrine, constituée de cellules épithéliales sécrétrices, myofibroblastes, cellules endothéliales, nerfs et la matrice extracellulaire. Des processus dynamiques cellulaires chez le rat et la souris SMG ont précédemment été imagés, utilisant surtout inversé systèmes de microscopie multiphotonique. Nous décrivons ici un protocole simple pour la préparation chirurgicale et la stabilisation de la SMG murin souris anesthésiés pour l’imagerie in vivo avec des systèmes de microscope multiphotonique vertical. Nous présentons ensembles image intravitale représentative d’endogène et transféré Moutschen cellules fluorescentes, y compris l’étiquetage des vaisseaux sanguins ou des conduits salivaires et génération de seconde harmonique de visualiser de collagène fibrillaire. En somme, notre protocole permet une préparation chirurgicale des glandes salivaires de la souris dans les systèmes de microscopie verticale, qui sont couramment utilisés pour l’imagerie intravitale dans le domaine de l’immunologie.

Introduction

Salive est sécrétée par les glandes exocrines pour lubrifier les aliments, protéger les muqueuses des voies orale et pour fournir des enzymes digestives ainsi que des substances antimicrobiennes1,2. En plus des glandes salivaires intercalés dans la sous-muqueuse buccale, il y a trois ensembles bilatérales des glandes principales identifiées comme parotide, sublingual et sous-maxillaires, selon leur emplacement1,2. Cellules épithéliales en forme de pyramide, organisés dans des sacs en forme de fiole (acini) ou demilunes qui sont entourées de cellules myoépithéliales et une membrane basale, sécrètent les composants séreuses et muqueuses de salive1. L’espace étroit luminale des acini se déverse dans des conduits intercalés, qui s’unissent dans des conduits striés jusqu'à ce qu’ils rejoignent finalement dans un seul conduit excréteur1. Le conduit excréteur principal de la SMG est appelé canal de Wharton (WD) et s’ouvre sur la caroncule sublinguale3,4. Le compartiment épithélial SMG représente donc une structure très arborisée avec des points de terminaison terminales collecteurs, ressemblant à un paquet de raisins1,5,6. L’interstitium SMG est composé des vaisseaux sanguin et lymphatique, intégrés dans le tissu conjonctif7 contenant des nerfs parasympathiques8 et5de la matrice extracellulaire. Glandes salivaires normales humains et rongeurs contiennent également des cellules T, macrophages et cellules dendritiques9, ainsi que les plasmocytes sécrétant des immunoglobulines A (IgA) dans la salive9,10. En raison de ses fonctions aux multiples facettes de la santé et la maladie, la SMG est un sujet d’intérêt pour plusieurs domaines de la recherche biologique, y compris la dentisterie4, immunologie11, oncologie12,8de la physiologie et biologie cellulaire 3.

Imagerie des processus cellulaires dynamiques et interactions est un outil puissant dans la recherche biologique13,14. Le développement des tissus profonds d’imagerie et d’innovations inmicroscopes basées sur l’optique non linéaire (NLO), qui reposent sur la diffusion ou l’absorption de photons multiples par l’échantillon, a permis d’examiner directement les processus cellulaires en tissus complexes13 ,15. Absorption des photons multiple implique la livraison de l’énergie d’excitation totale de photons de faible énergie, quelle excitation de fluorophore limites au plan focal et permet donc une pénétration plus profonde des tissus avec le photovieillissement réduite et le bruit extérieur de mise au point excitation13,15. Ce principe est employé par microscopie biphotonique (14:00) et permet l’imagerie des spécimens fluorescentes dans les profondeurs de jusqu'à 1 mm15,16. Tandis que disponible dans le commerce 14:00 configurations sont devenus faciles à utiliser et fiable, le défi majeur pour l’imagerie intravitale est soigneusement exposer et stabiliser l’organe cible des souris anesthésiés, surtout pour l’imagerie de la série de laps de temps. Plusieurs méthodes pour la correction de dérive numérique après acquisition de données ont été publiées le17,18 et nous avons récemment mis au point « VivoFollow », un système de correction automatique, qui neutralise les tissus lente dérive en temps réel en utilisant un informatisé étape19. Toutefois, il est toujours essentiel pour haute qualité d’imagerie pour minimiser le mouvement tissulaire, en particulier les mouvements rapides causés par la respiration ou de battements cardiaques19. Procédures de préparation et de stabilisation ont été publiés pour plusieurs organes, dont la moelle épinière20foie21, peau22, poumon23et ganglion24. En outre, les modèles pour l’imagerie des glandes salivaires de rat ont été développés3,25 et peaufinées pour intravitale imagerie à haute résolution de la murine que SMG adapté à un microscope inversé installation26, 27 , 28.

