Article de méthode

Réplication de l’ordonné, bibliothèque non redondante de la souche Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon Mutants d’Insertion

DOI :

10.3791/57298

⸱

4 mai 2018

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1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infection à Pseudomonas aeruginosa entraîne une morbidité importante chez les hôtes vulnérables. La bibliothèque de mutant d’insertion de transposon non redondante de la souche P. aeruginosa PA14, désignée comme la valeur de PA14NR, facilite l’analyse de la fonctionnalité des gènes dans de nombreux processus. Présenté ici est un protocole de générer des copies de haute qualité de la bibliothèque de mutant PA14NR défini.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative plan phénotypique et génotypique diversifiée et adaptable très répandue dans les environnements humains. P. aeruginosa est capable de former des biofilms, développent une résistance aux antibiotiques, produisent des facteurs de virulence et évoluent rapidement dans le cadre d’une infection chronique. Ainsi P. aeruginosa peuvent causer tant aiguës et chroniques, difficiles à traiter les infections, ce qui entraîne une morbidité importante dans certaines populations de patients. Souche P. aeruginosa PA14 est un isolat clinique humain avec une structure conservée du génome qui infecte une variété d’hôtes mammifères et nonvertebrate faisant PA14 une souche attrayante pour l’étude de ce pathogène. En 2006, une bibliothèque de mutants d’insertion transposon non redondante contenant 5 459 mutants correspondant à 4 596 prédit PA14 gènes a été générée. Depuis lors, distribution de la bibliothèque de PA14 a permis à la communauté de la recherche pour mieux comprendre la fonction des gènes individuels et des voies complexes de P. aeruginosa. Préservation de l’intégrité de la bibliothèque à travers le processus de réplication nécessite des techniques NOMPROPRE manutention et précis. À cette fin, ce manuscrit présente les protocoles qui décrivent en détail les étapes impliqués dans la réplication de la bibliothèque, bibliothèque contrôle de la qualité et l’entreposage adéquat des mutants individuels.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative plan phénotypique et génotypique diversifiée et adaptable présente dans le sol, l’eau et environnements plus humaines, ainsi que la microflore de la peau. Par rapport à beaucoup d’espèces bactériennes, P. aeruginosa possède un génome relativement important de 5.5-7 Mbp avec G + C haute teneur (65-67 %). En outre, une proportion importante de ses gènes sont impliquée dans l’adaptabilité métabolique et font partie de réseaux de régulation, ce qui permet une grande flexibilité dans la réponse aux stress environnementaux1. P. aeruginosa exprime une multitude de facteurs de virulence, montre la propension à forme biofilms, possède la capacité de coordonner les réponses à travers plusieurs quorum sensing voies et affiche une remarquable capacité de développer une résistance aux antibiotiques et tolérance2,3,4,5,6,7,8. Ces attributs présentent des défis importants pour traiter les infections causées par P. aeruginosa.

Chronique infections à P. aeruginosa peuvent se produire dans de nombreux États de la maladie. Fibrose kystique (FK), une maladie génétique due à une mutation du gène Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) , traduit par ailleurs, infectées de sécrétions dans les voies respiratoires, bronchiectasie progressive et, finalement, la mort d’une insuffisance respiratoire9. L’âge adulte, la majorité des patients fibro-kystiques est chroniquement infectée par P. aeruginosa, qui joue un rôle clé dans la morbidité et la mortalité associées à cette maladie10. En outre, les patients souffrant de graves brûlures blessures11, tracheostomies12, prothèses articulaires13ou de cathéters à demeure14 sont à risque d’infection à P. aeruginosa lié à la capacité de la bactérie de forme biofilms et évasion hôte réponses inflammatoires15. De plus, la colonisation se produit sans concurrence après sélection d’une population antibiotique multi résistante ou tolérante au traitement antimicrobien à large spectre, séquentielle,12,16,17 , 18. meilleure compréhension de la pathogenèse de P. aeruginosa aura des implications importantes pour nombreux états pathologiques.

Plusieurs isolats cliniques de P. aeruginosa , y compris les souches PAO1, PA103, PA14 et PAK, ont été largement étudiées afin d’étudier les différentes fonctionnalités de la pathogénèse P. aeruginosa . Souche PA14 est un isolat clinique qui appartienne à l’une des plus courantes dans le monde entier19,groupes clonaux20 et n’a pas été largement repiquée en laboratoire. PA14is hautement virulent chez les vertébrés modèles d’infection, par une endotoxine notable profil21, pili structure22, pathogénicité des Iles23, tapez système de sécrétion III (TTSS), cytotoxicité vers mammalian cells24 et profils de résistance et persistance antibiotique25. En outre, PA14 est également très virulente dans de nombreux systèmes de modèle hôte-pathogène, y compris des feuilles des plantes infiltration modèles26,27,Caenorhabditis elegans infection modèles28, 29, insecte modèles30,31, ainsi que la pneumonie souris modèles32,33 et brûlures modèles34.

