Article de méthode

Illuminant les voies à l’Activation des caspases utilisant la Fluorescence bimoléculaire complémentation

DOI :

10.3791/57316

⸱

5 mars 2018

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la caspase bimoléculaire complémentation de Fluorescence (BiFC) ; une méthode axée sur l’imagerie qui permet de visualiser la proximité induite par des caspases initiateur, qui est la première étape de leur activation.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La famille de caspase des protéases joue un rôle essentiel dans l’apoptose et l’immunité innée. Parmi ceux-ci, un sous-groupe appelé initiateur caspases sont les premiers à être activées dans ces voies. Ce groupe comprend caspase-2, -8 et -9, ainsi que les caspases inflammatoires, caspase-1, -4 et -5. Les caspases initiateur sont tous activés par dimérisation suivant l’embauche à des complexes multiprotéiques spécifiques appelées plates-formes d’activation. Complémentation de Fluorescence bimoléculaire caspase (BiFC) est une approche axée sur l’imagerie où se sépare des protéines fluorescentes fondues à détonateur caspases sont utilisées pour visualiser le recrutement des caspases initiateur à leurs plates-formes d’activation et de la proximité induite. Cette fluorescence fournit une lecture de l’un des premiers étapes requises pour l’activation des caspases initiateur. À l’aide d’un certain nombre de différentes approches axées sur la microscopie, cette technique peut fournir des données quantitatives sur l’efficacité de l’activation de la caspase sur une échelle de la population ainsi que la cinétique de l’activation de la caspase, la taille et le nombre d’activation des caspases complexes sur une base par cellule.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La famille de protéases de caspase est connue pour leur rôle essentiel dans l’apoptose et l’immunité innée 1. En raison de leur importance, déterminer quand, où et comment efficacement des caspases sont activés peut apporter un éclairage crucial sur les mécanismes de la caspase voies d’activation. Le protocole de base d’imagerie décrit ici permet la visualisation des premières étapes dans la cascade d’activation de la caspase. Cette technique tire parti des interactions dynamiques : la protéine cette activation de caspases en voiture.

Les caspases peuvent être divisés en deux groupes : les caspases initiateur (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 et -12) et les caspases bourreau (caspase-3, -6 et -7). Les caspases bourreau sont présents dans la cellule comme dimères préformés et sont activés par un clivage entre la grande et petite sous-unité 2. Lorsqu’il est activé, ils fendent de nombreuses protéines structurelles et réglementaires, aboutissant à l’apoptose 3. Les caspases initiateur sont les caspases premières pour être activé dans une voie généralement déclencher l’activation des caspases bourreau. Contrairement au bourreau caspases, initiateur caspases sont activés par dimérisation 4,5. Cette dimérisation est facilitée par le recrutement de monomères inactifs pour spécifique grand poids moléculaire complexes appelées plates-formes d’activation. Assemblée des plates-formes d’activation est régie par une série d’interactions de protéine : protéine spécifique. Ceux-ci sont médiés par des motifs d’interaction protéine conservée présents dans le proform de la caspase initiatrice et incluent le domaine mort (DD), le domaine effecteur de mort (DED) et la caspase recrutement domaine (carte) 6 (Figure 1 a). Plates-formes d’activation incluent généralement une protéine réceptrice et une protéine adaptatrice. Habituellement, le récepteur est activé lors de la liaison d’un ligand, induisant un changement conformationnel permettant l’oligomérisation de nombreuses molécules. Le receveur recrute alors soit la caspase directement ou les molécules d’adaptateur qui à son tour apportent la caspase au complexe. Ainsi, les nombreuses molécules de caspase entrent en proximité permettant une dimérisation. Ceci est connu comme le modèle de proximité induite par 7. Une fois que les mélanges, la caspase subit une autoprocessing, qui sert à stabiliser l’enzyme active 4,8. Par exemple, l’Assemblée de l’apoptosome Apaf1 est déclenchée par le cytochrome c, suite à sa sortie de la mitochondrie dans un processus appelé la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP). Apaf1 recrute à son tour caspase-9 grâce à une interaction qui est véhiculée par une carte présente dans les deux protéines 9. Résultat des interactions protéine similaire dans l’Assemblée de la mort CD95 induisant la signalisation complexe (disque) qui mène à l’activation de la caspase-8 ; le PIDDosome, qui peut activer la caspase-2 ; et divers complexes inflammasome qui initie l’activation de la caspase-1 10,11,12. Ainsi, initiateur caspases sont recrutés aux plates-formes d’activation spécifique par un mécanisme commun aboutissant à proximité induite et une dimérisation, sans laquelle activation ne se produira pas.

