Article de méthode

Quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la Distribution des lipides du Nil rouge et huile rouge O coloration de Caenorhabditis elegans

DOI :

10.3791/57352

⸱

5 mars 2018

 ,  ,  , 
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California, 2Molecular & Computational Biology Section, University of Southern California, 3Integrative Program for Biological & Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nil rouge coloration fixe Caenorhabditis elegans est une méthode pour la mesure quantitative des dépôts de lipides neutres, alors que l’huile rouge O coloration facilite l’évaluation qualitative de la répartition des lipides entre les tissus.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle exceptionnel permettant d’étudier le métabolisme des lipides et l’homéostasie énergétique. Beaucoup de ses gènes de lipides sont conservés chez les humains et sont associées à un syndrome métabolique ou d’autres maladies. Examen de l’accumulation de lipides dans cet organisme peut être effectué par colorants fixateur ou méthodes exempte d’étiquette. Taches de fixateur comme Nil rouge et huile O rouge sont des moyens peu coûteux et fiables de mesurer quantitativement le taux de lipides et de qualitativement observer distribution des lipides dans les tissus, respectivement. De plus, ces taches permettent de criblage à haut débit des diverses voies et les gènes du métabolisme lipidique. En outre, leur caractère hydrophobe facilite la liposolubilité, réduit l’interaction avec les tissus environnants et empêche la dissociation dans le solvant. Bien que ces méthodes sont efficaces pour examiner le contenu en lipides générales, ils ne fournissent pas d’informations détaillées sur la composition chimique et la diversité des dépôts lipidiques. Pour ces fins, exempte d’étiquette des méthodes telles que la microscopie GC-MS et les voitures sont mieux adapté, leurs coûts par dérogation.

Introduction

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Les lipides sont essentiels à la vie. Ils font partie intégrante des membranes, agissent comme des messagers secondaires et transducteurs de signal et ont des fonctions cruciales dans le stockage de l’énergie. Lorsque le métabolisme des lipides est dysrégulation, elle conduit à des maladies comme l’obésité et le diabète de type II, qui sont en appuyant sur les préoccupations de santé publique9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme excellent modèle pour l’étude du métabolisme lipidique, parce qu’il a un cycle de vie relativement court, un corps transparent, une lignée de cellules connues et un génome entièrement séquencé. Principalement un hermaphrodite, c. elegans permet aux chercheurs de soulever un grand nombre d’animaux isogéniques bref une période à haut débit effectuer avancer écrans génétiques pour étudier un large éventail de gènes et les voies métaboliques4. Cette approche a révélé un haut degré de conservation en 273 gènes du métabolisme lipidique de c. elegans parmi les humains, les souris, les rats et les drosophiles. En outre, plus de 300 gènes de lipides chez c. elegans ont des orthologues humains qui sont associés à des maladies non liées au syndrome métabolique,11. Traditionnellement, examen de stockage lipidique chez c. elegans a principalement invoqué essais marqués au colorant, qui fournissent des renseignements solides sur l’accumulation de lipides. Moins fréquent est une description de localiser où les lipides et les différences mesurées en abondance de lipides dans les tissus. Cependant, des travaux récents ont révélé que distribution des lipides peut être aussi importante que l’accumulation de lipides6.

Dernièrement, des études ont commencé à intégrer des méthodes telles que haute performance liquid chromatography-spectrométrie de masse (HPLC-MS), chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), et cohérente anti-stokes la microscopie Raman diffusion (voitures) à l’adresse du lacunes des approches axées sur la tache en analysant directement le contenu des extraits lipidiques, fractions lipidiques spécifiques et les dépôts de lipides, respectivement10,11. En outre, la microscopie de voitures a révélé que rouge Nil seulement peut servir de proxy pour une accumulation de graisse lorsqu’il est utilisé comme teinture fixateur, pour son utilisation comme un colorant vital conduit à hors-cible la coloration des organites auto-fluorescent10. Toutefois, les compétences techniques requises et les coûts associés à ces chromatographie et méthodes de microscopie font leur utilisation intenable pour plusieurs questions de recherche. Dans cet article, nous discutons une méthode pratique et fiable pour fixer et tacher les dépôts de lipides neutres à l’aide du Nil rouge de c. elegans et huile rouge O pour distinguer l’abondance de lipides chez l’animal entier et dans des tissus spécifiques.

Rouge de Nil, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, est un colorant benzophenoxazone facilement, se dissout dans les solvants organiques divers, mais est le plus souvent insoluble dans l’eau. C’est un excellent lysochrome colorant utilisé pour colorer les lipides neutres tels les triglycérides ou des esters de cholestérol parce qu’il dispose d’une couleur forte, solubilise bien dans les lipides, a interaction négligeable avec les tissus environnants et est moins solubles dans le solvant que dans lipides. Il a un maximum d’excitation et d’émission de 450-500 et 520 nm, respectivement1. Nil colorées au rouge c. elegans est vu pour la fluorescence verte, corps lipidiques discrètes peuvent être observés tout au long de l’intestin et d’autres tissus soit en grappes ou réparties, selon le génotype de l’animal ou de traitement expérimental 7.

