Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Summary

Ici, nous montrons le processus de création d’une ligne de poisson-zèbre de journaliste tension électrique cellulaire afin de visualiser le développement embryonnaire, mouvement, et des cellules de tumeur de poissons in vivo.

Abstract

Bioélectricité, signalisation électrique endogène véhiculée par les canaux ioniques et pompes situées sur la membrane cellulaire, joue un rôle important dans la signalisation des processus des cellules neuronales et musclés excitables et nombreux autres processus biologiques, tels qu’embryonnaire structuration du développement. Toutefois, il est nécessaire de in vivo , activité électrique suivi dans l’embryogenèse vertébré. Les avancées des indicateurs de tension fluorescents génétiquement encodé (GEVIs) ont permis d’apporter une solution à ce défi. Nous décrivons ici comment créer un zebrafish indicateur de tension transgéniques à l’aide de l’indicateur de tension établie, ASAP1 (accélération capteur de potentiels d’Action 1), à titre d’exemple. Le kit Tol2 et un promoteur omniprésent zebrafish, ubi, ont été choisis dans cette étude. Nous expliquons aussi les procédés de clonage à des fins spécifiques au site passerelle, transgenèse zebrafish axée sur le transposon Tol2 et le processus d’imagerie des tumeurs embryons et poisson poisson précoce, à l’aide de microscopes ordinaires épifluorescente. En utilisant cette ligne de poissons, nous avons constaté qu’il y a des variations de tension électrique cellulaire durant l’embryogenèse de poisson-zèbre et mouvement larves des poissons. En outre, il a été observé que dans les tumeurs de la gaine de nerf périphérique malin zebrafish quelques, la tumeur des cellules ont été généralement polarisées par rapport aux tissus normaux environnants.

Introduction

Bioélectricité se réfère à la signalisation électrique endogène véhiculée par les canaux ioniques et pompes situées sur la membrane de la cellule¹. Échanges ioniques à travers la membrane cellulaire et les changements actuels et potentiels électriques couplés, sont essentiels pour la signalisation des processus des cellules neuronales et musclés excitables. En outre, bioélectricité et gradients ioniques ont une variété d’autres fonctions biologiques importantes, y compris le stockage de l’énergie, la biosynthèse et transport de métabolite. Signalisation bioélectrique a également été découvert en tant que régulateur de la formation embryonnaire,....

Protocol

Le poisson-zèbre sont logés dans une animalerie approuvé par AAALAC, et toutes les expériences ont été réalisées selon les protocoles approuvés par le Comité de l’emploi (PACUC) et de Purdue animalier.

1. Tol2 Transposon plasmide Construct préparation

Remarque : Tol2, un transposon qui a été découvert en poisson medaka, a été employé couramment dans le poisson-zèbre recherche communautaire^8,9. Il a été avec succès adoptée pour le système de passage spécifique axée sur la recombinaison clonage et connu comme le kit de Tol2¹⁰. Le kit T....

Results

En une injection réussie, plus que des embryons de poisson 50 % injecté affiche une certaine fluorescence verte dans les cellules somatiques et la plupart d'entre eux seront positif par le test de Tol2 transposon d’accise (Figure 2). Après que 2 à 4 générations de out-croix avec poissons de type sauvage (jusqu'à ce que le poisson fluorescent atteint 50 %, le ratio mendéliens prévues), les poissons transgéniques ont été utilisés pour l’expérimentation d’imager.......