Complémentation de Fluorescence bimoléculaire caspase (BiFC) est une analyse axée sur l’imagerie qui a été développée pour mesurer cette première étape de l’activation des caspases initiateur, ce qui permet une visualisation directe de la proximité de caspases induite par suite de plateforme d’activation Assemblée. Cette méthode tire parti des propriétés de la protéine fluorescente split Venus. Vénus est un plus brillant et plus version photostable de la protéine fluorescente jaune (YFP) qui peut être séparé en deux fragments non fluorescent et légèrement superposées : l’extrémité N-terminale de Vénus (Venus N ou VN) et l’extrémité C-terminale de Vénus (Venus C ou VC). Ces fragments conservent la possibilité de replier et devient fluorescent lorsqu’à proximité 13. Chaque fragment de Vénus est fusionnée à la prodomain de la caspase, c'est-a-dire la portion minimale de la caspase qui se lie à la plateforme d’activation. Cela garantit que les caspases ne conservent pas l’activité enzymatique et par conséquent une analyse concomitante des événements en aval associés aux événements endogènes est possible. La Vénus des fragments repli quand les caspase prodomains sont recrutés à la plateforme d’activation et subissent une proximité induite. (Figure 1 b). La fluorescence de Vénus qui en résulte peut être utilisée avec précision et plus particulièrement surveiller la localisation subcellulaire, la cinétique et l’efficacité de l’Assemblée d’initiator caspase activation plates-formes dans des cellules individuelles. Données d’imagerie peuvent être acquises par microscopie confocale ou par microscopie de fluorescence standard et peut être adaptée à un certain nombre d’approches différentes de la microscopie, y compris : imagerie Time-lapse pour suivre l’activation de la caspase en temps réel ; imagerie à haute résolution pour des déterminations précises de localisation sous-cellulaire ; et la quantification de point de terminaison de l’efficacité de l’activation.

Cette technique a été développée afin d’étudier l’activation de la caspase-214. Tandis que la plate-forme d’activation de la caspase-2 est considérée comme le PIDDosome, composé du récepteur PIDD (induite par la p53 protéine avec un domaine de mort) et l’adaptateur RAIDD (protéines homologues RIP-associated ICH-1/CAD-3 avec un domaine de mort), Activation de caspase-2 PIDDosome-indépendant a été signalée. Ceci suggère que les plates-formes d’activation supplémentaire pour caspase-2 existent 15,16. Malgré ne connaissant pas les composants complètes de la plate-forme d’activation de la caspase-2, la caspase BiFC technique a laissé pour interrogatoire réussie des voies de signalisation caspase-2 au niveau moléculaire 14,17. Nous avons également adapté ce protocole pour les caspases inflammatoires (caspase-1, -4, -5 et -12) 18 et, en principe, la même approche devrait être suffisante pour analyser de la même façon chacun des caspases initiateur restants. Ce protocole pourrait de même être adapté pour étudier d’autres voies ont été dimérisation est un important signal activant. Par exemple, les protéines STAT sont activés par dimérisation après phosphorylation par Janus kinase (JAK) 19. Ainsi, le système de BiFC pourrait servir à visualiser pour activation STAT ainsi que plusieurs autres sentiers réglementés par des interactions de protéine dynamique. Le protocole suivant fournit des instructions détaillées pour la mise en place des journalistes dans les cellules, ainsi que des méthodologies d’analyse et d’acquisition d’images.

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Protocole

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1. préparation des cellules et Pétri

Remarque : Effectuez les étapes 1 à 3 dans une hotte à flux laminaire vitroplants. Porter des gants.

