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Article de méthode

Culture de cellules souches pluripotentes humaines sur Polyvinyl alcool-Co-itaconique acides Hydrogels avec raideur variable dans des Conditions sans Xeno

8.5K vues

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DOI :

10.3791/57314

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3 février 2018

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1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Un protocole est présenté afin de préparer le polyvinyliques alcool-co-itaconique acides hydrogels avec raideur variable, qui ont été greffés avec et sans les oligopeptides, pour étudier l’effet de la rigidité des biomatériaux sur la différenciation et la prolifération des cellules souches. La rigidité des hydrogels était contrôlée par le temps de réticulation.

Résumé

L’effet d’indices physiques, comme la rigidité des biomatériaux sur la prolifération et la différenciation des cellules souches, a été étudié par plusieurs chercheurs. Toutefois, la plupart de ces chercheurs ont utilisé des hydrogels de polyacrylamide pour culture de cellules souches dans leurs études. Par conséquent, leurs résultats sont controversés car ces résultats pourraient provenir de la spécificité de la polyacrylamide et non à partir de la file d’attente physique (rigidité) des biomatériaux. Nous décrivons ici un protocole pour la préparation des hydrogels, qui ne reposent pas sur polyacrylamide, où les différentes souches, les cellules dont les cellules souches embryonnaires humaines (ES) et humaines pluripotentes induites des cellules souches (iPS), peuvent être cultivées. Hydrogels avec raideur variable ont été préparés à partir bioinert, polyvinyl alcool-co-itaconique acide (P-IA), avec raideur, contrôlé par le degré de réticulation en changeant de temps de réticulation. Les hydrogels de P-IA greffées avec et sans les oligopeptides provenant de la matrice extracellulaire a été étudiées comme une future plate-forme de la culture de cellules souches et différenciation. La culture et le passage de cellules de tige fluides amniotique, adipeux dérivées de cellules souches, les cellules ES humaines et cellules iPS humaines est décrit en détail ici. Les hydrogels oligopeptide P-IA ont montré des performances supérieures, qui ont été induits par leurs propriétés de rigidité. Ce protocole indique la synthèse de ce biomatériau, manipulation de leur surface, ainsi que de contrôler les propriétés de rigidité et enfin, leur impact sur les cellules souches sort en utilisant des conditions de culture libre xeno. Se fondant sur des études récentes, ces substrats mis à jour le peuvent agir comme des futures plateformes pour soutenir et diriger le destin de diverses cellules souches ligne à liaisons différentes ; et encore, de se régénérer et de restaurer les fonctions de l’organe perdu ou un tissu.

Introduction

Le sort de la différenciation des cellules souches dans une lignée spécifique des cellules et la prolifération à long terme des cellules souches, cellules surtout humaines pluripotentes induites (iPS) et les cellules souches embryonnaires humaines (ES), est connu pour être régulée par des inhibiteurs, facteurs de croissance, et / ou de petites molécules bioactives dans les milieux de culture. Récemment, les repères physiques des biomatériaux, particulièrement la rigidité des biomatériaux de culture cellulaire, ont été reconnues comme un facteur important, guider le destin des cellules souches la prolifération et la différenciation1,2, 3,4,5,6. Par conséquent, plusieurs chercheurs ont commencé à enquêter sur le sort des cellules souches, qui sont cultivées sur des hydrogels, sur la différenciation, principalement à l’aide de polyacrylamide hydrogels avec raideur variable.

