Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Summary

Ici, nous montrons le processus de création d’une ligne de poisson-zèbre de journaliste tension électrique cellulaire afin de visualiser le développement embryonnaire, mouvement, et des cellules de tumeur de poissons in vivo.

Abstract

Bioélectricité, signalisation électrique endogène véhiculée par les canaux ioniques et pompes situées sur la membrane cellulaire, joue un rôle important dans la signalisation des processus des cellules neuronales et musclés excitables et nombreux autres processus biologiques, tels qu’embryonnaire structuration du développement. Toutefois, il est nécessaire de in vivo , activité électrique suivi dans l’embryogenèse vertébré. Les avancées des indicateurs de tension fluorescents génétiquement encodé (GEVIs) ont permis d’apporter une solution à ce défi. Nous décrivons ici comment créer un zebrafish indicateur de tension transgéniques à l’aide de l’indicateur de tension établie, ASAP1 (accélération capteur de potentiels d’Action 1), à titre d’exemple. Le kit Tol2 et un promoteur omniprésent zebrafish, ubi, ont été choisis dans cette étude. Nous expliquons aussi les procédés de clonage à des fins spécifiques au site passerelle, transgenèse zebrafish axée sur le transposon Tol2 et le processus d’imagerie des tumeurs embryons et poisson poisson précoce, à l’aide de microscopes ordinaires épifluorescente. En utilisant cette ligne de poissons, nous avons constaté qu’il y a des variations de tension électrique cellulaire durant l’embryogenèse de poisson-zèbre et mouvement larves des poissons. En outre, il a été observé que dans les tumeurs de la gaine de nerf périphérique malin zebrafish quelques, la tumeur des cellules ont été généralement polarisées par rapport aux tissus normaux environnants.

Introduction

Bioélectricité se réfère à la signalisation électrique endogène véhiculée par les canaux ioniques et pompes situées sur la membrane de la cellule¹. Échanges ioniques à travers la membrane cellulaire et les changements actuels et potentiels électriques couplés, sont essentiels pour la signalisation des processus des cellules neuronales et musclés excitables. En outre, bioélectricité et gradients ioniques ont une variété d’autres fonctions biologiques importantes, y compris le stockage de l’énergie, la biosynthèse et transport de métabolite. Signalisation bioélectrique a également été découvert en tant que régulateur de la formation embryonnaire, tels que les axes du corps, le cycle cellulaire et la différenciation des cellules¹. Ainsi, il est essentiel pour la compréhension de nombreuses maladies et malformations congénitales humaines résultant de la mauvaise régulation de ce type de signalisation. Patch clamp d’a été largement utilisé pour l’enregistrement des cellules isolées, mais il est loin d’être idéal pour la surveillance simultanée de plusieurs cellules au cours du développement embryonnaire in vivo. En outre, sensibles petites molécules de tension ne sont également pas idéales pour des applications in vivo en raison de leurs spécificités et sensibilités des toxicités.

La création d’une variété de génétiquement encodé tension fluorescent indicateurs (GEVIs) propose un nouveau mécanisme pour régler ce problème et permet une application à l’étude du développement embryonnaire, même si elles étaient initialement destinées à surveillance neurale les cellules^2,3. D'entre les GEVIs actuellement disponibles est le capteur accélération de potentiels d’Action 1 (ASAP1)⁴. Il est composé d’une boucle extracellulaire d’un domaine de détection de tension de phosphatase sensibles de tension et une protéine fluorescente verte circulairement permutée. Par conséquent, ASAP1 permet la visualisation des changements de potentiel électrique cellulaires (polarisation : vert vif ; dépolarisation : vert foncé). ASAP1 a 2 ms et-marche cinétique et peut suivre une éventuelle variation⁴. Ainsi, cet outil génétique permet à un nouveau niveau d’efficacité en temps réel de surveillance bioélectriques dans des cellules vivantes. Mieux comprendre les rôles de la bioélectricité dans le développement embryonnaire et de nombreuses maladies humaines, comme le cancer, mettra en lumière nouvelle sur les mécanismes sous-jacents, ce qui est essentiel pour la prévention et le traitement de la maladie.

