CRISPR induite par la perte de fonction dans cervelet granules des cellules utilisant In Utero électroporation basée sur un transfert de gènes

Summary

Études classiques de perte de la fonction des gènes à l’aide d’animaux knock-out ont souvent été coûteux et long. Axée sur l’électroporation de mutagenèse induite par CRISPR somatique est un outil puissant pour comprendre les fonctions de gènes in vivo. Nous rapportons ici une méthode pour analyser les phénotypes d’élimination directe dans les cellules en prolifération du cervelet.

Abstract

Malformation cérébrale est souvent causée par des mutations génétiques. Décrypter les mutations dans les tissus dérivés de patient a identifié des facteurs étiologiques potentiels des maladies. Pour valider la contribution d’un dysfonctionnement des gènes mutés au développement de la maladie, la génération de modèles animaux portant les mutations est une approche évidente. Alors que les cellules germinales génétiquement modèles murins (edged) sont populaires outils biologiques et présentent des résultats reproductibles, il est limité par le temps et les coûts. Pendant ce temps, non lignée germinale edged permettre souvent explorer la fonction du gène d’une manière plus réaliste. Depuis certains cerveau maladies (p. ex., tumeurs cérébrales) semblent résulter de somatique, mais pas de mutations germinales, non lignée germinale modèles de souris chimériques, où coexistent des cellules normales et anormales, pourraient être utiles pour l’analyse pertinente à la maladie. Dans cette étude, nous présentons une méthode pour l’induction de mutations somatiques CRISPR-négociée dans le cervelet. Plus précisément, nous avons utilisé le conditionnels souris knock-in, dans lequel Cas9 et GFP sont chroniquement activés par le promoteur de l' ACG (CMV enhancer/poulet ß-actine) après Cre-médiée par recombinaison du génome. Le seul individu-conçu-guide RNAs (sgRNAs) et la séquence de recombinase Cre, tous deux encodé dans une construction de plasmide, ont été livrés sur les cellules souches/progénitrices cérébelleux à un stade embryonnaire à l’aide de in utero électroporation. Par conséquent, cellules transfectées et leur fille ont été marquées avec la protéine fluorescente verte (GFP), facilitant ainsi approfondir les analyses phénotypiques. Par conséquent, cette méthode est non seulement montrant livraison axée sur l’électroporation génique sur les cellules embryonnaires cérébelleux mais propose également une nouvelle approche quantitative pour évaluer CRISPR induite par la perte de fonction phénotypes.

Introduction

Maladies du cerveau sont une des plus terribles maladies mortels. Ils résultent souvent de mutations génétiques et dérèglement subséquent. Pour comprendre les mécanismes moléculaires des maladies du cerveau, éternelle efforts pour déchiffrer les génomes des patients humains ont découvert un certain nombre de gènes potentiels. Jusqu’ici, modèles animaux de lignée germinale génie modifiées ont été utilisés pour in vivo gain de fonction (GOF) et l’analyse de la perte de fonction (LOF) de ces gènes candidats. En raison du développement accéléré des études de validation fonctionnelle, un plus faisable et plus souple en vivo test système génétique pour étu....

Protocol

Toutes les expériences sur des animaux ont été menées conformément à la réglementation du bien-être des animaux et ont été approuvés par les autorités responsables (Regierungspräsidium de Karlsruhe, numéros d’homologation : G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 et G133/14).

1. générer des plasmides pU6-sgRNA-Cbh-Cre

1. Concevoir la sgRNA afin de cibler un gène d’intérêt selon le protocole publiées antérieurement¹⁴.
   Remarque : Dans cette expérience, deux sgRNAs sont conçus pour cibler le gène Top2b de souris et un sgRNA de contrôle indifférenciés (tableau 1). À débouchure ou des gènes à l....

Results

Analyse fonctionnelle in vivo , il est essentiel d’identifier les cellules qui gène exogène (s) ont été introduites. Si l’expression d’un marqueur, comme GFP dans des cellules non-proliférantes peut être suivis pendant une longue période de temps, le signal se perd dans l’ordre dans les cellules en prolifération. Une illustration de cet effet est illustrée dans la Figure 1. Pour contourner la perdre l’empreinte des cellules transfectées dans les anal.......