  1. Si vous utilisez des plats en verre bas, enduire le verre avec la fibronectine. Passez à l’étape 1.2 Si vous utilisez des plats en plastique.
    1. Préparer une solution à 0,1 mg/mL de la fibronectine : Diluer 1 mL de 1 mg/mL de solution de la fibronectine dans 9 mL de solution 1 PBS X.
    2. Tapissez le fond de verre de chaque puits avec 0,5 à 1 mL de la fibronectine et incuber pendant 1 à 5 min à température ambiante.
    3. À l’aide d’une pipette, recueillir la solution de la fibronectine et conserver à 4 ° C.
      Remarque : La solution de la fibronectine peut être réutilisée plusieurs fois.
    4. Laver le verre une fois avec 1 à 2 mL 1 X PBS et aspirer au large de PBS.
  2. Plaque de 1 x 105 cellules / puits d’une plaque de 6 puits dans 2 mL des milieux de culture de cellule appropriée (voir tableau 1 pour le nombre de cellules à utiliser pour les puits de tailles différentes). Si vous utilisez une ligne de cellules exprimant stablement les composants de BiFC caspase (voir Discussion), plaque 2 x 105 cellules et passez à l’étape de traitement (étape 3).
  3. Permettre aux cellules d’adhérer au plat du jour au lendemain à 37 ° C dans un incubateur de culture de tissus.

2. la transfection des cellules d’introduire les composants de BiFC caspase

  1. Transfecter les cellules avec le réactif de transfection approprié.
    Remarque : Ce protocole décrit le mode de Lipofectamine 2000, qui a été optimisé pour toxicité minimale. Ce protocole a été utilisé avec succès dans les cellules Hela, les cellules MCF7 et les cellules LN18. Si vous utilisez des réactifs de transfection suivent les instructions du fabricant et optimiser selon les besoins.
    1. Ajouter 12 µL de réactif de la transfection à 750 µL des médias réduit de sérum dans un tube stérile.
    2. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
    3. Ajouter 10 ng d’un plasmide de journaliste (un plasmide codant pour une protéine fluorescente, par exemple rouge fluorescent protéine [DP], qui étiquettera les cellules transfectées) dans un tube stérile de 1,5 mL pour chaque puits à transfecter.
    4. Ajouter 20 ng de chaque plasmide de BiFC caspase (p. ex., 20 ng de caspase-2 prodomain [Pro C2]-VC et 20 ng de C2 Pro-VN) dans chaque tube (tableau 2).
    5. Aligner chaque tube atteignant un volume total de 100 µL en ajoutant des médias sérum réduit.
    6. À l’aide d’une pipette de p200, ajouter 100 µL de solution de réactif de transfection de l’étape 2.1.2 au mélange plasmide d’une manière goutte à goutte.
    7. Incuber le mélange réactif de plasmide-transfection pendant 20 min à température ambiante.
    8. Aspirer les médias des cellules à l’aide d’une pipette ou avec aspiration et ensuite, à l’aide d’une pipette p1000, pipette 800 µL de médias libres sériques doucement sur le côté du puits.
    9. À l’aide d’une pipette de p200, ajouter 200 µL du complexe ADN-lipides goutte à goutte dans chaque puits.
    10. Incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C pendant 3 h.
    11. Prenant soin de ne pas perturber la monocouche, retirez le support gratuit de sérum contenant des complexes ADN-lipides par aspiration à l’aide de dragues ou avec une pipette.
    12. Pipette de 2 mL de milieux de culture complet de pré chauffé (37 ° C) doucement sur le côté de chaque puits.
  2. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire pendant 24-48 h pour l’expression de protéines optimal.

3. induction d’activation des caspases

  1. Traiter avec un médicament ou un stimulus qui provoque la caspase activation environ 24 h après la transfection.
    1. Ajouter la concentration désirée de la drogue à préchauffé (37 ° C) supports d’imagerie (milieux de culture complet additionné de Hepes [20 mM, pH 7,2 à 7,5] et le 2-mercaptoéthanol [55 µM]) et mélanger doucement (tableau 3).
    2. Aspirer les médias des cellules à l’aide d’une pipette ou avec aspiration et ensuite, à l’aide d’une pipette, pipette de 2 mL de la solution de 3.1.1 doucement sur le côté du puits.
    3. Ajouter des médias d’imagerie sans la drogue à un puits comme un témoin non traité.
  2. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C à culture tissulaire ou passer à l’étape 4.3 pour une expérience de Time-lapse.

