Protocole pour la toxicité aiguë et chronique écotoxicité Testing de la Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Résumé

Dans cet ouvrage, les auteurs décrivent un bioessai aiguë, chronique et multigénérationnelle pour étudier les effets des stresseurs simples et combinés sur le cyprinodonte Turquoise Nothobranchius furzeri. Ce protocole vise à étudier les caractéristiques démographiques (mortalité, croissance, fécondité, poids) et maximum thermique critique.

Résumé

Le cyprinodonte Nothobranchius furzeri est un organisme modèle émergents dans le domaine de l’écotoxicologie et son applicabilité des essais d’écotoxicité aiguë et chronique a été démontrée. Dans l’ensemble, la sensibilité des espèces aux composés toxiques est de l’ordre, ou plus élevé, que d’autres espèces de modèle.

Cet ouvrage décrit les protocoles de bioessais multigénérationnelles, aiguës et chroniques des effets simples et combinés de facteurs de stress sur N. furzeri. Grâce à son temps de maturation courte et cycle de vie, ce modèle vertébré permet l’étude des effets tels que la durée de maturation et de la fécondité dans les quatre mois. Transgénérationnel cycle de vie complet exposition essais peut être effectué en aussi peu que 8 mois. Puisque cette espèce produit des œufs qui sont résistantes à la sécheresse et demeurent viable pendant des années, la culture sur le site de l’espèce n’est pas nécessaire mais les particuliers peuvent être recrutées au besoin. Les protocoles visent à mesurer-caractéristiques démographiques (mortalité, croissance, fécondité, poids) et maximum thermique critique.

Introduction

Profils de sensibilité d’un tableau des espèces aux substances toxiques stratégiquement choisies ont été décrits¹ pour la législation européenne REACH (enregistrement, évaluation, autorisation et Restriction des produits chimiques). Les essais de toxicité aiguë ou à court terme ont été principalement utilisés à cette fin, car ils donnent une indication rapide de la sensibilité d’une espèce. Cependant, dans leur milieu naturel, les organismes sont exposés sur une période beaucoup plus longue et cycle de vie complet ou même plusieurs générations pourraient être touchés². En outre, organismes dans des environnements pollués sont généralement exposés à plus d’un facteur de stress à la fois, qui peuvent interagir entre eux, ce qui pourrait entraîner des effets synergiques³. Par conséquent, concentration sécuritaire calculée stresseur aigu, unique basé sur les essais de toxicité peuvent sous-estiment les risques réelles imposées par des substances toxiques dans les milieux naturels. Il est donc souhaitable d’étudier aussi les effets chroniques et multigénérationnelles de concentrations sublétales de substances toxiques dans un contexte environnemental tel que préconisé par la Commission européenne^4,5 et de l’USEPA (United Environmental Protection Agency des)^6,7. Surtout dans la recherche de vertébrés, les coûts en termes de travail, d’argent et le temps sont élevés lors de l’exécution des études sur l’exposition chronique et multigénérationnelles en raison de la durée de vie relativement longue des vertébrés par rapport aux organismes invertébrés modèles. Par conséquent, il est conseillé de choisir l’organisme modèle poisson plus appropriée, selon la question de recherche. En outre, un large éventail d’espèces de vertébrés devrait être disponible afin de tester la généralité des réponses diverses espèces pour pouvoir adapter la réglementation fondée sur les espèces les plus sensibles. Pour l’instant, il est nécessaire de développer de nouveaux protocoles efficaces avec des espèces de vertébrés modèle caractérisées par des cycles de vie courts pour abaisser les coûts de l’exécution des expositions chroniques et multigénérationnelles sur vertébrés^7,8.

Le cyprinodonte turquoise Nothobranchius furzeri est un modèle de poisson intéressant à utiliser dans de telles expériences d’exposition à long terme en raison de son temps de maturation courte et le cycle de vie (temps de génération inférieure à 4 semaines,⁹). Cela signifie que des effets écologiquement pertinents tels que temps de maturation et de la fécondité peuvent être étudiés dans un court laps de temps par rapport aux autres modèles de poisson⁷. En outre, ces poissons produisent des oeufs résistantes à la sécheresse, dormants qui restent viables pendant plusieurs années, lorsqu’il est conservé dans des conditions normales, ce qui élimine la nécessité d’une culture continue⁹. Dans les études écotoxicologiques, cela implique aussi que répliquer poissons peuvent tous être éclos au même moment, résultant en synchronie de temps pour tous les animaux, même parmi les lots de œufs produits à différents moments. Nous conseillons à l’aide du laboratoire souche GRZ pour effectuer des expériences d’exposition. Cette souche effectue bien dans des conditions de laboratoire, est homozygote (à l’exception des chromosomes sexuels) et le génome est bien caractérisé^10,11.