Discussion

Utilisant l’exo utero électroporation, nous avons déjà rapporté axée sur les siARN in vivo des analyses fonctionnelles de Atoh1 à un stade précoce des granules de cérébelleux cellulaire différenciation⁸. En raison de la dilution et la dégradation des siARN et l’exposition des embryons à l’extérieur de la paroi utérine, analyse phénotypique de l’électroporation microglies se limitait aux stades embryonnaires. Toutefois, la méthode actuelle activé analyse du phénotype des animaux a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 488 Chèvre anti-Poulet	ThermoFisher	A11039	Dilution 1:400
Alexa 568 Donkey anti-Mouse	Life Technologies	A-10037	Dilution 1:400
Alexa 594 Âne anti-Lapin	ThermoFisher	A21207	Dilution 1:400
Alexa 647 Donkey anti-Rabbit	Life Technologies	A31573	dilution 1:400
Alcaline Phosphatase (FastAP)	ThermoFisher	EF0654
Bande d’autoclave	Kisker Biotech	150262
BamHI (HF)	NEB	R3136S
BbsI (FastDigest)	ThermoFisher	FD1014
Papier filtre en cellulose (Whatman)	Sigma-Aldrich	WHA10347525
Cloth	Tork	530378
Microscope confocal à balayage laser	Zeiss	LSM800
D-Luciferin	biovision	7903-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	dilution 1:1000
Moules jetables en plastique (Tissue-Tek Cyromold)	VWR	4566
DMEM Glutamax	ThermoFisher	31966047
Sérum	d’âneSigma-Aldrich	D9663
EcoRI (HF)	NEB	R3101S
Electro Square Porator	BTX	ECM830
Endofree Maxi Kit	Qiagen	12362
Ethanol	Merck	107017
Pommade pour les yeux (Bepanthen)	Bayer	81552983
Fast Green	Merck	104022
FBS	ThermoFisher	10270-016
Filtre (0,22 & micro ; m)	Merck	F8148
Imageur cellulaire fluorescent (ZOE)	Pince Biorad	1450031
droite	Fine Science Tools	91150-20
Gaze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)	Fisher Scientific	15387311
Anticorps GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611S
Capillaire en verre avec filament	Narishige	GD1-2
Coussin chauffant	ThermoLux	463265 / -67
Logiciel de traitement d’images (ImageJ et Fiji)	NIH-Insulin
(B. Braun OMNICAN U-100)	Carl Roth	AKP0.1
Isoflurane	Zoetis	TU061219
IVIS Lumina LT Series III Caliper	Perkin Elmer	CLS136331
Kalt Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY mix	Kapa Biosystems	KK2601
Ki67 anticorps	Abcam	ab15580	dilution 1:500
Pointer	Photonic	PL3000
Stylo bloqueur de liquide	Kisker Biotech	MKP-1
Metamizol	WDT-Microgrinder
	Narishige	EG-45
Microinjecteur	Narishige	IM300
Extracteur de micropipettes	Sutter Instrument Co.	P-97
Logiciel de microscope ZEN	Zeiss-Fil
de suture en soie non stérile (0,12 mm)	Outils de sciences fines	18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek)	VWR	4583
p27 anticorps	BD bioscience	610241	dilution 1:200
Paraformaldéhyde	Roth	335.3
PBS ( 1x)	Life Technologies	14190169
pCAG-EGxxFP	Addgene	50716
Polyéthylénimine	Sigma-Aldrich	408727
pX330 plasmide	Addgene	42230
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Kit de ligature rapide	NEB	M2200S
Pince à anneau	de sciences fines	11103-09
Lames (SuperFrost)	Logiciel ThermoFisher	10417002
pour la biostatistique (Prism 7)	Logiciel GraphPad,	inc-Spitacid
	EcoLab	3003840
Stéréomicroscope	Nikon	C-PS
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
Ciseaux chirurgicaux	Fine Science Tools	91460-11
Ciseaux chirurgicaux à pointe émoussée	Fine Science Tools	14072-10
Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))	SMI	220340
T4 Tampon de ligature de l’ADN	NEB	B0202S
T4 PNK	NEB	M0201S
Ciseaux à tissus Blunt (11,5 cm)	Fine Science Tools	14072-10
Anticorps TOP2B	Santa Cruz	sc13059	dilution 1:200
Trypsine (2,5 %)	ThermoFisher	15090046
Pince à épiler avec 5 mm et électrodes à disque Oslash Platinum	Xceltis GmbH	CUY650P5
Vaporisateur	Drä ; gerwerk AG	GS186