Génome mutants bibliothèques sont des collections de mutants isogéniques de gènes non essentiels qui constituent des outils très puissants pour comprendre la biologie de l’organisme en permettant l’analyse de la fonction des gènes à l’échelle génomique. Deux bibliothèques près de saturation transposon insertion mutant construits chez P. aeruginosa sont actuellement disponibles pour distribution. Les sites d’insertion des transposons ont été déterminées pour les deux bibliothèques. Ces dits bibliothèques non redondante facilitent les études de Génome-large de souches bactériennes en diminuant considérablement le temps et de coûts impliqués dans dépistage indéterminées mutants transposon aléatoire. La bibliothèque mutante de transposon PAO1 P. aeruginosa , construite dans le MPAO1 isoler de souche PAO1 utilisant les transposons ISphoA/ hah etlacZ/ hah35, est organisée par le laboratoire Manoil, Université de Washington. La bibliothèque se compose d’une collection de vérifier à la séquence de 9 437 mutants transposon qui fournit une couverture large de génome et inclut deux mutants pour la plupart gènes36. Informations sur la bibliothèque mutante de P. aeruginosa PAO1 transposon sont disponibles sur le site de lab Manoil public, accessible par internet à http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. P. aeruginosa souche PA14 transposon non redondante insertion bibliothèque mutante (valeur PA14NR) construit en souche PA14 utilisant les transposons MAR2xT7 et TnphoA37 est actuellement distribué par le département de pédiatrie au Massachusetts General Hospital. Le PA14NR Set comprend une collection de plus de 5 800 mutants avec insertions de transposon unique dans des gènes non essentiels37. Détails sur la construction de l’ensemble de la PA14NR sont décrits dans le site public, accessible par internet http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, qui contient également une variété d’outils de recherche en ligne pour faciliter l’utilisation de la PA14NR Ensemble.

L’original PA14NR Set comprend 5 459 mutants, choisis parmi une bibliothèque complète d’environ 34 000 transposon aléatoire mutants d’insertion, qui correspondent aux 4 596 gènes PA14 prédites, ce qui représente 77 % de toutes les prévisions PA14 gènes37. Depuis la construction de la bibliothèque en 2006 les nouveaux mutants ont été ajoutés, et le PA14NR Set comprend actuellement plus de 5 800 mutants38 qui représentent environ 4 600 PA14 gènes. La majorité des mutants transposon PA14 générée dans le type sauvage fond37. Précisions relatives à chaque membre de la bibliothèque mutante, y compris les antécédents génétiques, sont disponibles par le biais de la recherche de la base de données en ligne ou en téléchargeant la feuille de calcul de bibliothèque non redondante, ces deux fonctionnalités disponibles sur le site de PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.CGI). La majorité des mutants ont été créée à l’aide de la MAR2xT7 (MrT7) transposon, avec un petit ensemble créé à l’aide du transposon de TnPhoA (phoA)37. Chaque transposon a une cassette de résistance aux antibiotiques, ce qui permet la sélection de mutants à l’aide de gentamicine (MrT7) ou la kanamycine (phoA). L’ensemble PA14NR de mutants est stocké dans soixante-trois plaques à 96 puits et inclut un contrôle 96 puits supplémentaire deux plaques qui se composent de type sauvage PA14 inoculés et non inoculés puits intercalaient dans un modèle prédéfini. Le format de la plaque à 96 puits couplé avec les outils de recherche en ligne grandement facilite le développement personnalisé de dosages qui permettent aux utilisateurs d’identifier facilement les gènes associés aux phénotypes mutants de dépistage. Les outils de recherche en ligne facilitent également la recherche et la sélection de mutants de pertinents supplémentaires requis pour poursuivre ses études.

Les bibliothèques de mutant de transposon PA14 et PAO1 sont très importantes ressources globales pour la communauté scientifique, et ils complètent mutuellement dans la validation de la fonction des gènes inconnus et les voies de cet bactérie pathogène. Par coïncidence, depuis la construction des bibliothèques de mutation du transposon PAO1 et PA14, analyse de séquençage d’ADN du génome complet de nombreux isolats de P. aeruginosa a montré que PAO1 et PA14 appartiennent à différents sous-clades principaux de la P. aeruginosa phylogénie7,39,40,41. Parce que les isolats cliniques de P. aeruginosa se trouvent répartis tout au long de la phylogenèse, le fait que PAO1 et PA14 appartiennent à différents de P. aeruginosa sous-groupes accroît la valeur des deux bibliothèques transposon mutation pour comparative études.

Les publications décrivant la construction et de criblage des bibliothèques de mutant bactériennes, y compris les bibliothèques P. aeruginosa 35,37,42, sont facilement disponibles dans la littérature. Cependant, au meilleur de notre connaissance, aucun protocoles publiés décrivant les modalités et les techniques utilisées pour la réplication, entretien et la validation des bactéries mutantes bibliothèques existent.

La méthode exposée dans la présente publication décrit un ensemble de trois protocoles qui facilitent l’utilisation et l’entretien de l’ensemble de la PA14NR. Le premier protocole décrit la réplication de la bibliothèque comme recommandé aux bénéficiaires de l’ensemble de la PA14NR. Le deuxième protocole comprend des lignes directrices pour les rayures, de plus en plus et les stocker différents mutants identifiés à l’aide de la valeur de PA14NR. Le troisième protocole décrit les techniques de contrôle de la qualité, y compris amplification par PCR de fragments de mutants de transposons et séquençage subséquent pour confirmer l’identité de mutant. Cet ensemble de protocoles peut être également adapté pour la réplication et l’entretien des autres bactéries mutantes bibliothèques ou des collections. La reproduction des bactéries mutantes bibliothèques ou des collections est vivement conseillée pour préserver l’intégrité de le « original » (copie originale reçue). Réplication de plusieurs copies de l’ensemble des PA14NR de laboratoire de routine minimise la probabilité de contamination interwell de l’original.