Nous présentons ici un protocole pratique et adaptable pour l’imagerie de la SMG murine intravitale à l’aide de la microscopie non linéaire verticale, qui est couramment utilisée pour l’imagerie intravitale dans le domaine de l’immunologie. À cette fin, nous avons modifié une scène largement indépendants immobilisation utilisée pour les préparations de ganglions poplités.

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Protocole

Tout travail animal a été approuvé par le Comité Cantonal pour l’expérimentation animale et réalisé selon les lignes directrices fédérales.

1. anesthésier la souris

  1. Porter des équipements de protection individuelle, y compris les gants et blouse de laboratoire.
  2. Mélanger la kétamine, xylazine et une solution saline à une concentration de travail de 20 mg/mL et 1 mg/mL, respectivement. Injecter le stock de travail par voie intrapéritonéale (i.p.) à 8-10 µL/g de souris. Replacez la souris dans la cage.
    Remarque : Ce protocole a été testé pour les souris mâles et femelles âgés de 6 à 40 semaines avec un fond de C57BL/6.
  3. Préparer la solution d’acépromazine à 2,5 mg/mL et injecter 30 µL i.p., 15 min après l’injection de kétamine-xylazine (75 µg/souris).
  4. Après 5 à 15 min, vérifier adéquate anesthésie et analgésie en contrôlant les réflexes, par exemple, réflexe de retrait de la patte ou le réflexe cornéen.
  5. Contrôle des réflexes environ toutes les 30 minutes pendant toute la durée de l’expérience. Injecter par voie sous-cutanée kétamine/xylazine 1,5 µL/g de souris, chaque 60 min ou le plus tôt si les réflexes sont positifs.
    Remarque : L’anesthésie par Inhalation comme l’isoflurane inutilisable avec ce protocole, en raison de la fixation de la souris.

2. Retirez la fourrure de la zone d’exploitation

  1. Utilisez un rasoir électrique pour raser une zone qui s’étend approximativement de 5 mm de caudale de la bouche vers les pattes de devant, qui s’étend sur les mâchoires vers les deux oreilles.
  2. Appliquer crème dépilatoire sur la zone rasée avec un coton-tige. Soigneusement et minutieusement retirer après 3 min, par exemple, en l’essuyant avec tissus humides.

3. fixer la souris sur la scène

Remarque : Ce protocole utilise une étape personnalisée (Figure 1) équipée avec deux supports librement réglables pour lamelles (un attaché à la scène avec une vis, l’autre fixé en permanence sur elle) ; « « « « barres d’oreilles stéréotaxique réglable ; une chaîne qui peut être serrée par une vis ; un métal librement réglable chauffage anneau ; et une zone surélevée désignée pour placer le torse de la souris. Cette étape est modifiée d’un stade de ganglions poplités, avec un titulaire stéréotaxique supplémentaire et un support pour la lamelle inférieure tenant le SMG extériorisé. Des plans détaillés ou des citations de la scène sont disponibles sur demande.

