Mouvements de tissu endocardique suivant via Photoconversion de cellules dans l’embryon de poisson zèbre

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour la photoconversion de la protéine fluorescente de Kaede dans les cellules du vivant endocardiques embryon de poisson zèbre qui permet le suivi des cellules endocardiaques pendant le canal atrio-ventriculaire et le développement de valve auriculo-ventriculaire cardiaque .

Résumé

Au cours de l’embryogenèse, les cellules subissent des changements dynamiques dans le comportement de la cellule, et déchiffrer la logique cellulaire sous-jacente de ces changements est des objectifs fondamentaux dans le domaine de la biologie du développement. La découverte et le développement de protéines et ont aidé considérablement notre compréhension de ces changements dynamiques en fournissant une méthode pour surligner optiquement les cellules et les tissus. Cependant, tandis que photoconversion, Time-lapse microscopie et analyse d’images ultérieures sont révélés très efficaces dans la découverte dynamique cellulaire dans des organes comme le cerveau ou le œil, cette approche est généralement pas utilisée en plein développement dû à défis posés par le mouvement rapide du cœur au cours du cycle cardiaque. Ce protocole se compose de deux parties. La première partie décrit une méthode pour photoconverting et par la suite suivi les cellules endocardiques (CPSE) pendant zebrafish canal atrio-ventriculaire (AVC) et le développement de valve auriculo-ventriculaire cardiaque. La méthode implique temporairement arrêter le cœur avec un médicament sous ordonnance pour photoconversion précise avoir lieu. Cœurs sont autorisés à reprendre le passage à tabac lors du retrait de la drogue et le développement de l’embryon continue normalement jusqu'à ce que le cœur est arrêté à nouveau pour l’imagerie haute résolution de photoconverted CDE à un moment du développement plus tard. La deuxième partie du protocole décrit une méthode d’analyse permettant de quantifier la longueur d’une région photoconverted ou non-photoconverted dans l’AVC chez les jeunes embryons en mappant le signal fluorescent de la structure en trois dimensions sur un plan bidimensionnel en image . Ensemble, les deux parties du protocole permet d’examiner l’origine et le comportement de cellules qui composent le poisson-zèbre AVC et la valvule auriculo-ventriculaire et peut potentiellement s’appliquer pour l’étude de mutants, morphants ou embryons qui ont été traités avec réactifs qui perturbent le développement AVC et/ou vanne.

Introduction

Le poisson-zèbre est actuellement un des modèles de vertébrés plus importants pour étudier les processus cellulaires et développement in vivo. C’est en grande partie en raison de la transparence optique du poisson-zèbre et susceptibilité génétique, qui en fait un modèle puissant pour l’application de techniques optiques impliquant génétiquement encodé photopériode protein technologies¹. Spécifique à l’étude du développement du cœur, zebrafish reçoivent suffisamment d’oxygène par l’intermédiaire de diffusion tels que des mutants même sans battement de coeur peuvent survivre grâce à la première semaine de développement, permettant des an....

Protocole

1. préparation des moules et montage d’agarose

1. Créer un moule avec les dimensions indiquées à la Figure 1 à l’aide d’une imprimante 3D ou les outils de l’atelier de mécanique traditionnelle.
2. Pipetter environ 1,5 mL d’agarose à 1 % fondu dans un plat de montage en plastique de 35 mm. Placer le moule en plastique dans l’agarose liquide, en prenant soin d’éviter l’air de piégeage entre le moule et le gel d’agarose. Placez le plat à 4 ° C, attendre jusqu'à ce que l’agarose durcit (cela prend environ 5 min), puis enlever le moule en plastique.
3. Pour stocker le plat de montage pour une utilisation ultérieure, couvri....

Résultats

Un exemple d’un embryon de photoconverted à 48 hpf et imagé à nouveau à 80 hpf est montré dans la Figure 2, films 1 et 2. Exposant Kaede à 405 lumière nm irréversiblement convertis de la protéine de sa forme verte fluorescente de forme rouge fluorescente, permettant le comportement des cellules marquées avec la verte ou leur forme rouge à suivre avec respectent à leur façon différente couleur voisins pendant la formation de l.......

Discussion

Calendrier des photoconversion: bien que Kaede reste brillamment exprimé en CDE même à 96 hpf, il convient de noter que que l’embryon se développe, la lumière laser diffuse plus avant qu’elle atteigne l’AVC, complique davantage la photoconversion clos de Kaede. Met en scène plus tard que 55 at embryonnaire hpf, la montgolfière le ventricule et l’oreillette signifie aussi que le faisceau laser violet utilisé pour photoconversion ne peut pas atteindre les cellules AVC sans la première traversée de l’oreillette ou .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériaux
Matériel nécessaire pour élever les poissons et collecter les œufs (voir le Zebrafish Book22 pour plus de détails).
Stéréomicroscope
Microscope confocal droit (équipé de lasers fonctionnant à 488 nm, 561 nm et 405 nm, d’un laser multiphotonique accordable et d’un objectif Leica HCX IRAPO L, 25 × ;, N.A. 0.95)	Leica	Leica SP8
Bloc chauffant	ThermoScientific	88870001
35 mm x 10 mm parabole de culture tissulaire	Falcon	353001
Plaque à 6 puits	Falcon	353046
boîte de
Pince
Pipette
Moule
réactifs
8 mg/mL Solution mère de tricaïne  ;
1 M BDM solution
UltraPure agarose à bas point de fusion	Invitrogen	16520-050
Agarose	Lonza	50004
PTU (1-phényl-2-thiourée)	Sigma Aldrich	P7629
Milieu embryonnaire : solution mère 30x <
strong>Software
Matlab équipé des boîtes à outils Analyse d’images, Ajustement de courbes, Bio-Formats	MathWorks
8 mg/mL Solution mère de tricaïne
200 mg de poudre de tricaïne (Ethyl 3-aminobenzoate de méthanesulfonique)	Sigma-Aldrich	E10521
25 mL Danieau
Ajuster au pH 7, aliquote et conserver à -20 ° ; C  ;
1 M BDM solution mère
1 g BDM	Sigma-Aldrich	112135
10 mL ddH2O
Aliquot et conserver à -20 ° ; C
Milieu embryonnaire : 30x solution mère
50,7 g NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
0,78 g KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
1,47 g Sulfate de magnésium	Sigma-Aldrich	; 7487-88-9
2,1 g Nitrite de calcium tétrahydraté	Sigma-Aldrich	13477-34-4
19,52 g HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique)	Sigma-Aldrich	7365-45-9
Ajuster à pH 7,2 et conserver à température
Moule
Résine	PlasCLEARAsiga
Plus 39  ; Imprimante 3D Pico de forme libre	Asiga

Pétrien verremère ambiante