Poisson zèbre ont fait leurs preuves un puissant modèle animal pour étudier la biologie du développement et des maladies humaines, y compris le cancer^5,6. Ils partagent des gènes orthologues 70 % avec les humains, et ils ont biologie vertébrée similaire⁷. Poisson zèbre fournir relativement facile d’entretien, une grande couvée de œufs, tractable génétique, transgénèse facile et le développement embryonnaire externe transparent, qui en font un système supérieur pour in vivo d’imagerie^5,6. Avec une source importante de lignées de poisson mutant déjà présentes et un génome entièrement séquencé, zebrafish fournira une gamme relativement illimitée de la découverte scientifique.

Pour étudier l’in vivo en temps réel l’activité électrique des cellules, nous profitons du système de modèle de poisson-zèbre et ASAP1. Dans cet article, nous décrivons comment incorporer le biocapteur de tension fluorescent ASAP1 dans le génome de poisson-zèbre à l’aide de Tol2 transposon transgénèse et visualiser l’activité électrique cellulaire durant le développement embryonnaire, mouvement larves de poisson et dans la tumeur direct .

Protocol

Le poisson-zèbre sont logés dans une animalerie approuvé par AAALAC, et toutes les expériences ont été réalisées selon les protocoles approuvés par le Comité de l’emploi (PACUC) et de Purdue animalier.

1. Tol2 Transposon plasmide Construct préparation

Remarque : Tol2, un transposon qui a été découvert en poisson medaka, a été employé couramment dans le poisson-zèbre recherche communautaire^8,9. Il a été avec succès adoptée pour le système de passage spécifique axée sur la recombinaison clonage et connu comme le kit de Tol2¹⁰. Le kit Tol2 permet un moyen plus pratique de créer des constructions d’expression personnalisée, tout en augmentant l’efficacité de la transgenèse. Ainsi, il a été une décision facile à prendre avantage de ce système et créer une ligne de poisson-zèbre expression ASAP1 omniprésente en utilisant un promoteur validés ubiquitin à conduire ASAP1¹¹.