Dans les études écotoxicologiques, il est important de sélectionner la fourchette des concentrations d’essai. Plusieurs méthodes complémentaires peuvent être utilisées à cette fin. La gamme de concentration nominale peut reposer sur la sensibilité d’une espèce apparentée, comme les Nothobranchius guentheri¹². Par ailleurs, la gamme peut être basée sur la sensibilité des modèles standard de poissons, comme le poisson zèbre (Danio rerio)² qui ont une sensibilité comparable à la plupart des substances toxiques (Philippe et al. (en révision)). En combinaison, avec ces deux options, une gamme trouver expérience devrait être menée pour sélectionner la plage de concentration nominale. Aiguë de test, les chercheurs devraient viser pour les traitements de la concentration avec 100 % de mortalité, mortalité intermédiaire et 0 % de mortalité après 24 h d’exposition à la substance toxique. Chronique de test, il est conseillé d’exécuter la gamme trouver expérience pendant deux semaines afin de vérifier si la mortalité larvaire en l’état avec les plus fortes concentrations d’essai ne dépasse pas 10 % durant cette période de référence.

Le protocole peut servir de référence pour effectuer une exposition aiguë et chronique aux polluants d’origine hydrique sur furzeri N., examine les effets potentiels du stress tant au niveau individuel et cellulaire. Il peut également être utilisé pour effectuer la recherche de facteurs de stress multiples pour accommoder une pertinence écologique plus élevée, mélange de différents composés toxiques ou étudier les effets d’interaction entre la pollution et d’autres facteurs de stress physiques (p. ex. la prédation) ou anthropiques les facteurs de stress (p. ex. réchauffement due au changement climatique).

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’éthique de la KULeuven.

1. l’éclosion et l’entretien général de furzeri N.

1. Préparer les poissons de milieu (pH 7) à une température de 14 ° C et ajouter eau purifiée de Type II, avec des sels ajoutés normalisés, à une conductivité de 600 µS/cm (24 ° C).
2. Sélectionnez les oeufs de la ligne de laboratoire GRZ (Gona-Rhe-Zhou) qui ont été stockés dans des conditions normalisées,¹³. Sélectionnez des oeufs dans la scène DIII (c'est-à-dire prêts à éclore), reconnaissable par la présence des yeux dorés⁹ et doucement les transférer avec une douce paire de pinces sur un réservoir de 2 L en plastique (pas plus d’environ 30 oeufs par cuve).
   NOTE : Afin d’avoir un nombre suffisant d’organismes testés sains, éclore des oeufs deux fois autant que le nombre de larves de poissons nécessaire.
3. Ajoutez 1 cm du milieu poisson à 12 ° C et laisser la température de l’eau convergent progressivement à température ambiante (24 ° C),⁹. Poissons vont éclore dans les 12 premières heures.
4. Après 24h, nourrir les nouveau-nés une dose concentrée de fraîchement écloses Artemianauplii (pour plus de détails sur la fréquence et la quantité d’aliments, consulter le protocole de reproduction de Polačik al 2016⁹) et d’augmenter la profondeur de l’eau jusqu'à 5 cm de Ajouter le médium de poissons.
5. Après 36 h, nourrir les nouveau-nés une autre dose concentrée de fraîchement écloses nauplii d’Artemia et ajouter le support de poissons pour augmenter la profondeur de l’eau à 10 cm.
6. Incuber les contenants de poissons dans des conditions de température constante (par exemple dans un incubateur, la chambre climatique ou le bain d’eau chauffée) en une 14 h:10 h régime lumière : obscurité.
7. Avant le début de l’expérience, contenants de poissons complexe (sans poissons) avec l’exposition composée de remplir avec la plus forte concentration du milieu de l’exposition et le laisser pendant la nuit afin de limiter le transfert de substances toxiques vers le conteneur dans le réel Faites des essais.
8. 48 h après l’éclosion, sélectionnez sains larves flottantes pour commencer l’expérience de l’exposition. Jeter ce que l'on appelle ventre-curseurs qui étaient incapables de remplir leur vessie natatoire et par conséquent ont une flottabilité avec facultés affaiblies (couler continuellement vers le bas).