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Protocole

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ATTENTION : Utiliser des mesures de sécurité standards BSL-2 lors de la manipulation de P. aeruginosa, un pathogène humain. Si vous êtes une personne immunodéprimée ou toute condition médicale qui augmente votre susceptibilité à l’infection bactérienne, prendre des précautions spéciales lorsque vous travaillez avec P. aeruginosa. Consulter le Bureau de la biosécurité dans votre établissement et obtenir l’approbation de votre médecin avant d’utiliser le le PA14 NR Set ou bibliothèques mutants de bactéries pathogènes.

figure-protocol-1
Figure 1 : aperçu du protocole i : réplication de le PA14NR. Jour 1 : Répliquer des cultures mutantes congelées de « copie principale » de la valeur de PA14NR dans LB gélosé et cultiver des mutants pendant une nuit à 37 ° C. Jour 2 : Transfert en croissance mutante de LB gélosé à bien les blocs épais contenant le bouillon liquide LB, poussent en une nuit à 37 ° C sous agitation à 950 tr/min. Jour 3 : Mélanger une nuit LB cultures avec le glycérol, puis transférez-les vers des plaques de 96 puits destination pour le stockage à long terme. 96 place plats plat dans le congélateur-80 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-2
Figure 2 : recommandé installation. Stérilité et workflow lisse doivent être maintenus grâce à l’utilisation des précautions appropriées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

1. le protocole i : réplication de le PA14NR définir

Remarque : La réplication de la bibliothèque est possible en divisant la valeur PA14NR en quatre sous-ensembles de seize assiettes qui peuvent être traitées dans les quatre semaines consécutives. Génération de 1 à 6 copies adhère au flux de travail hebdomadaire décrite dans le tableau 1, alors que la génération de plus de 6 copies suit le flux de travail hebdomadaire, décrite dans le tableau 2. Pour générer des 12 exemplaires de l’ensemble de la PA14NR, ensemencer le même sous-ensemble de PA14NR dans un milieu LB liquide le jour 2 et encore une fois sur 3 jours (à partir de la même série de boîtes de gélose répliquées sur 1 jour) et le transfert pendant la nuit cultures mutantes en plaques copie sur jour 3 et jour 4 respectivement.

Jour 0Jour 1Jour 2Jour 3
Journée de préparationCroissance de mutants PA14NR défini sur milieux gélosés LBCroissance de mutants PA14NR mis dans un milieu liquide LBTransfert de PA14NR la valeur des cultures mutantes aux plaques de destination

Tableau 1 : calendrier de réplication de 1-6 exemplaires du jeu de PA14NR de. Réplication d’un petit nombre de copies peut adhérer à un flux de travail hebdomadaire.

Jour 0Jour 1Jour 2Jour 3Jour 4
Journée de préparationCroissance de mutants PA14NR défini sur gélose LBCultiver des mutants PA14NR mis dans un milieu liquide LBTransfert du jour 3 cultures mutantes pour générer le 1er set de 6 exemplaires de PA14NR SetTransfert du jour 4 cultures mutantes pour générer le 2ème set de 6 exemplaires de PA14NR Set
Croissance de mutants PA14NR mis dans un milieu liquide LB

Tableau 2 : calendrier de réplication jusqu'à 12 exemplaires du jeu de PA14NR de. Réplication d’un plus grand nombre de copies exigera la superposition dans un flux de travail hebdomadaire.