4. Acquisition de données de Caspase BiFC

  1. Caspase BiFC pour l’acquisition de point seule fois
    1. Allumez le microscope et la source de lumière fluorescente, suivant les instructions du fabricant.
    2. Trouver les cellules sous le filtre de la DP et mettant l’accent sur la fluorescence de gène de journaliste.
    3. À l’aide d’un compteur de main-tally, compter toutes les cellules DP-positifs dans le champ visuel. Notez le numéro.
    4. Tout en conservant le même champ visuel, basculez vers le filtre de la GFP (ou le filtre YFP si disponible) et, à l’aide d’un compteur de main-tally, compter le nombre de globules rouges qui sont aussi en vert (Vénus-positif). Basculer entre les deux filtres pour s’assurer que seules les hématies sont évaluées pour Vénus-positivité. Notez le numéro (Figure 3).
    5. Compter au moins 100 cellules DP positives de chacun des trois domaines individuels de la plaque.
    6. Dans chaque région, calculer le pourcentage de cellules transfectée Venus positif (c'est-à-dire les globules rouges qui sont aussi en verts). Moyenne des pourcentages qui en résultent pour obtenir l’écart-type.
  2. Imagerie en trois dimensions de la caspase BiFC
    1. Allumez le microscope en suivant les instructions du fabricant et lancer le logiciel d’acquisition.
    2. Sélectionnez le x 60 ou 63 x, objectif huile et déposez une goutte d’huile sur l’objectif
    3. Placer le plat de la culture sur la platine du microscope en utilisant le support de plaque correcte.
    4. Soit une source de lumière épifluorescence et l’oculaire du microscope ou le laser confocal et l’écran de l’ordinateur, accédez à un champ d’intérêt.
    5. Mettre l’accent sur la fluorescence de journaliste en utilisant le laser de la DP ou le filtre.
    6. Si épifluorescence a été utilisée jusqu'à ce point, basculer la source lumineuse vers le laser confocal et visualiser l’image en direct des cellules comme acquises par la caméra et affiché par le logiciel d’acquisition sur l’écran de l’ordinateur.
    7. À l’aide de la commande joystick et la molette de mise au point, affiner la mise au point et la position des cellules pour que les cellules sont au centre du viseur. Choisir les cellules qui sont séparés les uns des autres et ne sont chevauchent pas.
    8. Entrée de la puissance de laser de pourcentage à 50 % et la durée d’exposition à 100 ms pour Vénus et DP comme point de départ pour déterminer les paramètres optimaux à utiliser pour l’expérience.
    9. Tourner sur la capture d’animaux vivants et d’inspecter l’image résultante et les histogrammes d’affichage qui l’accompagne pour les deux canaux.
    10. Si le signal est faible et que l’image est difficile à distinguer, porter le pourcentage laser puissance et/ou d’exposition par incréments jusqu'à ce que le signal dans l’image semble bon.
    11. S’assurer que le signal n’atteint pas la saturation. Inspecter l’histogramme de l’affichage pour vous assurer qu'un pic distinct est visible pour chaque fluor. Si le pic englobe l’affichage de l’histogramme ensemble, entrée laser puissance et exposition réglages inférieurs (Figure 2).
    12. Visualiser les cellules témoins (non traités ou non transfectées) dans les mêmes conditions pour que le signal soit spécifique.
      NOTE : Unicolores transfectants peut également servir à contrôler pour crossover, mais si les signaux sont spatialement distinct (p. ex. mitochondriale et cytosolique) ce n’est pas nécessaire.
    13. Sélectionnez ou ouvrez le module de pile de Z dans le logiciel de microscope.
    14. À l’aide de la molette de mise au point, proche de la position focale correspondant au centre de la cellule.
    15. Ajuster le focus dans une seule direction, jusqu'à ce que la cellule n’est plus visible, sélectionnez cette option dans la position supérieure.
    16. Ajuster la mise au point dans la direction opposée jusqu'à ce que la cellule ne soit à nouveau n’est plus visible et sélectionnez cette option, comme la position la plus basse.
    17. Choisissez la taille de palier optimale (habituellement environ 20 µm) et commencer l’acquisition pour demander à la caméra pour prendre automatiquement une image unique dans chaque canal, à chacune des 20 étapes µm entre les positions en haut et en bas.
    18. Logiciel de rendu 3D permet de reconstruire l’image 3D (Figure 4Movie 1).
  3. Time-lapse imagerie de caspase BiFC
    1. Au moins 1 h avant l’expérience, mettre en marche le microscope et régler la température à 37 ° C.
    2. Sélectionnez le x 40, x 60 ou 63 x huile objectif et déposez une goutte d’huile sur l’objectif.
    3. Placer le plat de la culture sur la platine du microscope en utilisant le support de plaque correcte.
    4. Si une source de CO2 est disponible, placez le dispositif d’administration de CO2 (généralement un couvercle de plexiglas au tube qui délivre le CO2) sur le support de plaque. Régler le CO niveau2 à 5 % et mettre sur le contrôleur de2 CO de dans le logiciel. Si une source de CO2 n’est pas disponible, inclure 20 mM Hepes pour tamponner les médias.
    5. Accédez à un champ de cellules transfectées et visualiser l’image en direct des cellules comme acquises par la caméra et affiché par le logiciel d’acquisition sur l’écran de l’ordinateur en utilisant le laser de DP.
    6. Suite d’étapes 4.2.8-4.2.12, entrée les paramètres laser pourcentage puissance et exposition de temps pour le laser de DP. Conserver ces valeurs aussi bas que possible tout en étant capable de détecter le signal fluorescent.
    7. L’échantillon à l’aide d’un contrôle positif (voir tableau 3 pour des exemples), suivez étapes 4.2.8-4.2.12 pour entrer les paramètres pour le temps de pouvoir et exposition de laser pourcentage de lumière laser YFP. Conserver ces valeurs aussi bas que possible tout en étant capable de détecter le signal de Vénus.
    8. Pour chaque puits de la plaque, choisir un certain nombre de positions différentes qui contiennent une ou plusieurs cellules exprimant le reporter.
    9. L’intervalle de temps entre chaque image du Time-lapse et total nombre de trames à prendre de l’entrée. S’assurer qu’il est temps d’acquérir toutes les positions sélectionnées avant que l’image suivante est à prendre.
    10. Re-visiter chaque position et corriger et mettre à jour la mise au point selon les besoins.
    11. Pour corriger la dérive focal qui peut résulter de variations de température ou des vibrations extérieures, allumez le système de correction de dérive focus (si disponible).
    12. Commencer le Time-lapse et enregistrer les données.
    13. Analyser les données à l’aide de logiciels d’imagerie disponibles (Figure 5le film 2).