La rigidité des biomatériaux peut contrôler des adhérences focales, la morphologie cellulaire, phénotype cellulaire et l’adhérence de cellules souches, en particulier dans la culture à deux dimensions (2d)1,2,3,5. Mécano-détection des biomatériaux par les cellules souches est généralement contrôlée par adhérence focale signalisation via intégrines. NMMIIA, myosine non musculaire contractilité IIA-dépendante du cytosquelette d’actine joue un rôle essentiel dans le processus de mechanosensing des cellules souches en 2-D cell culture systèmes3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler et ses collègues ont développé une notion intéressante que les cellules souches adultes, comme la moelle osseuse des cellules de tige (BMS) cultivées sur les biomatériaux de culture cellulaire avec une rigidité similaire à celle des tissus spécifiques, ont tendance à se différencier en cellules provenaient de 5de tissus spécifiques. BMS cellules incubées sur polyacrylamide doux 2D hydrogels recouverts de collagène de type I (avec une rigidité comparable à celle des tissus cérébraux) dans les médias d’expansion ont été spontanément induites à se différencier en premières lignées de neurone, tandis que BMS cellules cultivées sur hydrogels avec une rigidité similaire à celle des tissus musculaires ou osseux collagénique trouvées pour induire la différenciation en premières lignées des myocytes et les ostéoblastes, respectivement, du 2D polyacrylamide hydrogels3,5. Plusieurs chercheurs ont étudié le devenir de cellules souches de la différenciation cultivés sur polyacrylamide hydrogels immobilisées avec le collagène de type I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Toutefois, il convient de mentionner que certains contradictoires rapports1,18,22,23,24 existent pour la célèbre idée suggérée par Engler et al. 5 c’est parce qu’idée5 de Engler a été développé uniquement sur polyacrylamide hydrogels et leurs résultats provenir des caractéristiques particulières de ce biomatériau (polyacrylamide) et pas uniquement à partir de la file d’attente physique (rigidité) de ce biomatériau. Par conséquent, il est important de développer un autre type d’hydrogel, dont la rigidité peut être contrôlée par réticulation de l’hydrogel. À cette fin, les hydrogels bioinert ont été développés, qui ont été préparés de polyvinyle alcool-co-itaconique acide (P-IA) avec une rigidité différente, qui était contrôlée par le degré de réticulation avec une évolution réticulation temps25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. les cellules souches peuvent être cultivées sur ici P-IA hydrogels, ainsi que P-IA hydrogels greffés avec des matrices extracellulaires (ECMs) et oligopeptides. Dans une précédente étude25des cellules souches hématopoïétiques humaines (hHSCs) du sang de cordon ombilical ont été cultivés sur P-IA hydrogels avec des valeurs de rigidité différente allant d’un 3 kPa à 30 kPa module de stockage où la fibronectine ou un oligopeptide dérivé la fibronectine (CS1, EILDVPST) a été greffée sur les hydrogels P-IA. Haute ex vivo expansion pli de hHSCs a été observée chez les hydrogels P-IA greffées avec CS1 ou la fibronectine, qui affiche une rigidité intermédiaire allant de 12 kPa à 30 kPa25.

IPS humaines et cellules d’ES ne peut pas être cultivées sur culture de tissus classiques polystyrène (TCP) plats33,34 parce que ES humains et cellules iPS nécessitent une fixation spécifique aux SEGDA, tels que la vitronectine ou laminine pour maintenir leur pluripotence au cours de la culture à long terme. Par conséquent, plusieurs structures d’oligopeptide-greffés P-IA hydrogels présentant des caractéristiques de rigidité optimale ont été conçus et préparés dans les formations d’une seule chaîne, une chaîne unique avec un segment commun, une double chaîne avec un segment commun et un type ramifié 32de chaîne. Oligopeptide séquences ont été sélectionnés dans les domaines de liaison intégrine et glycosaminoglycanes d’ECMs. Les hydrogels P-IA greffés avec les oligopeptides dérivés de vitronectine avec une double chaîne ou un segment commun, d’un indice de stockage à environ 25 kPa, prise en charge de la culture à long terme de ES humains et de cellules iPS pour plus de 12 passages sous xeno-libre et chimique 32de conditions définies. Le segment mixte et double chaîne de molécules d’adhérence cellulaire sur les hydrogels a facilité la prolifération et la pluripotence des humains ES et iPS cellules32. Ici, un protocole pour la préparation des hydrogels P-IA (avec un module de stockage de 10 kPa à 30 kPa, ce qui a été mesurée dans des conditions humides dans l’air) greffées avec et sans les oligopeptides ou ECMs est décrite. Comment la culture et le passage de plusieurs cellules souches (y compris les cellules souches fluides amniotiques, adipeux dérivées de cellules souches, les cellules ES humaines et cellules iPS humaines) s’affiche.