  1. Jour 1 : Croissance de PA14NR Set Master copie sur plaques de gélose LB
    1. Porter des gants, blouse et masque pour gérer l’ensemble de la PA14NR.
    2. Désactivez le banc et essuyez la surface avec l’éthanol à 70 %.
    3. Préparer LB agar médias43 et stériliser en autoclave pour 25 min. Cool media à 55 ° C dans l’eau de bain et ajoute soit gentamicine 15 µg/mL, pour des mutants contenant des insertions du transposon MAR2xT7 , ou 200 µg/mL kanamycine, mutants contenant TnphoA insertions.
    4. Versez fondu LB agar en plaques rectangulaires à l’aide d’environ 60 mL de médias par plaque. Plaques sèches dans une hotte stérile pendant environ 1 h avant utilisent. Assurez-vous qu’il n’y a aucune condensation d’eau sur la surface de la gélose. Stocker les plaques à 4 ° C, si nécessaire.
    5. Créer un champ stérile avec un bec Bunsen sur paillasse éthanol essuyé et mis en place des conteneurs avec des solutions adaptées pour la stérilisation de broche replicator (voir étape 1.1.9). Cliquez sur Ouvrir les contenants en plastique (5,25" L x 4.25" W x 1.75 « H taille approximative) pour la stérilisation de broche de replicator. Contenants de plastique autoclave avant utilisation.
      Remarque : La chaleur de la flamme du bec Bunsen crée une convection current, qui chauffe l’espace au-dessus de la flamme et soulève des particules dans l’air vers le haut et loin de l’air frais dessous, gardant la zone de travail stérile.
    6. Enlever un maximum de quatre plaques de maître PA14NR Set du congélateur-80 ° C (pour éviter la décongélation inutile) et placez-les sur la glace sèche dans la plaque de glace de 4 L.
    7. Prendre la plaque 96 puits maître à être répliqués de glace sèche et placez-le sur le banc pour permettre le dégel brève, qui ne prendra le temps nécessaire pour la stérilisation des broches replicator (environ 3-4 min) (voir étape 1.1.8). Marquer la position de la coordination de l’A1 sur la gélose avant emboutissage. Aligner le plat principal et gélose avec la coordonnée A1 des deux plaques dans le coin supérieur gauche.
    8. Stériliser le réplicateur « pins » en suivant les étapes décrites ci-dessous. Tapoter légèrement replicator après chaque étape pour enlever l’excès de liquide.
      1. Immerger les épingles dans 250 mL de 0,3 à 0,5 % d’hypochlorite de sodium (eau de Javel domestique 10 %) pendant 30 secondes. Minimiser le contact avec une solution d’hypochlorite de sodium, car elle peut conduire à endommager des goupilles. Immerger les épingles dans 250 mL stérile ddH2O ou l’eau ultrapure stérile pendant 10 secondes, puis dans 250 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 secondes, puis dans 250 mL d’éthanol à 95 % pendant 2 min.
      2. Flamme stériliser épingles replicator en tenant replicator perpendiculairement à la flamme du bec Bunsen, approchant lentement flamme jusqu'à ce que l’éthanol s’enflamme, puis retirer immédiatement de la flamme. Flamme s’éteint une fois tous les brûlures de l’éthanol hors. Gardez un couvercle ou un autre récipient étroit par étouffer la combustion d’éthanol, si nécessaire.
        NOTE : Soyez extrêmement prudent lorsque vous travaillez avec de l’éthanol près d’une flamme. NE tenez pas le réplicateur directement sur la flamme.
      3. Cool épingles en épinglant sur un plat rectangulaire stérile inutilisé, contenant LB gélosé pendant 30 secondes.
    9. Brièvement aluminium chaud flasque du maître PA14NR définir avec votre main avant il décolle. Cela, en refroidissant les goupilles de replicator. Enlever le joint en aluminium avec précaution pour éviter le joint de la plaque de retouche. Pince à épiler permet d’enlever des restes de joint en aluminium.
    10. Insérer dans plat principal, en poussant doucement et replicator se balançant dans les quatre directions pour faire en sorte que broches replicator pivots de contact avec les cultures bactériennes congelées dans chacun des puits-96. Prêter une attention particulière aux puits situé sur le bord extérieur de la plaque en poussant les épingles replicator contre cultures congelées dans les puits situés au bord de la plaque.
    11. Placez délicatement les épingles replicator sur la surface de la gélose. Déplacez replicator dans un léger mouvement circulaire de forme mini-pelouses d’environ 4-5 mm pour chaque souche mutante. Éviter la possibilité que les mini-pelouses peuvent se chevaucher, afin d’éviter la contamination croisée.
    12. Joint plat principal PA14NR la valeur avec un nouveau joint d’aluminium stérile. Ne pas toucher le côté adhésif aluminium joint un point quelconque de l’autre pour éviter la contamination. Assurez-vous que chaque puits et les bords des plaques sont hermétiquement à l’aide d’un rouleau de plat. Plaque de retour 96 puits à glace sèche.
    13. Répéter pour chaque plat principal.
    14. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après la manipulation de l’ensemble de la PA14NR.
    15. Transfert des géloses répliqué à 37 ° C incubateur et incuber pendant la nuit.
  2. Jour 2 : Croissance de la copie maître de la valeur de PA14NR dans un bouillon liquide LB
    1. Préparer de liquide bouillon LB43 contenant soit gentamicine 15 µg/mL, pour des mutants contenant des insertions du transposon MAR2xT7 , ou 200 µg/mL kanamycine, mutants contenant des insertionsphoA Tn.
    2. Effacer la hotte à flux laminaire du matériel inutile et allumez le ventilateur de la hotte pendant au moins 10 min avant de commencer le travail. Essuyer les surfaces de la hotte et tous les produits dans la hotte à l’aide d’éthanol à 70 %.
    3. Remplir les blocs de puits profonds de 2 mL avec 525 µL de bouillon liquid LB contenant des antibiotiques appropriés sous hotte à flux laminaire à l’aide d’une pipette électronique de 12 canaux µL 50-1200. Puis, transfert en blocs de puits profonds remplis de médias à paillasse essuyé l’éthanol. Réutiliser les conseils tant que les conditions stériles sont maintenues.
    4. Porter des gants, blouse et masque pour gérer la valeur PA14NR.
    5. Désactivez le banc et essuyez la surface avec l’éthanol à 70 %.
    6. Apporter des boîtes de gélose avec des souches mutantes cultivées pendant la nuit à paillasse.