2. à court terme protocole d’exposition

Remarque : Les chercheurs doivent viser au moins 20 répétitions (20 poissons dans des bocaux séparés) par traitement. Outre un traitement complet de contrôle, un contrôle solvant devrait être inclus si la solution du composé est préparée à l’aide d’un solvant. Le contrôle de solvant doit contenir la quantité de solvants égalant la concentration solvant dans la plus grande concentration d’exposition.

1. Préparer les contenants expérimentales (pots de verre de 0,5 L) en étiquetant et en les remplissant avec le milieu de l’exposition appropriée (différentes concentrations de produits toxiques). Ajouter le composé pour obtenir la concentration correcte.
2. Transfert des larves (éclosion après 48 h) individuellement aux conteneurs (1 poisson par conteneur pour la surveillance individuelle).
   Remarque : Les poissons sont exposés individuellement afin de minimiser les effets confondants potentiels d’interaction sociale tels que la concurrence pour la nourriture et de l’agression. Toutefois, les poissons sont autorisés d’interagir visuellement conformément à des normes éthiques pour usage animal de laboratoire.
3. Cette exposition aiguë, suivi d’une durée de 2 semaines. Pendant ce temps, nourrir les poissons ad libitum avec nauplii d’Artemia deux fois par jour, 7 jours/semaine.
4. Actualiser le support tous les jours pour maintenir la qualité de l’eau et de minimiser les effets potentiels de la dégradation des composés. Surveiller les variables clés de l’eau (teneurs en oxygène dissous devraient dépasser 80 %, conductivité devrait se situer entre 600 et 700 µS/cm, pH compris entre 7,8 et 8,2 et dureté (en CaCO₃) entre 350 et 450 mg/L, qui se situe dans la fourchette des conditions optimales d’élevage pour furzeri N. ⁹). Prendre des échantillons d’eau avant et après avoir actualisé le milieu afin de déterminer les concentrations de composés réelles.
5. Points de terminaison
   1. Vérifier les poissons pour la mortalité, stress (p. ex. comportement aberrant : nager à l’envers) ou d’une maladie par jour (matin, soir). Consulter la publication de Shedd et al. (1999) ¹² pour plus d’informations sur l’observation de la mortalité, de stress ou de maladie.
   2. Calculer LC₅₀ valeurs basées sur la mortalité à l’aide des courbes dose-réponse (Ritz et Streibig, 2005) à des moments différents. Utilisez la fonction de drm dans le package de la RDC en v3.2.3 R (R développement Core Team, 2016) ou les approches statistiques similaires.

3. chronic Exposure protocole

NOTE : Viser un minimum de 25 poissons/condition dès le début de l’expérience, afin de minimiser les chances d’un sexe-ratio biaisé et pour accueillir la mortalité potentielle de fond en raison de causes naturelles (i.e. mortalité liée à l’âge).