1. Création d’une construction centrale entrée ASAP1 : pDONR221-ASAP1
   1. Acquérir la construction du capteur ASAP1 tension génétiquement encodé, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmide #52519), de Addgene. Pour amplifier la région codante de ASAP1, mis en place un PCR avec des amorces personnalisés (attB1-ASAP1F et attB2-ASAP1R) flanqués de séquences attB à l’extrémité 5' des amorces (Figure 1). Phusion ADN polymérase a été choisi pour sa grande efficacité, et conditions de la PCR ont été optimisées basé sur le protocole publiées antérieurement¹².
   2. Charger les produits PCR 50 µL dans un 1 % TAE gel à l’aide d’une pipette ordinaire avec 200 conseils µL et effectuer l’électrophorèse à 160 V dans un réservoir horizontal de gel pendant environ 30 min.
   3. Vérifier le gel sous un Transilluminateur UV (353 nm), l’accise sur la bande désirée à l’aide de lame/scalpel sous un Transilluminateur UV comme précédemment publiés^13,14et mettre l’échantillon de gel contenant de l’ADN dans une microcentrifugeuse propre 1,5 mL tube.
   4. Accomplissent gel de purification pour les produits de PCR ASAP1. Récupérer l’ADN contenu dans le gel excisé en utilisant un kit de purification de gel ADN commercial suivant les instructions du fabricant et éluer l’ADN dans 20 µL d’eau. Prendre 1 µL comme un échantillon et mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Coulent les instructions du logiciel utilisant l’eau comme un contrôle à blanc¹⁵.
   5. Prenez 100 ng de purifié produit de PCR et mélangez-le avec 150 ng de plasmide pDONR221 dans 10 µL de TE mettre en mémoire tampon (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)¹⁶. Ajouter 2 µL de II Clonase BP dans la réaction et incuber la réaction à la température ambiante pendant la nuit.
   6. Le deuxième jour, ajouter 1 µL de protéinase K dans la réaction et incuber la réaction à 37 ° C pendant 30 min.
   7. Effectuer la transformation. La réaction de transfert et le mélanger avec 50 µL de Top10 compétentes d' e. coli cellules et incuber les cellules sur la glace pendant 30 min. Puis, transfert immédiatement, le tube de réaction dans un bain-marie à 42 ° C pendant 1 min. Retirez le tube et incuber sur glace pendant 2 min. Ensuite, mettre le tube dans un shaker de 37 ° C et il incuber pendant 1 heure.
   8. Retirez le tube et plaque les cellules sur une plaque de kanamycine LB. Ensuite, incuber la plaque du jour au lendemain (16-18 h) à 37 ° C.
   9. Prélever des colonies simples et bien séparées et les ensemencer des tubes de culture de cellules de 14 mL avec 3 mL de milieu LB. Leur culture pendant une nuit à 37 ° C dans un shaker avec une vitesse de rotation de 250 tr/min (rotation par minute).
   10. Effectuer miniprep utilisant un kit commercial miniprep après son instruction manuel¹⁷.
   11. Séquence 3-4 plasmides avec Sanger séquençage d’identifier positive pDONR221-ASAP1 clones en utilisant des amorces de séquençage de M13F et M13R.
2. Créer la construction Tol2 de microinjection : pDestTol2 -ubi-ASAP1
   1. Choisissez que le séquençage vérifiée mesure et pDONR221-ASAP1 clone sa concentration d’ADN utilisant un spectrophotomètre qui suit l’instruction de logiciels utilisant l’eau comme un blanc de contrôle¹⁵.
   2. Prendre 100 µg de pDONR221-ASAP1 et mélangez-le avec 100 µg de plasmide de Tol2 kit 5-fin (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg de p3E-polyA (Tol2 kit #302) et 150 µg de pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Ajuster le volume total à 8 µL tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) dans un microtubes de 1,5 mL tube et bien mélanger en un tourbillon brève de 2-5 s. Ensuite, ajouter 2 µL de LR Clonase II plus et incuber la réaction à la température ambiante pendant la nuit.
   3. Le deuxième jour, ajouter 1 µL de protéinase K dans la réaction à l’aide d’une pipette µL 10 et incuber la réaction à 37 ° C pendant 30 min.
   4. Exécuter la transformation et identifier les clones positifs tel que décrit ci-dessus (pas 1.1.7-11).
   5. Mesure la concentration d’ADN de séquençage vérifié pDestTol2-ubi-ASAP1 clone (Figure 1 b) à l’aide d’un spectrophotomètre à¹⁵. La concentration est généralement autour de 200ng/µL.

2. préparer Tol2 Transposase ARNm et Solution injectable

1. Strie e. coli glycérol stock du plasmide pCS2FA-transposase (Tol2 kit #396) sur un plat de livre (avec 100 ampicilline µg/mL) en utilisant une boucle de l’inoculation stérilisé. Incuber les plaques à 37 ° C dans un incubateur pendant la nuit. Le lendemain, prélever une colonie unique et ensemencer il dans 3 mL de LB (ampicilline 100 µg/mL) à l’aide d’une pointe de pipette 10 µL stérilisé. Culture du jour au lendemain à 37 ° C dans un shaker avec une vitesse de rotation de 250 tr/min.
2. Effectuer miniprep sur la culture d’e. coli en utilisant un kit commercial miniprep suivant le mode d’emploi. Éluer l’ADN de plasmide dans 30 à 50 µL de tampon TE en 1 minute centrifuger à 14 000 tr/min et mesurer la concentration d’ADN avec un spectrophotomètre.
3. Linéariser 1 à 2 µg de plasmide avec pas j’ai endonucléase et purifier l’ADN avec un ADN kit pas j’ai après son mode d’emploi de nettoyage digestion. Éluer l’ADN dans 5 µL d’eau par centrifugation à 14 000 tr/min pendant 1 minute. La concentration prévue est d’environ 200-300 ng/µL.
4. Effectuer en vitro transcription avec Not je linéarisé pCS2FA-transposase comme une matrice d’ADN à l’aide d’une trousse commerciale de transcription SP6.
5. Une fois la réaction terminée, purifier Tol2 transposase ADN messagère utilisant un nettoyage commercial de RNA kit suivant les instructions du fabricant. Enfin, éluer les ARNm dans l’eau sans ARNase 20 µL et mesurer la concentration d’ARN dans un spectrophotomètre. La concentration prévue est d’environ 1 à 3 µg / µL. les échantillons peuvent être stockés dans un congélateur à-80 ° C si nécessaire.
6. Préparer la solution de microinjection en mélangeant 20 ng/µL pDestTol2 -ubi-ASAP1 et Tol2 transposase ARNm (100 ng/µL) dans un tube de microcentrifuge de pipetage. Pour prévenir la dégradation de l’acide nucléique provoquée par le dégel répétés et de regel, aliquote de 6 µL par tube et le stocker dans un congélateur à-80 ° C pour une utilisation future.