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Protocole

Les expériences dans cette étude ont été approuvées par les comités d’éthique de l’hôpital de Landseed de Taiwan (IRB-13-05) et l’Université nationale centrale. Toutes les expériences ont été menées conformément aux règlements et lignes directrices gouvernementales et institutionnelles pertinentes et applicables au cours de cette étude.

1. solution et préparation des médias

  1. Purification de polymère
    1. Purifier P-IA avec groupe acide carboxylique avec un degré d’hydrolyse de > 96,5 % de P-IA de lavage avec de l’éthanol. Placer 20 g de P-IA dans 200 mL d’éthanol dans un bécher conique de 500 mL et agiter sur un agitateur magnétique pendant 24 à 30 h. échange l’éthanol avec de l’éthanol fraîche tous les 8-10 h.
    2. Supprimer P-IA de l’éthanol par filtration à l’aide d’un entonnoir Büchner.
    3. P-IA sec de séchage sous vide à température ambiante pendant 24h.
      Remarque : Il est recommandé de nettoyer le piège dans le système de séchage sous vide (par l’élimination de l’éthanol) fréquemment, surtout lors de la première quelques heures, parce que le piège a tendance à s’obstruer après la suppression d’une grande quantité d’éthanol à partir de P-IA.
  2. Préparation de la solution de P-IA
    NOTE : Ajouter le polymère très lentement dans le solvant (eau). Il est recommandé de prendre au moins 15 min ajouter le P-IA dans le solvant. Si le solvant est ajouté dans le polymère, le polymère ne serait pas complètement dissoute. Veillez à ne pas générer de bouillonnement explosif de la solution de P-IA. Porter des lunettes de protection lors de la préparation de la solution de P-IA. Le processus de chauffage de la solution de P-IA est essentiel pour dissoudre cristalline P-IA. Il est suggéré (et préférable) pour préparer la solution de P-IA dans une pièce expérimentale relativement propre, si possible.
    1. Dissoudre le P-IA dans l’eau pure à une concentration de poids 0,050 % pour l’expérience de culture de cellules ou une concentration de poids 0,50 % pour la mesure de rhéomètre : par exemple, dissoudre 50 mg de P-IA dans 100 mL d’eau pure pour la culture cellulaire et 500 mg de P-IA dans 100 mL de eau ionisée (DI) pour les mesures de rhéomètre.
    2. Agiter la solution de P-IA pendant 1 h sur la plaque chauffante.
      Remarque : Pour éviter l’ébullition explosif, ne pas chauffer la solution plus de 95 ° C. Ébullition explosive de la solution de polymère à haute température peut générer des brûlures de la peau. Par conséquent, effectuer le chauffage de P-i a très soigneusement et surveiller la température de la solution de P-IA lors du chauffage.
    3. Après que la solution de P-IA a été refroidie à température ambiante, agiter la solution de P-IA à température ambiante pendant 48 h. congé de solution chaude de P-IA sur le réchaud sans chauffage et ensuite le laisser sans agitation à température ambiante pendant 20 à 24 heures pour que les bulles d’air soient non présent dans la solution de P-IA.
  3. Préparation de la solution de réticulation
    1. Rendre la composition de la glutaraldéhyde réticulation solution 1.0 poids % de solution de glutaraldéhyde aqueuse à 25 %, 20.0 % Na2de poids donc4 à l’aide de 99 % > poids pureté et 1.0 % H2SO4. Par exemple, pour 6 ou 12 bien la plaque de culture cellulaire, ajouter 100 µL de solution de glutaraldéhyde, 2 g de sulfate de sodium et 100 µL de l’acide sulfurique dans 10 mL d’eau pure.
  4. Milieux de culture humaine ES/PS cellulaire
    Remarque : Utilisation DMEM/F12 médias médias 6 essentiels et des médias 8 essentiels pour la culture cellulaire.
    1. Renvoyer surgelés 50 X 8 Essential supplement lentement à la solution du jour au lendemain par décongeler dans le réfrigérateur à 4 ° C.
    2. Ajouter une bouteille de 50 X 8 essentiels complément en un flacon de milieu de base 8 essentiels. Séparer les médias en petites parties aliquotes (50 mL chacune) dans des tubes de centrifugation de 100 mL, puis stocker les médias à-20 ° C.