1. D’incubation (voir section 1)
2. La phase I (2 jours après l’éclosion-16 jours après l’éclosion)
   1. Suivre le protocole tel que décrit au point 2.1-2.4
   2. Comme lors de la deuxième phase de l’expérience, le support va se dégrader tout au long de la semaine (aucun rafraîchissement, voir ci-dessous). Stocker la quantité requise de moyenne pour une semaine dans de grands récipients inertes afin de permettre la dégradation similaire du composé.
3. Phase II (16 jours après l’éclosion-fin)
   1. Préparer 2 L expérimental verre bocaux par complexation eux avec le composé. Remplir les bocaux avec le milieu de l’exposition correcte et ajouter un tuyau d’air pour aérer le bocal. Poisson maison individuellement dans ces pots pour le reste de l’expérience. Permettre une interaction visuelle tenir compte des normes éthiques.
   2. Actualiser le support une fois par semaine. Transférer le poisson avec un filet de nouveau dans un bocal contenant le milieu de l’exposition même. Prélever des échantillons de l’eau tous les jours pendant une semaine pour surveiller la dégradation du composé dans chaque traitement de concentration. Calculer une courbe de dégradation pour chaque traitement si stresseurs multiples sont mis à l’essai (p. ex. la toxicité d’un composé dans les régimes de température différente). Mesurer les paramètres abiotiques (température, pH, conductivité, % dissous d’oxygène) trois fois par semaine.
   3. Depuis 2 jours après l’éclosion (dph) jusqu'à 23 dph, nourrir les poissons deux fois par jour, 7 jours par nauplii d’Artemia ad libitum de semaine. De 24 dph - 37 dph, compléter l’alimentation ad libitumArtemia des larves de Chironomus hachés. De 38 dph sur, nourrir les poissons deux fois par jour, 7 jours par semaine de ad libitum congelés Chironomus larves.
4. Points de terminaison
   1. Poisson cocher tous les jours pour la mortalité, de stress ou de maladie¹².
   2. Pour déterminer la croissance, de mesurer la taille de l’organisme sur une base hebdomadaire (9 dph - dph 16 - 21 dph -...) en transférant les poissons à une boîte de Pétri remplie de milieu à partir de leur réservoir. Prendre des photos de taille calibrée de 4-5 du poisson par dessus (à une hauteur fixe) et les analyser numériquement à l’aide d’un programme de mesure spatial (par exemple ImageJ).
      Remarque : Pour des poissons adultes, utiliser Pétri supérieur pour minimiser le stress de la manipulation en gardant tous les poissons submergés pendant tout le processus de mesure.
   3. Pour la maturation des mâle, visuellement le poisson tous les jours pour la coloration de 15 dph partir. Vérifier les ailettes pour les premiers signes de coloration nuptiale (caractère sexuel secondaire). Utilisez le premier jour où c’est visible en tant que proxy pour les temps de maturation des mâles.
   4. Couple non-sexés le poisson avec les hommes du même groupe de traitement ou de mâles non expérimentales trois fois par semaine de 30 dph partir afin de déterminer le temps de maturation femelle (le jour le premier œuf est déposé). Pour cela, utilisez le protocole frai décrit dans 3.4.5.
   5. Pour la fécondité, couple mature femelles avec les mâles matures 3 fois / semaine du 30 dph, au sein de leurs traitements utilisant un schéma de croisement.
      1. Préparer un réservoir de frai (1 L) pour chaque couple, utilisant le milieu de l’exposition de l’aquarium male additionné de frai de substrat (sable fin < 500 µm).
      2. Transférer le mâle et la femelle dans le réservoir de frai et permettez-leur de se reproduire pendant deux heures. Réduire au minimum l’activité humaine ou perturbation autour des conteneurs frai au cours de ce processus.
      3. Ensuite, transférer doucement poisson à leurs contenants originaux de logement, sans mélange inutile de l’eau, qui serait le tourbillon les œufs dans le substrat de ponte.
      4. Filtrer les oeufs en versant le substrat de ponte sur une maille de 500 µm. Compter les oeufs et les transférer (à l’aide de pincettes doux) à la mousse de tourbe humide dans les boîtes de Pétri avec^9,14.
      5. Retirer les œufs morts par jour. Après qu’une semaine, joint la Petri plat avec film d’étanchéité et le stocker à une température contrôlée d’incubation à 28 ° C et un 14:10 h lumière : obscurité cycle développement immédiat à la phase DIII (c'est-à-dire prêts à éclore après environ trois semaines). Pour le stockage à long terme, conserver les oeufs à 17 ° C dans l’obscurité totale sur laquelle oeufs entrer dans la phase dormante et restent viable pendant plusieurs années. Lors du recrutement de poissons provenant de ces œufs dormants pour des expériences, transférer les œufs dormants aux conditions de 28 ° C à 14:10 h lumière : obscurité cycle pendant environ trois semaines permettre le développement de la phase DIII.
   6. Mesurer le maximum thermique critique (CTmax) (une mesure de performance¹⁵) des poissons adultes.
      1. Utiliser un bain d’eau qui est chauffé à une vitesse constante de 0,33 ° C/min et où l’eau y circule en continu. Ajouter plusieurs aquariums de 1 L pour chaque poisson individuel.
         Remarque : Compte tenu des contraintes d’espace dans le bain d’eau, il est nécessaire de travailler dans plusieurs séries. Des différences de potentiel dans des conditions parmi la série devraient tenir compte lorsque vous effectuez des analyses statistiques en incluant « série » comme un facteur aléatoire.
      2. Lancer l’essai en ajoutant les poissons à l’aquarium quand l’eau dans l’aquarium a atteint la température d’élevage expérimentale du poisson (généralement 28 ° C). Surveiller la température dans les aquariums de 1 L de la baignoire CTmax chaque 5 min à l’aide d’un thermomètre numérique (échelle de 0,1 ° C).
      3. Fin du procès lorsque les poissons ne parvient pas à maintenir une position dorso-ventralement verticale ou commence secouant fortement^16,17. Mesurer la température dans l’aquarium, 1 L, qui est la température critique maximale. Transférer le poisson à son logement expérimental pour la récupération.
   7. Mesurer le poids (précision de 0,1 mg) des poissons le dernier jour de l’expérience en tapotant sec et de le transférer sur un bateau de pesage. Remarque : Tous les poissons doivent être mesurés quatre heures après la dernière tétée afin de normaliser le poids de l’aliment dans le tractus intestinal.
   8. Euthanasier le poisson à l’aide de 0,1 % tricaïne.