3. microinjection

1. Mettre en place les 4-6 réservoirs d’élevage au moins 2 mâles et 2 femelles l’après-midi avant l’injection. Ces poissons ne doivent pas être nourris dans l’après-midi. Cette étape va réduire la quantité de déchets de poisson et gagnez du temps à les nettoyer le lendemain matin, tout en aidant à induire une réponse de la reproduction.
2. Le lendemain matin, enlever la solution injection préparés (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construct et Tol2 mRNA) du congélateur à-80 ° C et placez-le sur la glace.
3. Tirez les séparateurs dans les réservoirs de pisciculture et laisser le poisson s’accoupler. En général, poissons pondent dans 20 à 30 minutes après avoir tiré sur le diviseur. Si non, attendre 1 à 2 heures de plus. Certains poissons ne peuvent pas du tout pondent des œufs. Dans ce cas, répéter cette expérience de collecte d’embryons de poissons.
4. En attendant, assurez-vous qu’il y a des aiguilles préparés avec le bout cassé à un angle créant un bord biseauté avec une pince ou en cassant sur un essuie-glace de tâche délicate.
   1. Tirer des aiguilles de verre capillaire sur un micropipettes utilisant les paramètres suivants : chauffer 545 ; tirer 60 ; Vitesse 80 ; temps 250 ; pression 500. Casser l’aiguille avec une pince sous une étendue de dissection (avec oculaire règle pour l’estimation de diamètre) en tenant la pince sous l’angle environ 45 °. Diamètre désiré de l’aiguille peut être variable selon les paramètres de microinjector, mais plus petit diamètre est préférable pour diminuer la mortalité des embryons.
5. Une fois que les poissons ont pondu, les recueillir dans un diamètre de 10 cm boîte de Pétri et apportez-les à l’étendue de la dissection. Supprimer tous les embryons anormaux et des déchets de poissons.
6. Pipette les embryons fécondés dans le prêt d’agarose à 3 % d’injection moule. Enlever l’excès d’eau pour aider à garder les embryons en place.
7. Une fois que toutes les lignes sont remplis d’embryons viables, organisez-les afin que les cellules individuelles toutes face à la même direction vers l’aiguille, qui est un angle de 45° horizontalement. Cela facilitera injection beaucoup plus tard.
8. Avec des gants, utiliser une pipette de 20 chargement µL Astuce et retirer 5 µL de la construction prête du tube sur la glace.
9. Insérez soigneusement la pointe à l’extrémité arrière du tube capillaire rompu complètement vers où il commence à tapper, pour obtenir le réactif que près de la pointe. S’il y a toujours des bulles d’air, secouez l’aiguille, en veillant à ne pas casser la pointe.
10. Insérez l’aiguille vers le porte-aiguille de microinjection et serrer avec précaution jusqu'à ce que l’aiguille reste en place. Ajuster l’angle à 45° environ.
11. Une fois que l’aiguille est préparé et attaché, allumez le réservoir sous pression de microscope et de gaz. Commercial CO₂ réservoirs sont généralement bonnes à cet effet. Le volume d’injection est réglé par la pression d’exploitation et d’éjection : environ 0,5 lb/po2 pour tenue et 30 lb/po2 pour l’éjection. N’oubliez pas de vérifier que la solution sort lorsque vous appuyez sur la pédale.
12. À l’aide d’un micromètre avec une goutte d’huile minérale, régler le volume et l’écoulement de la solution à ~ 150 µm de diamètre (environ 2 nL). Veiller à ce que la contre-pression permettra une petite quantité de s’écouler hors de l’aiguille. S’il n’y a pas assez de contre-pression, capillarité provoquera liquide entrer dans l’aiguille et détruire l’ARNm.
13. Une fois que l’aiguille est calibré, commencent à injecter la construction dans la cellule unique des embryons fécondés.