2. P-IA Hydrogel plat préparation

  1. Préparation du film P-IA
    1. Injecter une portion de 1 mL de la solution de P-IA dans un plat TCP de 35 mm et sécher le plat dans un four à 45 ° C pendant 2 jours pour produire un film P-IA dans un banc propre.
  2. Réticulation des plats hydrogel P-IA
    1. Plonger les films P-IA dans une solution aqueuse de réticulation pour 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 et 48 h.
      NOTE : ' P-IA -X' (p. ex., P-IA-12 h) se réfère à un P-IA hydrogel réticulé pour X h (p. ex., 12 h).
    2. Après réticulation, rincer les hydrogels P-IA avec de l’eau pure à la température ambiante et ensuite garder hydrogels dans l’eau pure à la température ambiante dans un banc propre.
    3. Stériliser les hydrogels P-IA par immersion dans une solution d’éthanol 75,0 volume/volume% pendant 1 min, rincez les hydrogels P-IA dans l’eau pure six fois et puis garder les hydrogels P-IA dans l’eau pure jusqu'à ce que les employés pour la culture cellulaire.
  3. Préparation de plats d’hydrogel P-IA greffée avec oligopeptide ou ECM
    1. Activer les hydrogels P-IA par immersion dans 1 mL d’une solution aqueuse contenant 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide chlorhydrate (EDC) et 10 mg/mL, N- hydroxysuccinimide (NHS) pendant 1 h à 37 ° C ou 4 h à 4 ° C.
    2. Rincer les hydrogels P-IA avec 1 mL de phosphate buffered saline (PBS, pH 7,2) 3 fois et y plonger les hydrogels P-IA dans une solution de PBS contenant 1 mL d’oligopeptide (100-1 500 µg/mL) ou ECM (10 à 100 µg/mL) pendant 24 h à 4 ° C.
      Remarque : Les séquences d’oligopeptide et SEGDA utilisés pour la culture de cellules souches est résumées dans le tableau 1.
    3. Après la greffe l’oligopeptide ou ECM, laver les hydrogels P-IA avec de l’eau pure 3 fois.
      Remarque : Les hydrogels P-IA greffés Y µg/ml d’oligopeptide ou ECM (Z) sont ci-après dénommés P-IA -Xh -Z ouX-IA-Ph -Z-Y, où X désigne le temps de réticulation (h), Y indique la concentration de l’oligopeptide ou ECM, et Z indique un oligopeptide différent ou ECM.