    7. Créer un champ stérile avec un bec Bunsen sur paillasse éthanol essuyé et mis en place des conteneurs avec des solutions adaptées pour la stérilisation de broche replicator (voir étape suivante).
    8. Stériliser les replicator « broches » suivant les étapes décrites ci-dessous. Tapoter légèrement replicator après chaque immersion pour enlever l’excès de liquide.
      1. Immerger les épingles dans 250 mL de 0,3 à 0,5 % d’hypochlorite de sodium pendant 30 secondes. Minimiser le contact mâle réplicateur avec une solution d’hypochlorite de sodium, car elle peut conduire à endommager des goupilles. Ensuite, plonger épingles dans 250 mL stérile ddH2O ou eau ultrapure pendant 10 secondes, puis dans 250 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 secondes, puis dans 250 mL d’éthanol à 95 % pendant 2 min.
      2. Flamme stériliser épingles replicator, puis cool épingles en épinglant dans inutilisés plaque rectangulaire contenant LB gélosé pendant 30 secondes.
        Remarque : Faire extrêmement attention lorsque vous travaillez avec de l’éthanol près d’une flamme (voir 1.1.8).
    9. Doucement placer des épingles replicator sur gélose contenant croissance mutante et vérifiez que les broches sont en contact avec tous les 96 mutants sur gélose, puis submerger les épingles dans des puits profonds contenant le bouillon liquide LB. Évitez de toucher les parois du puits avec les broches.
    10. Sceller le puits profond bloc avec une membrane d’étanchéité perméable à l’air stérile. Utiliser un rouleau de plat pour s’assurer que chaque individu est bien correctement scellé.
    11. Répéter pour chaque plat d’agar.
    12. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après la manipulation de l’ensemble de la PA14NR.
    13. Croître inoculés cultures liquides pour les 15-16 h à 37° C à 950 tr/mn à l’aide d’un agitateur de haute vitesse, si elles sont disponibles.
      Remarque : Si un shaker haute vitesse n’est pas disponible, l’incubation des blocs de puits profonds dans shaker à 250-300 tr/min est faisable. Cependant, il y a plus de chances de petite colonie variantes (VCS)25 émergents dans des conditions de faible oxygénation. Par conséquent, il est fortement recommandé de garder l’incubation fois sous 15-16 h en cultivant des cultures dans des puits profonds blocs à basse vitesse de l’agitateur. Prolifération indésirable des VCS en mutants puits peut altérer les phénotypes mutants lors de l’utilisation de la bibliothèque pour exécuter des écrans génétiques.
      Certains puits dans le jeu de la PA14NR contiennent des mutants en croissance/non-croissance lente, manquant de clones, ou contenant des médias non inoculés. L’emplacement de ces puits a été enregistré et peut être trouvé dans le fichier de PA14NR Set puits des informations complémentaires accompagnant cette publication.
  3. Jour 3 : Transfert de PA14NR la valeur des cultures durant la nuit en plaques de destination
    1. Effacer la hotte à flux laminaire et allumez le ventilateur de la hotte pendant au moins 10 min avant de commencer le travail. Essuyer les surfaces de la hotte et tous les produits dans la hotte à l’aide d’éthanol à 70 %.
    2. Imprimer des étiquettes adhésifs imperméable à l’eau (voir fiche supplémentaire PA14NR Set étiquettes pour modèle). Supprimer 96 plats en plastique enrouler à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Plaque de décoller l’étiquette et le placer en bordure de la plaque plus proche de l’A1 à H1 puits de la plaque de destination. Un peu soulever le couvercle de la plaque de destination et placer l’étiquette sur le bord inférieur pour afficher l’étiquette lorsque la plaque est recouverte d’un couvercle.
    3. 3,5 L de 60 % de glycérol (v/v) de préparer et stériliser 20 min en autoclave.
    4. Porter des gants, blouse et masque pour gérer l’ensemble de la PA14NR. Blocs de puits profonds prélever sur shaker haute vitesse ou secouage régulier.
    5. Transfert de blocs de puits profonds à hotte stérile à flux laminaire et retirez soigneusement la membrane d’étanchéité respirante. Remplacer avec le joint en aluminium. Spin-down les blocs de puits profonds à très basse vitesse pour recueillir la condensation (30 secondes à 50-150 g, puis décélérer rapidement par la présence de frein centrifuge sur).
    6. Transférer des blocs de puits profonds à hotte stérile et à l’aide d’une pipette électronique de 12 canaux µL 50-1200 et stériles filtrées conseils ajouter 525 µL du mélange de bouillon liquide de glycérol/LB (parts égales LB liquide bouillon et 60 % solution de glycérol) dans chaque puits. La composition de pipetage doucement 300 µL monter et descendre 3 fois avec pipette Electronique. Contact conseils à côté du puits avant d’éjecter les conseils pour éviter les gouttes. Conseils d’éjection et continuer avec la ligne suivante jusqu'à ce que fait avec le bloc entier de puits profonds.
    7. À l’aide de la pipette électronique à répétition 12 canaux avec embouts filtré, pour éviter la contamination interwell pendant aliquotage, tirer 900 µL de culture mutante et distribuer 150 µL dans chaque plaques 96 puits destination de générer 6 exemplaires de la plaque de la bibliothèque. Empêcher les gouttes en touchant la paroi du puits avec des conseils avant de commencer le transfert de la culture en plaques de destination. Si aucune répétition pipette n’est disponible, utiliser une pipette multicanaux pour distribuer 150 µL dans chacune des six plaques 96 puits, en utilisant la technique décrite ci-dessus pour éviter les gouttes.
    8. Joints en aluminium stérile permet de recouvrir les plaques et utilisez un rouleau plaque complètement joint plaque bords et tous les puits. Veillez à ne pas couvrir l’identificateur d’étiquette avec le joint d’étanchéité en aluminium. Ne secouez pas les plaques, que la culture peut éclabousser sur les côtés des puits ou sur le joint en aluminium.
    9. Enlever les plaques scellées de plaques hotte et place sur un plat, surface plane dans le congélateur à-80 ° C.
    10. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après avoir manipulé de la bibliothèque.
    11. Effectuer les contrôles de qualité après la réplication de la bibliothèque et après l’utilisation de la bibliothèque pour exécuter des écrans génétiques (voir Protocole III).