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Résultats

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Un exemple de caspase-2 BiFC induite par l’altération de l’ADN est illustré à la Figure 3. Camptothécine, une topoisomérase I inhibiteur, a été utilisé pour induire l’activation de l’ADN des dommages et de la caspase-2. Le mCherry de la protéine fluorescente rouge a été utilisé comme reporter pour montrer que les cellules expriment la sonde BiFC et pour aider à visualiser le nombre total de cellules. Fluorescence de Vénus est affiché en vert et le grand exame...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole traite de l’utilisation de fractionnement des protéines fluorescentes pour mesurer la proximité de caspases induite. Vénus de Split a été choisie pour cette technique car il est très lumineux, hautement photostable et le repliement est rapide 13. Ainsi, l’analyse de Vénus repliement à proximité de caspases induite peut fournir près des estimations en temps réel de la dynamique des interactions protéine caspase. Vénus est divisée en deux fragments légèrement superposées, du N terminale...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier tous les membres précédents du laboratoire Bouchier-Hayes qui ont contribué au développement de cette technique. Ce travail a été financé en partie par hôpital pédiatrique pilote award un Texas enfants à LBH. Nous remercions Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas, États-Unis) pour obtenir l’autorisation d’inclure des données publiées en collaboration avec son équipe. Le développement des réactifs décrit a été soutenu par la cytométrie en flux et noyau de tri cellulaire au Baylor College of Medicine financée par les NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 et RRRNC S10RR024574) et l’assistance de Joel M. Sederstrom

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plats à fond en verre 6 puits non revêtus n° 1.5 de 20 mmMattekP06G-1.5-20-F
Plasma humain Fibronectine Protéine purifiéeMilliporeFC010-10MG
DPBSSigmaD8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 réactifInvitrogen11668019
OPTI MEM IInvitrogen31985088
Plasmide C2-Pro VCAddgene49261
Plasmide C2-Pro VNAddgene49262
BiFC de caspase inflammatoiredisponibles sur demande auprès des
cellules HeLa de LBH exprimant de manière stable les composantsdisponibles sur demande de LBH
DsPlasmide mito RedClontech632421Des plasmides similaires qui peuvent être utilisés comme rapporteurs fluorescents peuvent être trouvés sur Addgene
HEPESInvitrogen15630106
2 Mercaptoethanol 1000XInvitrogen21985023
q-VD-OPHApex BioA1901
Plasmides BiFC C2-Pro

Références

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