3. Culture de cellules d’ES/iPS humain

  1. Méthode de passage et d’entretien des ES humaines indifférenciées et des cellules iPS
    1. Maintenir ES humaine (par exemple, WA09 ou H9) cellules ou iPS humaine (p. ex., HS0077) cellules sur Matrigel essentiel 8 médias dans des plats de 6 cm à l’aide de standard humain ES/iPS cell culture protocoles28,32.
    2. Incuber près-anastomosé humain ES/CSPI avec a 2,0 mg/mL II en milieu DMEM/F-12 à 37 ° C pendant 8 à 10 min, puis rincer les cellules humaines d’ES/iPS deux fois avec les médias DMEM/F12.
    3. Après l’ajout de 2 mL de DMEM/F-12 médias humains récipients de culture de cellules d’ES/iPS, détacher faiblement adhérentes colonies au moyen d’un grattoir de cellules ou de pipetage.
    4. Recueillir les cellules d’ES/iPS humaines dans des tubes de centrifugation de 15 mL et centrifuger des cellules d’ES/iPS humaines à 160 × g pendant 5 min à 37 ° C.
    5. Après centrifugation, ignorer le DMEM/F12 et suspendre les cellules d’ES/iPS humaines dans 1 mL de E8 média et puis compter la densité des cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
    6. Ensemencer les cellules ES/iPS après le réglage de la densité appropriée (1-5 x 104 cellules / cm2 pour passage ou comme indiqué) à nouveau Pétri (P-IA hydrogels greffées avec l’oligopeptide ou ECM).