  1. Préparer la scène en enlevant les titulaires pour le cycle de chauffage et le titulaire de la lamelle couvre-objet amovible. Desserrer les vis d’oreille bar détenteurs et le titulaire de la lamelle couvre-objet fixe. Fixez un morceau de gaze à la zone centrale de la scène, servant comme litière pour la souris.
  2. Utiliser de la colle (voir Table des matières) pour fixer un couvercle en verre 20 mm de diamètre au sommet d’un support métallique cylindrique (ce sera le couvercle en verre inférieur). Coller un 25 mm couvercle en verre pour le fond du support plâtes (ce sera le couvercle en verre supérieur). Veiller à ce que les verres de couverture se chevauchent d’environ 2-3 mm avec supports métalliques et que le reste du verre reste libre de graisse et de colle.
  3. Placez la souris sur le dos sur la gaze, perpendiculaire à la corde tendue, avec la tête centrée entre les barres de l’oreille.
  4. Fixer les extrémités supérieures de la souris sur la scène avec ruban chirurgical.
  5. Ensuite, accrochez la chaîne dans les incisives supérieures avant et serrer jusqu'à ce que la mâchoire atteint une position horizontale. Utilisez une pince courbe inclinée pour tirez légèrement sur la langue de la bouche, ce qui facilite la respiration.
  6. Fermement, mais pas avec force, tirer la queue et le coller à la scène.
  7. Alignez les barres d’oreilles pour atteindre un angle d’environ 30° entre la barre et le bord de la scène. Pour assurer cet angle, utilisez une règle de triangle pour tracer un angle droit et gauche de 30° sur une feuille de papier et placer la scène transparente sur le papier pour aligner les détenteurs en conséquence.
  8. Fixer la mâchoire entre les barres d’oreilles en déplaçant simultanément la barre de gauche et de droite vers l’intérieur jusqu'à ce que la mâchoire est immobiles, puis serrer les vis. Observer les mouvements thoraciques avant, pendant et après la correction de la mâchoire. Réduction ou absence de respiration indique que les barres sont fixées au niveau du cou, pas les os de la mâchoire ; dans ce cas, répétez la procédure de fixation immédiatement.
  9. Assurer le chauffage à la souris, par exemple, en plaçant une lampe chauffante est proche ou un coussin chauffant sous la scène.

4. exposition chirurgicale de la glande salivaire à l’aide d’un stéréomicroscope

Remarque : Les étapes suivantes nécessitent l’utilisation d’un stéréomicroscope et fine pince ciseaux chirurgicaux. Étant donné que la procédure est en phase terminale, il n’est pas nécessaire de maintenir des conditions de fonctionnement stériles. Les instruments nettoyés éthanol suffisant.

  1. Localiser la position approximative du lobe droit SMG en recherchant un léger renflement dans la peau d’environ 15 mm de caudale de la bouche et médiale de 5 mm de la ligne de la mâchoire. Soulevez un pli de peau petit au centre des Ardennes et couper pour créer et ouverture d’environ 5 mm de longueur.
  2. Appliquer immédiatement un anneau de 4 mm de hauteur d’aspiration graisse sur la peau qui entoure la coupe. (Utilisez une seringue remplie de graisse sous vide avec une seringue hypodermique 25 G atténuée).
  3. Remplir l’anneau de la graisse avec une solution saline pour s’assurer que le tissu reste humide pendant l’opération.
  4. Sous le stéréomicroscope, perturber le tissu conjonctif en utilisant la procédure suivante : utiliser une pince fine pour tenir un morceau de tissu conjonctif directement attaché à la SMG et utilisez une deuxième pince pour tirer le tissu conjonctif distal jusqu'à ce qu’il se rompt. Veiller à ce que certains tissus conjonctifs reste attaché à la SMG ; C’est souhaitable car il permet la manipulation. Ne pas toucher la glande elle-même avec la pince, car cela va provoquer des saignements.
  5. Répétez ce mouvement de perturber le tissu conjonctif tout d’abord sur le dessus de la glande, puis sur la partie médiane (entre le lobe droit et gauche de la SMG). Ne pas dissocier la sublinguale de la glande sous-maxillaire.
  6. Continuer à retirer le tissu conjonctif latéral vers la gauche autour de la SMG (médial à caudales, en distal, à rostrale).
  7. Veiller à ce que l’approvisionnement en sang, vaisseaux lymphatiques efférents et conduit salivaire, qui sont tous situés dans un forfait sur le site crânien de la glande, ne sont pas s’est rompus.
  8. Une fois que le tissu conjonctif latéral est perturbé, utiliser pince à tirer sur le tissu conjonctif, attaché à l’extrémité caudale de la SMG vers le haut pour soulever l’extrémité caudale de la SMG. Perturber le tissu conjonctif sous le lobe SMG, à partir de la caudale et se dirige vers l’extrémité rostrale.
  9. Continuez jusqu'à ce que le tissu conjonctif à tous les sites de la SMG est supprimé (à l’exclusion du site rostral avec gros vaisseaux sanguins alimentation/vidange et le WD).