    Remarque : Cela prend une grande quantité de pratique, de patience et finesse, en raison de la membrane cellulaire étant difficiles à percer. Il est important d’injecter la solution dans la cellule, pas le jaune, pour générer des poissons zèbres transgéniques. Ceci est différent de l’injection morpholino. Il n’importe pas quel côté l’aiguille pénètre dans la cellule en tant que la construction se passe dans la cellule. La transgénèse aura un très faible taux de réussite s’il est injecté dans le jaune au lieu de la cellule. Injection de stade unicellulaire est aussi importante, ou poisson chimère somatique sera créé. Cela réduira les chances du transgène va dans les cellules germinales.
14. Le bord de l’entaille de gel permet de fournir un support qui maintient l’embryon en place et permet à l’aiguille de pression sans bouger l’embryon. Une fois que la pointe de l’aiguille est dans la même cellule, appuyer sur la pédale pour libérer la quantité désirée de solution. Répétez ce processus pour tous les embryons.
15. Une fois terminé, transférer les embryons injectés dans une boite marquée en les rinçant hors de l’encoche d’agarose avec l’eau du système de poissons et une pipette de transfert jetable 3,4 mL. Stocker les embryons dans un incubateur à 28,5 ° C pour les laisser se développer. Vérifiez retour toute la journée retirer les embryons de poissons morts et remplacez l’eau par 0,1 % de bleu de méthylène dans l’eau du poisson.
16. Environ 6-8 heures après l’injection, prenez 10 personne injecté des embryons de poisson et préparer l’ADN génomique d’eux à l’aide de la méthode de Hotshot¹⁸.
17. Le lendemain matin, utiliser un microscope à dissection avec une source de lumière de fluorescence à trier les embryons montrant GFP dans les tissus non-jaune d’oeuf. Ces embryons de poisson doivent contenir la construction injectée.
18. Effectuer le test d’accise Tol2 pour vérifier l’activité de transposon comme décrit plus haut¹⁹. Si le plasmide excisée peut être détecté, garder l’injection des embryons de poissons et de les élever. Si aucun plasmide excisée ne peut être détecté, répétez le processus de synthèse et de microinjection Tol2 ARNm jusqu'à obtenir les résultats positifs du test de l’accise Tol2.

4. établir des poissons transgéniques ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)

1. Soulever le poisson injecté (génération de₀ F) à l’âge adulte comme décrit précédemment dans le livre de poisson-zèbre²⁰. Cela prend habituellement environ 4 mois.
2. Prenez un seul adulte F₀ poissons et traversez-la en un seul en face de poisson de type sauvage de sexe. Recueillir des embryons de poisson après reproduction plus tard dans la journée. Garder les embryons de poissons recueillis dans l’incubateur de 28,5 ° C chez les poissons de l’eau avec 0,1 % de bleu de méthylène.
3. Le troisième jour, vérifier les embryons de poissons sous un microscope à dissection fluorescent avec un filtre GFP. Trier les embryons de poisson vert, s’il y en a et de les élever jusqu'à l’âge adulte comme F₁ génération les poissons transgéniques, Tg (ubi: ASAP1).
   NOTE : Mendélienne ratio ne devrait pas puisque la plupart des poissons₀ F parentales sont des chimères génétiques germinales.
4. Traverser les poissons adultes isolés F₁ avec les poissons de type sauvage et collecter des embryons de poisson. Trier les embryons de poisson vert et les élever jusqu'à l’âge adulte comme poisson de génération₂ F.
   Remarque : Vert et des embryons de poisson non écologiques devraient être proche de 1:1 s’il y a un transgène unique.
5. Pour afficher les changements de potentiel électrique dans la tumeur comme des tumeurs malignes de nerf périphérique gaine (MPNST), traverser la génération de₂ F Tg (ubi: ASAP1) poisson poisson rpl35^hi258/wt . On sait que les tumeurs visibles commencent à être trouvé dans les 6-8 mois vieux adultes^21,22.