4. caractérisation de caractérisation de cellules ES humaines/iPS

  1. Évaluation de l’activité de la phosphatase alcaline (PA)
    1. Mesurer l’activité de la phosphatase alcaline (PA) de cellules d’ES/iPS humaines utilisant un marquage direct de phosphatase alcaline standard.
  2. Immunomarquage
    1. Effectuer immunostaining des Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 et Oct3/4 cellules hES et les hanches pour étudier la pluripotence suivant le protocole classique28,32.
    2. Ajouter un volume de 0,5 mL de paraformaldéhyde à 4 % (volume/volume) dans chaque plat bien 24 dans lequel les cellules d’ES/iPS humaines ont été cultivées et par la suite, incuber les plats pendant 15 min à 4 ° C pour fixer les cellules.
    3. Aspirer la solution de paraformaldéhyde dans chaque puits. Ensuite, ajouter 1 mL de PBS / puits et aspirer PBS pour rincer les cellules. Effectuer le processus de rinçage 3 fois.
    4. Permeabilize des membranes cellulaires en ajoutant 0,5 mL de 0,3 % (volume/volume) solution de Triton X 100 en PBS pendant 30 min à température ambiante.
    5. Aspirer la solution de Triton X 100 ajouter 300 µL de 2 % (poids/volume) d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS (tampon de blocage) dans chaque puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
    6. Retirer le tampon de blocage en pipettant également et ajouter par la suite, les anticorps primaires désirés (Oct3/4 (1 : 200), Sox2 (1 : 200), SSEA-4 (1 : 200) et Tra-1-81(1:200) la pipette, voient tableau 2) dans chaque puits, où 1 : 200 indique les anticorps ont été dilués avec du PBS 200-fold et incubé pendant une journée à 4 ° C.
    7. Aspirer la solution de l’anticorps primaire et laver les cellules avec 300 µL de 0,05 % Tween 20 dans une solution de PBS 3 fois à température ambiante.
    8. Ajouter 300 µL d’anticorps secondaires (1 : 200, voir tableau 2), qui sont spécifiques au sous-type IgG primaire, dans une solution BSA 2 % (poids/volume) dans chaque bien et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité.
    9. Laver les cellules avec 300 µL de 0,05 % Tween 20 dans une solution de PBS 3 fois à température de la pièce dans l’obscurité.
    10. Analyser les cellules colorées en microscopie à fluorescence ou en microscopie confocale.
  3. Formation de corps embryoïdes
    1. Étudier la pluripotence des cellules d’ES/iPS humaines par la formation de corps embryoïdes (EB) à passages 10 et 20.
      Remarque : Près de 80 % confluent en plaques 6 puits est suffisante pour l’établissement de formation de l’EB.
    2. Rincez ES humaines ou cellules iPS avec 2 mL de DMEM/F-12 médias deux fois et puis plonger les cellules dans 1,5 mL d’essentiel 6 médias.
    3. Dépecée près de 80 % humain ES ou iPS confluentes à environ 32 utilisation 200 µL conseils. Ensuite, détachez les cellules de la vaisselle à l’aide d’un grattoir de cellules.
    4. Recueillir des cellules d’ES/iPS humaines et le transfert dans un plat de fixation ultra basse 6 puits.
    5. Échangez des 6 médias essentiels de pipetage anciens médias et en ajoutant les supports neufs tous les 2 jours.
      Remarque : La Culture des cellules en suspension pendant 2 semaines à 37 ° C avec 5 % de CO2.
    6. Après l’EBs étaient suspendues homogène dans les médias 6 essentiels, transfert EBs à la culture sur la vaisselle TCP 24 puits recouverts de 0,1 poids % de gélatine et la culture des cellules essentielles 6 médias pendant une semaine supplémentaire.
    7. Colorer les cellules avec des anticorps dirigés contre les marqueurs des cellules dérivées de trois couches de cellules germinales embryonnaires [AFP (endoderme), GFA (ectoderme), β tubuline-III (ectoderme) et SMA (mésoderme)] et d’évaluer les cellules par la méthode immunostaining décrite ci-dessus.
  4. Formation de tératome
    1. Étudier la pluripotence des cellules d’ES/iPS humaines par la formation de tératome à passages 10 et 20.
      Remarque : 5 plats de près de 80 % de confluence en plaques 6 puits sont suffisantes pour la formation de tératome (au moins 3 x 106 cellules sont nécessaires pour les expériences de formation de tératome).
    2. Rincer les cellules avec 2 mL DMEM/F-12 médias deux fois et puis ajouter 1,5 mL DMEM/F-12 supports pour les récipients de culture cellulaire.