2. le Protocole II : Manutention et entreposage des Mutants individuels de l’ensemble PA14NR

  1. Jour 1 : Mutant Streak d’intérêt
    1. Identifier l’emplacement du mutant d’intérêt par le biais de la http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS lien PA14NR Set ou en utilisant le fichier Library.xls non redondante téléchargé depuis le lien http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/downloads.CGI). Prenez note de l’antibiotique nécessaire pour sélectionner chaque mutant particulière (gentamicine ou kanamycine).
    2. Préparer les milieux gélosés LB, stériliser en autoclave pendant 20 à 25 minutes et refroidir à 55 ° C au bain-marie. Ajouter 15 gentamicine µg/mL pour les mutants contenant des insertions du transposon MAR2xT7 et 200 µg/mL kanamycine mutants contenant des insertions de transposon TnphoA . Versez les milieux gélosés LB sur plaques (plaques rondes ou rectangulaires sont suffisants). Plaques sèches sous hotte stérile pendant environ 30 min à 1 h avant utilisent.
    3. Stériliser tous les ustensiles en plastique et des fournitures non stérile avant utilisation.
    4. Porter des gants, blouse et masque pour gérer l’ensemble de la PA14NR. Effacer le banc et essuyez la surface avec l’éthanol à 70 % avant de travailler avec le jeu de PA14NR.
    5. Créer un champ stérile avec un bec Bunsen.
    6. Enlever la plaque à 96 puits PA14NR Set avec mutant d’intérêt du congélateur-80 ° C et placez-le sur la glace sèche, prenez le récipient de glace sèche sur le banc et placer brièvement plaque à 96 puits sur le dessus de banc pour permettre un léger dégel (environ 1-2 min).
      NOTE : Conserver un enregistrement de toutes les plaques à 96 puits PA14NR Set accédé à des mutants individuels strie, car plus d’accès aux plaques de bibliothèque est corrélé à un risque accru de contamination interwell.
    7. Aluminium chaud joint avec la main avant décolle, en prenant soin d’éviter le sceau de retouche la plaque. Pince à épiler permet d’enlever des restes de joint en aluminium.
    8. Repérez le mutant d’intérêt sur la plaque à 96 puits. Utiliser une baguette en bois stérile ou pipette stérile pour prendre une petite quantité de culture congelée de l’individu cupule contenant le mutant d’intérêt.
    9. Strie congelé culture sur gélose de colonies mutantes unique comme suit : délicatement étalées les bactéries sur une section de la plaque pour créer strie 1, à l’aide d’une pointe en bois frais, stérile en bâton ou d’une pipette, faites glisser par le biais de strie 1 et étaler les bactéries sur une deuxième partie de la plaque, pour créer la séquence 2. À l’aide d’une troisième pointe stérile de bâton ou d’une pipette en bois, faites glisser par le biais de strie 2 et transmettre la bactérie au cours de la dernière section de la plaque, pour créer la séquence 3.
    10. Flasque de source avec un nouveau joint d’aluminium stérile. Ne pas toucher le côté adhésif aluminium joint un point quelconque de l’autre pour éviter la contamination. Assurez-vous que chaque puits et les bords de la plaque sont hermétiquement à l’aide d’un rouleau de plat. Plaque de retour 96 puits à neige carbonique et ensuite au congélateur à-80 ° C.
    11. Incuber la gélose dans incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
    12. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après avoir manipulé de la bibliothèque.
  2. Jour 2 : Croissance du mutant d’intérêt dans un bouillon liquide LB
    1. Préparation liquide LB bouillon contenant 15 µg/mL gentamicine ou 200 kanamycine µg/mL, selon les directives de l’insertion de transposon.
    2. Porter des gants, blouse et masque pour gérer de P. aeruginosa.
    3. Désactivez le banc et essuyez la surface avec l’éthanol à 70 %. Créer un champ stérile avec un bec Bunsen.
    4. Transfert de 3 à 5 mL de bouillon LB avec l’antibiotique approprié dans tube à culture stérile avec capuchon.
    5. À l’aide d’un applicateur stérile ou un embout de la pipette stérile, prélever une colonie unique de souche mutante et il ensemencer LB médias.
    6. Incuber les cultures en milieu liquide LB à 37 ° C dans un agitateur à 225-250 tr/min jusqu’au lendemain.
    7. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après avoir manipulé de P. aeruginosa.
  3. Jour 3 : Magasin mutant d’intérêt dans le congélateur-80 ° C
    1. Cryovial étiquette avec le nom de mutant, antibiotiques ajoutés au bouillon LB et date du stockage.
    2. Préparer 500 mL de 50 % (v/v) de glycérol et stériliser en autoclave.
    3. Porter des gants, blouse et masque pour gérer de P. aeruginosa.
    4. Banc de claire et/ou flot laminaire hotte et essuyez la surface avec l’éthanol à 70 %.
    5. Retirez le tube contenant la culture mutante de shaker.
    6. Préparer un petit récipient avec la glace sèche.
    7. Utiliser une hotte à flux laminaire ou créer un champ stérile sur paillasse éthanol essuyé avec bec Bunsen.
    8. Ajouter une quantité égale de culture bactérienne et 50 % de glycérol à la cryovial étiqueté à l’aide des conditions stériles et mélanger doucement avec la pipette (volume final 1-2 mL/flacon selon la taille de le cryovials utilisé). Place cryovial sur glace sèche à stockez-les.
    9. Placez cryovial dans sa boîte étiquetée au congélateur-80 ° C.
    10. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après la manipulation de P. aeruginosa.