4. Protocole de post-exposition transgénérationnel

Remarque : Pour mesurer les effets transgénérationnels de polluants sur N. furzeri, suivre le protocole de l’exposition chronique décrit ci-dessus pour la première génération.

1. Vérifiez deux fois par semaine, le développement des oeufs produits (c.-à-d. la deuxième génération) conservés à 28 ° C 14:10 conditions cycle h lumière : obscurité en inspectant les boîtes de Pétri pour les embryons dans la phase DIII (voir Polačik et al. 2016⁹). Lorsque plus de 50 répliques de chaque traitement parental sont entièrement développées, éclosent eux suivant le protocole au point 1.1.
2. Exposer des poissons sains, flottant à exactement la même mise en place et le traitement que le poisson parental.

Résultats

Les résultats de l’exposition aiguë des N. furzeri à différentes concentrations de cuivre, calculé selon la 2.5.2, montrent des relations cleardose-réaction (Figure 1). Il y a une augmentation de la mortalité avec augmentation de la concentration de produit toxique. LC₅₀ valeurs diminuent au fil du temps, ce qui signifie qu’avec la baisse des concentrations, plus le temps passe avant 50 % de la matrice de répétitions. Pour les résultats dé...

Discussion

Cet ouvrage décrit un nouveau bioessai utilisant Nothobranchius furzeri, un organisme modèle émergent, pour étudier l’individu et combiné les effets à long terme de substances toxiques et autres facteurs de stress. Les protocoles présentés ont été appliqués avec succès pour mesurer la sensibilité de l’espèce à un tableau des substances toxiques (cuivre, cadmium, 3, 4-dichloroaniline et chlorpyrifos). En raison de son cycle de vie rapide, ce modèle vertébré permet pour évaluation de sublétale et transgénérationne...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
eau purifiée Type 1 (milli Q)	Millipore
Sea Salt	Instant Ocean
Réservoir en plastique de 2 L	SAVIC		Matériau toujours séparé pour les traitements de contrôle et de toxicité
Réservoir en plastique de 1 L (frai)	Avamoplast		Matériel toujours séparé pour les filets de contrôle et de toxicité
	Aqua bilzen		Matériel toujours séparé pour les traitements de contrôle et de toxicité
Bocaux en verre de 2L	Sepac-Flacover		Matériel toujours séparé pour les traitements de contrôle et de toxicité
Bocaux en verre de 0,5L	Sepac-Flacover		Matériel toujours séparé pour les traitements de contrôle et de toxicité
Oeufs d’artémie	Ocean Nutrition
Chironomus	Ocean Nutrition		congelé
tricaïne	Sigma aldrich
boîtes de Pétri	VWR
Parafilm	VWR
pipettes	MLS
pince à épiler	FST
500 & micro ; tamis à mailles	/		à
microcentrifugeuse fait maison (2ml)	MARQUE		Pour stocker le poisson dans
des flacons en verre	Sigma aldrich		Pour l’analyse de l’eau
Bateau de pesage	MLS
Jiffy 7c granulés	Bain-marie Jiffy
	Gilac		pour azote liquide Ctmax
	Thermomètre numérique Air liquide
	Testo AG	testo 926
HETO therm heater	Anker Schmitt
balance calibrée	Mettler-Toledo AG
caméra	/
plate-forme pour caméra	/
kit multiparamètre	HACH
Congélateur (-80° ; C)	Panasonic Congélateur
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Fysio
d’homogénéisation	VWR		0,1  ; M TRIS&ndash ; HCl, pH 8,5, 15 % de polyvinylpyrrolidone, 153 % et micro ; M MgSO4  ; et 0,2 % Triton X-100
chloroforme :méthanol	Sigma Aldrich
tripalmitate de glycéryle	Sigma Aldrich
amyloglucosidase	Sigma Aldrich	A7420
réactif de dosage du glucose	Sigma Aldrich	G3293
Colorant protéique Biorad	VWR
Plaque de microtitration à 96 puits	Greiner Bio-one
384 Tubes	Greiner Bio-one
2 ml	Fiers		Pour l’analyse des graisses
Tubes eppendorf 2,5 ml	VWR
	Ultra-turrax TP 18/10
Photospectromètre	Infinite M200 TECAN
Chauffage pour tubes en verre	Centrifugeuse de réacteur
	Centrifugeuse Eppendorf 5415 R
Incubateur	Bumako