    3. Dépecée presque 80 % humain ES ou iPS confluentes à environ 32 par utilisation de 200 µL conseils. Ensuite, détachez les cellules de la vaisselle à l’aide d’un grattoir de cellules.
    4. Recueillir des cellules d’ES/iPS humaines dans un tube de centrifugation de 15 mL et centrifuger les cellules à 160 × g pendant 5 min à 37 ° C.
    5. Après centrifugation, suspendre les granules cellulaires dans 100 µL DMEM/F12 et puis mélanger la cellule pastilles avec 100µl Matrigel (ratio 1:1 volume).
    6. Transférer la suspension cellulaire dans une seringue de refroidissement préalable de-20 ° C. Injecter, au total, au moins 3 × 106 cellules par voie sous-cutanée dans mâle NOD-SCID (clin de œil. CB17 -PrkdaDICS/JNarl) souris (5-8 semaines).
    7. Après 5 à 8 semaines, disséquer les tératomes, difficulté avec la solution de paraformaldéhyde de 4,0 % (poids/volume) et ensuite stocker à 4 ° C.
    8. Fixer le tératome avec paraffine, tranchez les tératomes de paraffine et coloration à l’hématoxyline et éosine (H & E) en utilisant un protocole standard28,32.
      Remarque : Les chercheurs peuvent envoyer tératome fixe tissu à la société et de fixer les tératomes avec paraffine, tranche la paraffine tératomes, détachant l’échantillon avec H & E, qui est généralement utilisée dans le département de pathologie à l’hôpital.
  5. Culture de cellules souches humaines dérivées adipeux (annonces)
    1. Milieux de culture chaude (DMEM contenant 1 % antimycosiques antibiotique et 10 % bovin sérum fœtal (SVF)), 0,25 % de trypsine-EDTA et PBS à 37 ° C dans une eau bain à avant utilisation.
    2. Laver les cellules humaines de ADS de pipetage à 10 mL de PBS dans chaque boîte de Pétri 6 cm où les cellules sont cultivées.
    3. Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA (0,25 %) dans les récipients de culture de 6 cm et incuber la solution à 37 ° C pendant 5 min.
    4. Observer les cellules dans les récipients de culture de 6 cm sous microscope afin de confirmer que les cellules sont détachent.
    5. Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajouter un volume égal de milieux de culture (DMEM contenant des antibiotiques antimycosiques 1 % et 10 % SVF) dans le tube à centrifuger pour neutraliser la trypsine-EDTA.
    6. Centrifuger les cellules à 250 × g pendant 5 min à 37 ° C.
    7. Après centrifugation, jeter le surnageant soigneusement en pipettant également, sans déranger le culot cellulaire.
    8. Remettre en suspension les cellules dans les milieux de culture et des graines puis les cellules à la densité appropriée (5-10 x 103 cellules / cm2 pour passage ou comme indiqué) à nouveau Pétri (P-IA hydrogels greffées avec et sans les oligopeptides et ECM).
  6. Le liquide amniotique humain proviennent de culture cellulaire (AFS)
    1. Réchauffer des supports de culture (DMEM/CMPD 201 (2:3) contenant 20 % sérum fœtal (SVF), 5 ng/mL bFGF et antibiotiques antimycosiques 1 %), 0,25 % de trypsine-EDTA et PBS à 37 ° C dans une eau bain à avant utilisation.
    2. Laver les cellules humaines AFS de pipetage 10 mL de PBS dans chaque boîte de Pétri 6 cm où les cellules sont cultivées.
    3. Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA (0,25 %) dans les récipients de culture de 6 cm et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min.
    4. Observer les cellules sur 6 cm Pétri sous microscope afin de confirmer les cellules sont détachent.
    5. Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajouter un volume égal de milieux de culture (DMEM/CMPD 201 (2:3) contenant sérum bovin fœtal (SVF) 20 %, 5 ng/mL bFGF et antibiotiques antimycosiques 1 %) dans le tube à centrifuger pour neutraliser la trypsine-EDTA.
    6. Centrifuger les cellules à 250 × g pendant 5 min à 37 ° C.
    7. Après centrifugation, jeter le surnageant soigneusement sans déranger le culot cellulaire par pipetage.
    8. Remettre en suspension les cellules dans les médias de la culture et des graines puis les cellules à la densité appropriée (5-10 x 103 cellules / cm2 pour passage ou comme indiqué) à nouveau Pétri (P-IA hydrogels greffées avec ou sans oligopeptide et ECM).