3. Protocole III : contrôle de la qualité d’ensemble de PA14NR

  1. Sélectionnez un ensemble aléatoire de mutants de plaques nouvellement répliqués pour détecter d’éventuelles contaminations interwell (essai de 30-40 mutants est recommandé).
    Remarque : Dans les cas où il est nécessaire de confirmer l’identité d’un mutant utilisée pour la caractérisation d’un gène spécifique, il est recommandé d’effectuer l’amplification PCR avec des amorces gène-spécifique conçus pour la séquence connue du gène qui contient la insertion de transposon. Bien que plus difficile, les avantages de l’utilisation arbitraire des amorces PCR plutôt que des amorces PCR du gène-spécifique lorsque amplyfing DNA fragments de mutants de transposon incluent la facilité de confirmation mutante à grande échelle et la capacité à détecter la présence du potentiel contaminants. À des fins de contrôle de la qualité, il n’est pas nécessaire obtenir les données de séquençage PCR haute qualité pour tous au hasard des mutants slected, tant qu’un nombre suffisant de mutants est examiné afin d’évaluer le taux d’erreur.
  2. Suivre le « Protocole II » pour ensemencer et de développer des souches mutantes.
  3. Stériliser tous les ustensiles en plastique et des fournitures non stérile avant utilisation.
  4. Isoler l’ADN génomique de la méthode préférée. De l’analyse décrite dans cet ouvrage, un kit d’isolation de l’ADN génomique a été utilisé suivant les protocoles du fabricant. Plusieurs souches mutantes peuvent être analysées en même temps.
  5. Mesurer la concentration d’ADN génomique à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume. Ajuster la concentration d’ADN génomique à environ 100 ng/µL.
  6. Utiliser l’ADN génomique en tant que modèle pour exécuter « Réaction PCR1 » tel que décrit à l’étape 1 du tableau 3, générer des fragments PCR Arb1 (Figure 3). Amorces pour cette étape sont répertoriés dans le tableau 4.
  7. Ajouter 0,5 µL de 10 x chargement tampon à 5 µL de réaction PCR1, charger dans un gel d’agarose de 1,5 à 2 % et exécutez le gel à 80-150 V.
    Remarque : Une longueur de fragment spécifique ou une plage de fragment particulier ne devrait pas, et plus d’une bande peut être présente comme l’amorce arbitraire peut lier à plusieurs emplacements.
  8. Utiliser l’ADN de réaction PCR1 en tant que modèle pour exécuter la « Réaction de PCR2 » tel que décrit à l’étape 2 du tableau 3, générer des fragments PCR Arb2 (Figure 3). Amorces pour cette étape sont répertoriés dans le tableau 4.
  9. Ajouter 0,5 µL de 10 x chargement tampon à 5 µL de la réaction de PCR2, charger dans un gel d’agarose de 1,5 à 2 % et exécutez le gel à 80-150 V.
    Remarque : Une longueur de fragment spécifique ou une plage de fragment particulier ne devrait pas, et plus d’une bande peut être présente comme l’amorce arbitraire peut lier à plusieurs emplacements.
  10. Envoyer la réaction de PCR2 avec amorce de transposon-spécifique approprié pour l’ordonnancement.
  11. Analize byBLASTing résultats de séquençage eux contre le génome complet de PA14 en utilisant le lien BLAST fournis sur le site Web de la bibliothèque PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) ou par leur dynamitage directement contre la séquence de gènes spécifiques de le mutant d’intérêt.
    NOTE : Informations sur les mutants sélectionnés se trouvent en cherchant sur le site de PA14NR Set (recherche http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS ou télécharger le Library.xls non redondante fichier depuis le lien http:/ / pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi).

figure-protocol-3
Figure 3 : PCR amplification et le séquençage des mutants d’insertion de transposon. Vue schématique des étapes impliquées dans l’amplification par PCR et séquençage pour vérification d’identité mutante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Installation de réaction PCR
Étape 1Étape 2
Réaction PCR1 : Réaction de PCr2 :
Eau de 23,25 µL (qualité biologie moléculaire)19.15 µL eau (qualité biologie moléculaire)
Polymérase de Taq 3µL 10 x tampon5 µL 10 x tampon Taq polymérase
0.5µl Taq polymérase0,6 µL Taq polymérase
0,625 µL 20 µM amorce Arb1D (tableau 4)0,625 µL 20 µM amorce Arb2A (tableau 4)
Amorce de transposon-spécifique de 20 µM 0,625 µL (PMFLGM. 3 GB ou Tn5Ext) (tableau 4)Amorce de 0,625 mL 20 µM Transposon-spécifique (PMFLGM. 2 GB a ou Tn5Int2) (tableau 4)
1 µL 10 mM dNTPs1 µL 10 mM dNTPs
1 µL d’ADN génomique, 100 ngRéaction PCR1 5 µL
Réactionnel final 30 µLRéactionnel final 30 µL
Paramètres de réaction PCR
PCR1 Thermocycleur Conditions : PCr2 Thermocycleur Conditions:
95 ° C – 2 min95 ° C – 2 min
Répétez 5 cycles :Répétitivité des cycles de 30 :
95 ° C – 30 s95 ° C – 30 s
30 ° C – 1 min54 ° C – 30 s
72 ° C – 1 min72 ° C – 1,5 min
Répétitivité des cycles de 30 :72 ° C – 10 min
95 ° C – 30 s4 ° C – Hold
45 ° C – 30 s
72 ° C – 1 min
72 ° C – 10 min
4° C – Hold

Tableau 3 : PCR réaction mise en place et thermocycleur conditions utilisées pour PCR arbitraire. Les réactions de PCR arbitraires sont exécutées séquentiellement et fragments obtenus au cours de la réaction PCR1 sont utilisés en tant que modèle dans la réaction de PCR2. Paramètres de thermocycleur spécifiques sont utilisés pour chaque ensemble de réactions.

Nom de l’apprêtSéquence d’amorce
Amorces spécifiques de Transposon MAR2xT7
PMFLGM. GB-3 aTACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM. GB-2 aTGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 Transposon séquençage Primer
PMFLGM. GB-4 aGACCGAGATAGGGTTGAGTG
AMTphoA Transposon propres amorces
Tn5ExtGAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
AMTphoA Transposon séquençage Primer
Tn5IntCGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
Amorces arbitraires
ARB1DGGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2AGGCCAGGCCTGCAGATGATG

Tableau 4 : liste des amorces utilisées dans le contrôle de la qualité Expériences. Amorces utilisées pour l’amplification par PCR et séquençage des mutants d’insertion de transposon pour confirmer l’identité de mutant.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Douze nouvelles copies de l’ensemble de la PA14NR ont été répliqués à l’aide du Protocole I et une évaluation de contrôle de la qualité des nouvelles copies générées a été réalisée à l’aide du Protocole III.