5. fixation de la glande

  1. Confirmer que la bague de graisse tenant la solution saline est au moins 4 mm de haut et pas une fuite (Voir l’étape 4.2).
  2. Installation du couvercle inférieur en verre (Voir l’étape 3.2) en attachant la barre métallique à son support réglable en hauteur. S’assurer que le titulaire de la lamelle couvre-objet est ajusté à la position maximum et ne touche pas l’anneau de graisse lorsqu’il est attaché à la scène. Positionner le support de la direction caudale à un angle d’environ 60° à la souris, avec la lamelle couvre-objet couvrant environ les deux tiers (parties caudales et distales) du lobe exposé. Abaisser le couvercle en verre jusqu'à ce qu’il entre en contact avec le gland.
  3. Terminer l’anneau de graisse sur le dessus du couvercle en verre pour former un nouveau réservoir de solution salin.
  4. Tirez doucement le lobe SMG sur le dessus de la lamelle couvre-objet avec une pince, seulement toucher le tissu conjonctif attaché à elle (l’orgue peut être retournée avec le site de bas vers le haut).
  5. Assurez-vous que l’anneau de la graisse a une même hauteur d’au moins 4 mm et ne fuit pas. Si nécessaire, remplir le réservoir de salin à l’aide d’un 30 G seringue remplie de solution saline.
  6. S’assurer que le titulaire de la lamelle couvre-objet pour le verre de couverture supérieur est dans sa position de plus grande. La vis permet de visser le support métallique avec le verre de couverture supérieure de 25 mm sur le titulaire. Utilisez les vis réglables du titulaire pour positionner le couvercle en verre de sorte que le SMG est centré dans le milieu.
  7. Utilisez les vis de support réglable pour abaisser le couvercle en verre haut, jusqu'à ce qu’elle touche directement la SMG. Observer la forme et la coloration de la glande au cours de cette étape. Si la surface de la glande apparaît plus grande, ou la coloration change (par exemple du rose au blanc), immédiatement mettre le couvercle en verre à un poste plus élevé pour soulager la pression sur la SMG.
  8. Vérifier le réservoir salin des fuites en recherchant les bulles d’air et ou des gouttes de solution saline à l’extérieur du réservoir. Si une bulle d’air ou de la fuite est détectée, retirer les lamelles et tout graisser et recommencer à l’étape 2.
  9. Vis de fermer toutes les vis de fixation.

6. fixation de l’anneau de chauffage et la sonde de température

  1. Insérer une sonde de température dans le réservoir et positionnez-le à proximité de la glande, puis le fil de la sonde sur la scène de la bande.
  2. Appliquer un anneau de graisse à la lamelle supérieure, avec le SMG dans le Centre (le diamètre de l’anneau de graisse doit correspondre au diamètre de l’anneau de chauffage). Placez l’anneau de chauffage sur le dessus de la lamelle couvre-objet et sceller avec de la graisse. Scotchez le tube de l’anneau de chauffage pour la scène.

7. imagerie

Remarque : Nous utilisons un système de microscope biphotonique vertical équipé d’un Laser accordable de Ti:Sa et d’un microscope à fluorescence avec objectifs immersion dans l’eau 20 X ou 25 X. Correction en temps réel de tissus dérive pendant l’acquisition peut être implémentée en utilisant une étape automatisée et VivoFollow19. Cela améliore la stabilité de l’acquisition d’images, mais il n’est pas nécessaire.