5. imagerie

1. Image des embryons de poisson-zèbre, prendre plusieurs fondateur de génération₂ F poisson et croiser avec des poissons de type sauvage en paires individuelles. Recueillir des embryons de poissons à différents stades de développement désirés selon le poisson-zèbre, mise en scène de guide²³.
2. Pour les premiers stades des embryons de poisson, peler et retirer les chorions des embryons soigneusement à l’aide d’une paire de pinces sous une étendue de dissection dans un diamètre de 10 cm boîte de Pétri avec de l’eau système de poissons.
3. Transférer quelques embryons de poisson sur une lame de verre concave avec 3 % de méthylcellulose à l’aide d’une pipette de transfert jetable 3,4 mL. Ajuster les embryons pour les positions souhaitées pour afficher l’activité cellulaire de la GFP en utilisant une aiguille sous une étendue de dissection fluorescent.
4. Pour les stades mobiles des embryons de poisson (plus de 12 somite étape), utilisez mésylate de tricaïne 0.05 % pour anesthésier les embryons de poissons avant de les transférer aux diapositives. Brièvement, les embryons de poisson ont été a émergé dans mésylate de tricaïne 0.05 % dans l’eau du poisson jusqu'à ce qu’ils ont arrêté la natation et la balance du corps perte. En outre, ajouter une goutte de mésylate de tricaïne 0.05 % avec la méthylcellulose sur la diapositive.
5. Pour les moins de 12 embryons poissons au stade somite, utiliser un microscope composé d’épifluorescente avec un appareil photo compatible et un logiciel d’imagerie. Pour plus de 12 embryons de poissons étape somite, utiliser un microscope à fluorescence dissection.
6. À l’image de tension de la cellule tumorale, d’abord identifier les poissons atteints de tumeurs MPNST. Puis, anesthésier les poissons avec mésylate de tricaïne 0,05 %. Pour l’imagerie support entier, mettre le poisson dans un diamètre de 10 cm boîte de Pétri. Pour visualiser l’activité électrique de cellules de tumeur, tumeurs de poissons peuvent être disséqués dehors après l’imagerie support entier.

Results

En une injection réussie, plus que des embryons de poisson 50 % injecté affiche une certaine fluorescence verte dans les cellules somatiques et la plupart d'entre eux seront positif par le test de Tol2 transposon d’accise (Figure 2). Après que 2 à 4 générations de out-croix avec poissons de type sauvage (jusqu'à ce que le poisson fluorescent atteint 50 %, le ratio mendéliens prévues), les poissons transgéniques ont été utilisés pour l’expérimentation d’imager...