PA14NR Set mutants plaques ainsi que des plaques de contrôle, qui se composent de type sauvage PA14 inoculés et non inoculés puits intercalés dans un modèle prédéfini (Figure 4 a), ont été répli...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le P. aeruginosa PA14NR est une ressource précieuse pour la communauté scientifique. Selon le dataset mars 2017 de la base des Clarivate Analytique Essential Science Indicators, Liberati et al. (2006) 37, qui décrit la construction de l’ensemble de la PA14NR, est classé dans le top 1 % des publications de la microbiologie. Google Scholar rapporte plus de 600 références de la Liberati et al. (2006) le manuscrit original à partir d’août 2017. La bibliothèque a jou...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêts financiers. Eliana Drenkard et Frederick Ausubel participaient à la création de la bibliothèque de mutant PA14 transposon non redondante. Bryan Hurley et Lael Yonker, actuellement maison et distribuent la bibliothèque mutante dans le cadre du département de pédiatrie au Massachusetts General Hospital.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier Lisa Philpotts de la bibliothèque virtuelle de Treadwell MGH pour son orientation dans la recherche de la base de données. Ce travail a été soutenu par la Fondation de la fibrose kystique (YONKER16G0 et HURLEY16G0) et le NIH NIAID (BPH et ADE : R01 A1095338).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériaux pour la réplication en bibliothèque
Stérile 96 puits Traité par culture tissulaire, cas de 50Corning Life Sciences353072via Fisher Scientific
Stérile 96 Bien Transparent V-Bottom 2000&mu ; L Deep Well Plates, caisse de 25Corning Life Sciences3960via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (plaques rectangulaires), caisse de 60Thermo Scientific Rochester242811via Fisher
Scientific Rectangular Ice Pan, Midi (4L)Corning Life Sciences432104via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, caisse de 300Cardinal HealthAT7509via Fisher Scientific
AluminaSeal, paquet de 100Diversified BiotechALUM-100via la membrane Fisher Scientific
Breathe-Easy, paquet de 100Diversified BiotechBEM-1via Sigma-Aldrich
Sterile, emballé individuellement, 50mL Solution Tauge/Réservoir de réactif, caisse de 100SorensonS50100via Westnet Incorporated
Rouleau à plaquesVWR60941-118via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64 » x 0.277 », paquet de 16 feuillesGA InternationalRCL-11T1-WHvia Labtag.com (modèle d’impression également disponible à partir de Labtag.com)
Réplicateur à 96 puitsV & P Scientific, Inc.Custom 407C, diamètre de la goupille de 3,18 mm, longueur de 57 mmvia V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, incubateur à secousses3mm Infors HTl10003Pvia Infors HT
Picus 12 Canaux 50-1200&mu ; L Pipette électroniqueSartorius735491PRvia Sartorius
Filtres Tips 50-1200&mu ; L, paquet de 960Biohit14-559-512via Fisher Scientific ; utilisez des pointes électroniques compatibles multicanaux
Dry IceFournisseur spécifique à l’utilisateur
Matériaux pour le stockage individuel des mutants
Fisherbrand Tubes de microcentrifugation haut de gamme : 1,5 mlFisher Scientific05-408-130via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2)GilsonF167370via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifugeuse Tubes : 1,5 mLFisher Scientific05-408-130via Fisher Scientific
NanoDrop ThermoScientificND-2000via
ThermocycleurPCR ThermoFisher
Omnistrips Tubes PCR avec couvercles bombésThermo ScientificAB0404via Fisher Scientific
ART Pointes de pipette à faible rétention (10 uL, 100 uL, 1000 uL)Molecular BioProducts, Inc.Z676543 (10 μL), Z676713 (100 μL), Z676802 (1000 μL)Sigma-Aldrich
(P1000, P200, P20, P2)GilsonF167370via Gilson
Fisherbrand Microcentrifugeuses Tubes haut de gamme : 1,5 mlFisher Scientific05-408-130via Fisher Scientific
MasterKit de purification d’ADN purEpicentreMCD85201via Epicentre Technologies Corp
Échelle d’ADN GeneRuler 1 kb Plus, prête à l’emploiThermoScientific SM1333via ThermoFisher
Tampon de chargement RediLoadInvitrogen750026via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals pour la bibliothèque et le stockage individuel des mutants
Glycerol MB Grade, 1LSigma AldrichG5516via Sigma-Aldrich
LB BouillonPar 1L dH2O : 10g de tryptone, 5g d’extrait de levure, 5g de NaCl, 1ml de NaOH 1N (Protocoles actuels en biologie moléculaire.  ; Wiley, 1994.)
TryptoneSigma AldrichT7293via Sigma-Aldrich
Extrait de levureSigma AldrichY1625via Sigma-Aldrich
Chlorurede sodium Sigma AldrichS7653via Sigma-Aldrich
Hydroxyde de sodiumSigma AldrichS8045via Sigma-Aldrich
LB  ; géloseVoir la préparation ci-dessus, ajouter 15g de gélose Bacto
Bacto AgarSigma AldrichA5306via Sigma-Aldrich
Sulfate de gentamicine, 10gBioReagent1405-41-0via Sigma-Aldrich
Kanamycinsulfate Gibco11815024via ThermoFisher
Ethanol, 190 proofDecon04-355-221via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
AmorcesFournisseur préféré de l’utilisateurVoir les amorces répertoriées dans le Tableau 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade WaterCorning46000CVvia Fisher Scientific
Taq Polymerase BufferInvitrogen10342020via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase,Recombinant Invitrogen10342020via ThermoFisher
dNTPsInvitrogen10297018via ThermoFisher
AgaroseSigmaA9539via Sigma-Aldrich
via des pipettes

Références

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Biblioth que de mutants par transposonsR plication de biblioth queTechnique st rileSt rilisation des pointes de r plicateurBo tes de g lose LBBloc puits profondsConservation au glyc rolContr le qualitPr vention de la contamination

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