Discussion

Bien que les activités électriques niveau cellulaire et tissulaire au cours du développement embryonnaire et la maladie humaine ont été découverts il y a longtemps, en vivo électrique changements dynamiques et leurs rôles biologiques restent encore largement inconnus. Un des défis majeurs est de visualiser et de quantifier les variations électriques. Patch clamp technique est une brèche pour le suivi des cellules isolées, mais son application à des embryons de vertébrés est limitée car ils sont composés de plusi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes de culture cellulaire de 14 ml	VWR	60818-725	Culture E.Coli
Réservoir d’électrophorèse d’agarose Thermo	Scientific	Owl B2	Élétrophorèse de l’ADN
Agarose RA	Amresco	N605-500G	Pour la fabrication des gels d’injection
Attb1-ASAP1-F amorce	IDT ADN	GGGGACAAGTTTGTACAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	Amplification de la région codante ASAP1 pour le sous-clonage
Attb2-ASAP1-R amorce	IDT ADN	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTCTGTGAAGCCA	ASAP1 Amplification de la région codante pour le sous-clonage
Lunette de dissection en fond clair	Nikon	SMZ 745	Déchorionation, microinjection, montage
Caméra couleur	Zeiss	AxioCam MRc	Embryon de poisson Enregistrement d’images
Lame concave	VWR	48336-001	Pour maintenir les embryons de poissons pendant le processus d’imagerie
Pipette de transfert jetable 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	Embryons de poissons et transfert d’eau
Enzyme endonucléase, Not I	NEB	R0189L	Pour la linéarisation de l’ADN plasmidique
Portée composée épifuorescente	Zeiss	Axio Imager.A2	Poisson Imagerie embryonnaire
Oscilloscope de dissection stéréo épifuorescente	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Imagerie d’embryons
de poisson Source de lumière	fluorescente Dynamique	X-cite seris 120	Source lumineuse pour microscopes à fluorescence
Forceps #5	WPI	500342	Déchorionnation et rupture d’aiguille
Gateway BP Clonase II Mélange d’enzymes	Thermo Scientific	11789020	Gateway BP recombinaison clonage
Gateway LR Clonase II Plus enzyme	Thermo Scientific	12538120	Gateway LR clonage par recombinaison
Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002	Purification de gel d’ADN
Eppendorf	930001007	Pour le chargement de la solution d’injection dans les aiguilles capilaires
Méthylcellulose (1600cPs)	Alfa Aesar	43146	Montage d’embryons de poissons
Bleu de méthylène	Sigma-Aldrich	M9140	Supprime les épidémies fongiques dans les boîtes de Pétri
Moule de micro-injection	Outils de science adaptative	TU-1	Pour préparer un plateau de moule d’agaorse pour contenir les embryons de poisson pendant l’injection
Micro-injecteur	WPI	Picopompe pneumatique PV820	Injecteur de micro-injection
Micro-manipulateur	WPI	Micro-injecteur MM3301R	Opération de micro-injection
Extracteur de micropipette	Instrument Sutter	P-1000	Pour la préparation de l’aiguille
Huile minérale	Amresco	J217-500ml	Pour l’étalonnage du volume d’injection
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcription	Thermo Scientific	AM1340	Transcription in vitro de l’ARNm
Caméra monocolore	Zeiss	AxioCam MRm	Enregistrement d’images d’embryons de poisson
Plasmide Miniprep Kit	Zymo Research	D4020	Préparer une petite quantité d’ADN plasmidique
Boîtes de Pétri en plastique	VWR	25384-088	Pour tenir des poissons ou des embryons de poisson pendant le processus d’imagerie
ARN Propre & Concentrateur-5	Zymo Research	R1015	Nettoyage de l’ARNm après transcription in vitro
Spectrophotomètre	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Pour la mesure des concentrations d’ADN et d’ARN
Micromètre d’étape	Am Scope	MR100	Étalonnage du volume de micro-injection
Thermocycleur	Bio-Rad	T100	Amplification de l’ADN pour le clonage de gènes
Paroi mince capillaires en verre	WPI	TW100F-4	Verre brut pour la fabrication de l’aiguille cappilaire
Amorce Tol2-exL1	IDT DNA	GCACAACACCAGAAATGCCCTC	Essai d’accise Tol2
Amorce Tol2-exR	Amorce IDT ADN	ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG	Essai d’accise Tol2
TOP10 E. coli chimiquement compétent	Thermo Scientific	C404006	Utilisé pour la transformation lors du clonage de gènes
Mésylate de tricaïne	Sigma-Aldrich	A5040	Pour anesthésier des poissons ou des embryons de poissons
Trans-illuminateur UV 302nm	UVP	M-20V	Visualisation de l’ADN
	Bain-marie Thermo Scientific	2853	Pour le processus de transformation du clonage de gènes