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Résultats

P-IA hydrogels greffés avec oligopeptide dérivé ECM (oligoECM) ou ECM avec des élasticités différentes ont été préparés en suivant le schéma réactionnel, comme on le voit à la Figure 1 a, à l’aide de différents types d’oligoECM (Figure 1 b). Les élasticités de l’hydrogel étaient régies par l’intensité de la réticulation appliquée (temps) (Figure 1). P-IA hydrogels greffées avec oligopeptides dérivés ...

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Discussion

P-IA-oligoECM et P-IA-ECM hydrogels avec raideur variable ont été développées pour l’expansion à long terme de ES humain et CSPi conservant leur pluripotence pour plus de dix passages dans des conditions sans xeno, ainsi que pour la culture de cellules humaines de l’AFS, cellules d’annonces, et les cellules souches hématopoïétiques25,28,32. P-IA hydrogels immobilisées avec oligoECM sont un excellent candidat pour les matériaux d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été partiellement prises en charge par le ministère de la Science et technologie, Taiwan sous concession numéros 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 et 104-2221-E-008-107-MY3. Cette recherche a été également pris en charge par le projet de l’hôpital de Landseed de Taiwan (NCU-LSH-105-A-001). Une subvention pour la recherche scientifique (numéro 15K 06591) depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie du Japon est également reconnue. A. Higuchi aimerait remercier pour le programme de partenariat scientifique International (ISPP-0062) Vice Rectorat pour les études supérieures et postdoctorales, Université du Roi Saoud, Riyadh 11451, Royaume d’Arabie saoudite.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GTPGPQGIAGQRGVVPH JaponaucunSpécification : Oligopeptide
Abréviation : Cyclique RGD, cRGD
GACRGDCLGAPH JaponaucunSpécification : Oligopeptide
Abréviation : FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH JaponaucunSpécification : Oligopeptide
Abréviation : CS1
EILDVPSTPH JaponaucunSpécification : Oligopeptide
Abréviation : VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH JaponaucunSpécification : Oligopeptide
Abréviation : HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH JaponaucunSpécification : Oligopeptide
Abréviation : HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH JaponaucunSpécification : Oligopeptide
Abréviation : VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JaponaucunSpécification : Oligopeptide
Abréviation : VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JaponaucunSpécification : Matrice extracellulaire
Abréviation : rVN
VitronectinThermo Fisher scientificA14700Spécification : Matrice extracellulaire
Abréviation : FN
FibronectinSigma-AldrichF2006Spécification : Matériau de revêtement disponible dans le commerce
Abréviation : Synthemax
II Synthemax IICorning3535Spécification : Polymère
Polyvinylalcool-acide co-itaconiqueJapon VAM & PovalAF-17Spécification :
GlutaraldéhydeSigma-AldrichG5882Spécification : Chimique
Na2SO4Sigma-Aldrich239313Spécification : Chimique
H2SO<>4Sigma-Aldrich339741Spécification : Chimique
Abréviation : EDC
N-(3-Diméthylaminopropyl)-N'-chlorhydrate d’éthylcarbodiimideSigma-AldrichE7750Spécification : Chimique
Abréviation : NHS
N-hydroxysuccinimideSigma-Aldrich56480Spécification :
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148Spécification : Chimique
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Spécification : Consommable de culture cellulaire
Racleur cellulaireCorning3008Spécification : Consommable de culture cellulaire
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693Spécification : Milieu de culture cellulaire
Essential 6Thermo Fisher scientificA1516401Spécification : Milieu de culture cellulaire
Essential 8Thermo Fisher scientificA1517001Spécification : Milieu de culture cellulaire
DMEM/F12Thermo Fisher scientific11330-032Spécification : Milieu de culture cellulaire
DMEMThermo Fisher scientific12800-017Spécification : Milieu de culture cellulaire
MCDB 201Sigma-AldrichM6770Spécification : Cellule ES
humaine Cellule ESWiCell Research Institute, Inc..WA09Spécification : Cellule iPS
Cellule humaineRiken Cell BankHS0077Spécification : 35 mm
Abréviation : TCP
TCP platCorning353001Spécification : 60 mm
Abréviation : TCP
TCP platCorning353002Spécification : 24 puits
plat 24 puits Corning353047Spécification : Blocage agent
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA8806Spécification : Réactif de détection
Phosphatase alcaline coloration vivanteThermo Fisher scientificA14353Spécification : Réactif de détection
Hématoxyline & eosineSigma-Aldrich1.05175Spécification : Boîte de formation EB
Boîte à 6 puits à fixation ultra-faibleCorning3471Spécification : Matériau de revêtement
gélatineSigma-AldrichG9391Spécification : Matériau de revêtement
MatrigelCorning354230Spécification : souris
NOD-SCID sourisNational Applied Research LaboratoriesAucunSpécification : sérum
fœtal bovin sérumBiological Industries04-001-1ASpécification : antibiotique
antibiotique antimycosiqueThermo Fisher scientific15240-062Spécification :
Anticorps Anticorps pour NanogInvitrogenMA1-017Spécification : Anticorps
Anticorps pour SSEA4Abcamab16287Spécification :
Anticorps Anticorps pour OCT3/4InvitrogenPA5-27438Spécification :
Anticorps Anticorps pour Sox2Invitrogen48-1400Spécification :
Anticorps Anticorps pour l’actine des muscles lissesInvitrogenPA5-19465Spécification :
Anticorps Anticorps pour AFPInvitrogenPA5-21004Spécification :
Anticorps GFAPInvitrogenMA5-15086Spécification : Anticorps
Alexa Fluor 555 &ndash ; anticorps conjugué de chèvre anti-sourisInvitrogenA-21422Spécification : Anticorps
Alexa Fluor 488 &ndash ; Anticorps conjugué de chèvre anti-lapinInvitrogenA-11008Spécification : Anticorps
chimique chimique

Références

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