  1. Allumez le système de microscopie verticale à l’aide d’un logiciel approprié fourni par le fabricant de microscope. Régler le Laser Ti:Sa à une longueur d’onde d’excitation de nm 780-900.
  2. Raccordez le tuyau de chauffage à l’anneau de chauffage. Une pompe péristaltique circule l’eau chaude (chauffée en immergeant la partie du tube dans un bain d’eau de 80° C) dans l’anneau pour réchauffer la SMG.
  3. Connecter la sonde de température d’un thermomètre numérique. Régler la vitesse de la pompe péristaltique, si la température n’est pas entre 35-39 ° C. Plus vite la pompe fonctionne, obtient de l’objet le plus chaud et vice versa.
  4. Avant de commencer l’acquisition d’images, effectuer un contrôle visuel de la vitesse d’écoulement de sang. Vérifiez attentivement le passage de leucocytes dans les capillaires minces ou par injection de dextran fluorescent.
    NOTE : Dextran fluorescent injectée par voie intraveineuse immédiatement remplissent la vascularisation SMG ensemble lorsque le débit sanguin est physiologique. C’est pratiquement toujours le cas dans cette procédure.
  5. Pour suivre les cellules immunitaires, profondeur d’imagerie se situe habituellement entre 20-150 µm sous la surface de la SMG identifié par le signal de 2ème génération d’harmoniques. Piles d’image record de 150-300 µm de champ avec une résolution de pixels environ 512 x 512 ou supérieur et z-profondeurs de 20 à 60 µm avec un espacement de 2 à 4 µm entre les images. Répétez pile acquisition chaque 20-30 s pour une durée totale de 20 à 60 min.
  6. Le thermomètre numérique permettent de contrôler les niveaux de températures minimales et maximales après acquisition de la séquence d’une seule image. Jeter la séquence d’images, si la valeur minimale ou maximale n’est pas de l’ordre de 37 ° c ± 2 ° C. Remplissage de l’eau pour une immersion d’objectif entre les séquences d’images.
  7. À la fin de la séance d’imagerie, euthanasier les souris par asphyxie2 CO sous anesthésie.
    NOTE : Ceci est en accord avec les lignes directrices fédérales suisses de l’expérimentation animale ; autres lignes directrices d’euthanasie peuvent s’appliquer ailleurs.

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Résultats

Ce protocole permet l’imagerie de presque l’ensemble côté dorsal ou ventral de la SMG. Généralement, le champ de vision inclut également la glande salivaire sublinguale, qui diffère légèrement de la SMG en composition cellulaire4. Les deux glandes sont encapsulées par collagène fibrillaire et divisés en lobes. La plupart 14:00 systèmes peuvent produire une image exempte d’étiquette de collagène fibrillaire en mesurant le signal harmonique 2nd , mais géné...

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Discussion

Ce protocole propose une approche simple pour l’imagerie in vivo des glandes salivaires sous-maxillaires et sublinguales murines microscopie non linéaire verticale souvent utilisés dans le domaine de l’immunologie. La méthode peut être adaptée pour l’imagerie des autres glandes exocrines dans la région de la tête et du cou. Par exemple, notre laboratoire a réaliser l’imagerie de la glande lacrymale de manière analogue (non illustrée).

Enlever le tissu conjonctif autour de la SMG est l...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Remerciements

Ce travail a été financé par la Fondation National Suisse (FNS) projet grant 31003A_135649, 31003A_153457 et 31003A_172994 (pour JVS) et Leopoldina bourse 2011 DFP-16 (BS). Ce travail a bénéficié des configurations optiques du « Microscopie Imaging Center » (MIC) de l’Université de Berne.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Narketan 10 %  ; (Kétamine) 20ml (100 mg/ml)Vetoquinol3605877535982
Rompun 2 % (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml)Bayer680538150144
Saline NaCl 0,9 %B. Braun3535789
Prequillan 1 % (Acépromazine) 10 ml (10 mg/ml)Rasoir électrique Fatro6805671900029
Wahl9818Lou similaire
Épilation crèmeVeet4002448090656
Durapore Ruban chirurgical (2,5 cm x 9,1 m et 1,25 cm x 9,1 m)Durapore (3M)1538-1
Durapore Ruban chirurgical (2,5 cm x 9,1 m et 1,25 cm x 9,1 m)Durapore (3M)1538-0
Super colle Ultra gel, colle instantanéePattex, Henkel4015000415040
Lames de verre de protection pour microscope 20 mm et 22 mmMenzel-Glä ; ser631-1343/ 631-1344
Graisse pour laboratoires 60 g glisseal NBorer (fournisseur VWR)DECO514215.00-CA15
Ciseaux chirurgicauxOutils pour les sciences fines (F.S.T)14090-09ou similaires
Pinces finespour les sciences fines (F.S.T )11252-20ou similaires
Coton-tigeMigros617027988254ou similaire
Gaze Gazin 5 x 5 cmLohmann et Rauscher18500ou similaire
StéréomicroscopeLeicaMZ16ou similaire
Texas Red dextran 70kDa  ; Sondes moléculairesD1864
Cascade Blue dextran 10kDainvitrogenD1976
Système à deux photonsLaVision BiotecTrimScope I et IIou similaire
XLUMPLANFL 20x/0,95 W ObjectifOlympusn/aou autre objectif à immersion dans l’eau  ;
Thermomètre numériqueFluke95969077651

Références

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