Discussion

Bien que les activités électriques niveau cellulaire et tissulaire au cours du développement embryonnaire et la maladie humaine ont été découverts il y a longtemps, en vivo électrique changements dynamiques et leurs rôles biologiques restent encore largement inconnus. Un des défis majeurs est de visualiser et de quantifier les variations électriques. Patch clamp technique est une brèche pour le suivi des cellules isolées, mais son application à des embryons de vertébrés est limitée car ils sont composés de plusi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes de culture cellulaire de 14 ml	VWR	60818-725	Culture E.Coli
Réservoir d’électrophorèse d’agarose Thermo	Scientific	Owl B2	Élétrophorèse de l’ADN
Agarose RA	Amresco	N605-500G	Pour la fabrication des gels d’injection
Attb1-ASAP1-F amorce	IDT ADN	GGGGACAAGTTTGTACAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	Amplification de la région codante ASAP1 pour le sous-clonage
Attb2-ASAP1-R amorce	IDT ADN	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTCTGTGAAGCCA	ASAP1 Amplification de la région codante pour le sous-clonage
Lunette de dissection en fond clair	Nikon	SMZ 745	Déchorionation, microinjection, montage
Caméra couleur	Zeiss	AxioCam MRc	Embryon de poisson Enregistrement d’images
Lame concave	VWR	48336-001	Pour maintenir les embryons de poissons pendant le processus d’imagerie
Pipette de transfert jetable 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	Embryons de poissons et transfert d’eau
Enzyme endonucléase, Not I	NEB	R0189L	Pour la linéarisation de l’ADN plasmidique
Portée composée épifuorescente	Zeiss	Axio Imager.A2	Poisson Imagerie embryonnaire
Oscilloscope de dissection stéréo épifuorescente	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Imagerie d’embryons
de poisson Source de lumière	fluorescente Dynamique	X-cite seris 120	Source lumineuse pour microscopes à fluorescence
Forceps #5	WPI	500342	Déchorionnation et rupture d’aiguille
Gateway BP Clonase II Mélange d’enzymes	Thermo Scientific	11789020	Gateway BP recombinaison clonage
Gateway LR Clonase II Plus enzyme	Thermo Scientific	12538120	Gateway LR clonage par recombinaison
Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002	Purification de gel d’ADN
Eppendorf	930001007	Pour le chargement de la solution d’injection dans les aiguilles capilaires
Méthylcellulose (1600cPs)	Alfa Aesar	43146	Montage d’embryons de poissons
Bleu de méthylène	Sigma-Aldrich	M9140	Supprime les épidémies fongiques dans les boîtes de Pétri
Moule de micro-injection	Outils de science adaptative	TU-1	Pour préparer un plateau de moule d’agaorse pour contenir les embryons de poisson pendant l’injection
Micro-injecteur	WPI	Picopompe pneumatique PV820	Injecteur de micro-injection
Micro-manipulateur	WPI	Micro-injecteur MM3301R	Opération de micro-injection
Extracteur de micropipette	Instrument Sutter	P-1000	Pour la préparation de l’aiguille
Huile minérale	Amresco	J217-500ml	Pour l’étalonnage du volume d’injection
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcription	Thermo Scientific	AM1340	Transcription in vitro de l’ARNm
Caméra monocolore	Zeiss	AxioCam MRm	Enregistrement d’images d’embryons de poisson
Plasmide Miniprep Kit	Zymo Research	D4020	Préparer une petite quantité d’ADN plasmidique
Boîtes de Pétri en plastique	VWR	25384-088	Pour tenir des poissons ou des embryons de poisson pendant le processus d’imagerie
ARN Propre & Concentrateur-5	Zymo Research	R1015	Nettoyage de l’ARNm après transcription in vitro
Spectrophotomètre	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Pour la mesure des concentrations d’ADN et d’ARN
Micromètre d’étape	Am Scope	MR100	Étalonnage du volume de micro-injection
Thermocycleur	Bio-Rad	T100	Amplification de l’ADN pour le clonage de gènes
Paroi mince capillaires en verre	WPI	TW100F-4	Verre brut pour la fabrication de l’aiguille cappilaire
Amorce Tol2-exL1	IDT DNA	GCACAACACCAGAAATGCCCTC	Essai d’accise Tol2
Amorce Tol2-exR	Amorce IDT ADN	ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG	Essai d’accise Tol2
TOP10 E. coli chimiquement compétent	Thermo Scientific	C404006	Utilisé pour la transformation lors du clonage de gènes
Mésylate de tricaïne	Sigma-Aldrich	A5040	Pour anesthésier des poissons ou des embryons de poissons
Trans-illuminateur UV 302nm	UVP	M-20V	Visualisation de l’ADN
	Bain-marie Thermo Scientific	2853	Pour le processus de transformation du clonage de gènes