L’huile rouge O est un lysochrome, un colorant soluble dans la graisse utilisée pour colorer les triglycérides et lipoprotéines. On l’appelle un colorant azoïque parce que sa structure chimique contient deux groupes azoïques attachés à trois noyaux aromatiques. Il est difficile de s’ioniser, qui le rend très soluble dans les lipides. Sa tache de couleur est rouge et son absorption maximale de la lumière est 518 nm 3. C. elegans colorées avec de l’huile rouge O montrent des gouttelettes de lipides rouge qui se démarquent contre corps transparent de l’animal, ce qui facilite l’évaluation qualitative de la distribution des lipides chez les différents tissus6.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nil rouge (NR) coloration des lipides

  1. Préparation de la solution mère de 5 mg/mL, NR
    1. Dans une bouteille de 500 mL, ajouter 100 mg de poudre de NR à 200 mL d’acétone 100 %.
    2. Couvrir la bouteille avec du papier aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.
    3. Avant utilisation, agiter la solution pendant 2 h dans l’obscurité.
    4. Pour utilisation à long terme, conserver la solution mère NR dans un flacon hermétique sans toute exposition à la lumière. Solution mère NR selon les besoins de recherche à l’échelle. Veiller à ce que la même solution est utilisée à travers des expériences de coloration NR pour obtenir la coloration uniforme et les résultats d’imagerie.
  2. Préparation de la solution de travail NR
    1. Pour chaque 1 mL d’isopropanol 40 % (v/v), ajouter 6 µL de la solution mère de NR.
    2. Préparez 600 µL de solution de travail NR pour chaque échantillon.
      Remarque : Assurez-vous de frais NR droit de solution de travail avant la coloration. Selon les besoins de solution mère de NR, utiliser un 15 mL ou tube à fond conique jaugée de 50 mL.
  3. Préparation vers pour la coloration des lipides NR
    1. Poussent au stade précoce de L4 à 20 ° C sur un milieu de croissance nématode (NGM) ensemencée avec fin-log OP50 e. coli.
    2. Laver les vers la plaque avec 1 mL de 1 x 0,01 % Triton X-100 (PBST) solution de tampon phosphate salin + et mettre la suspension ver dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    3. Centrifuger que les vers à 560 x g pendant 1 min. Retirer le surnageant et répétez cette étape jusqu'à ce qu’e. coli est effacée de suspension.
    4. Ajouter 100 µL d’isopropanol 40 % dans le culot de ver et il incuber à température ambiante pendant 3 min.
    5. Centrifuger les vers à 560 x g pendant 1 min et retirer le surnageant sans déranger le culot de ver.
      NOTE : Utilisation des volumes importants de PBST pour laver les vers les plaques si à l’aide de plaques plus grandes ou plus de parasites par plaque de coloration. Ne pas laver les vers dans le PBST de plus de 15 min avant la fixation de l’échantillon. Effectuer de nouveaux lavages si le liquide surnageant ne s’efface pas de bactéries. Réaliser l’incubation dans l’isopropanol 40 % à l’aide d’un nutator ou bascule. Toujours surveiller les tubes pour s’assurer que l’agitation de l’échantillon complet se produit.
  4. Lipides de coloration avec NR
    1. Dans l’obscurité, ajoute 600 µL de solution de travail NR de chaque échantillon. Inverser les tubes trois fois et mélanger complètement les vers dans la solution NR.
    2. Faire tourner l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 h.
    3. Après l’incubation, centrifuger les vers à 560 x g pendant 1 min et retirer le surnageant.
    4. Ajouter 600 µL de PBST et incuber les échantillons dans l’obscurité pendant 30 min enlever excès NR tache.
    5. Centrifuger les échantillons à 560 x g pendant 1 min et retirer tout sauf environ 50 µL de liquide surnageant.
      Remarque : L’incubation NR ne requiert pas d’agitation. Décantation de worms est fréquente au cours de cette étape.
  5. Préparation des lames pour l’imagerie de microscope
    1. Resuspendre le culot de ver en restant surnageant.
    2. Déposer 5 µL de suspension de ver sur une lame de microscope et mettre une lamelle soigneusement à ne pas emprisonner de bulles d’air.
    3. Scellez la lamelle avec vernis à ongles avant vers l’imagerie.
    4. Préparez que quelques diapositives à la fois. Ceci assurera que l’imagerie NR reste constante dans les trois échantillons. La qualité des images colorés NR diminue après des gouttelettes de lipides discrète 6 h. sont difficiles à observer et augmente la fluorescence de fond, qui interfère avec la détection du signal NR.
  6. Imagerie vers colorés NR
    1. Les vers grossissement 5 X pour capturer plusieurs animaux par champ de vision de l’image.
    2. Passer à un grossissement de 10 X pour mieux quantifier les worms individuels.
    3. Canal FITC/GFP permet d’image vers colorés NR et essayer le temps d’exposition différents afin de déterminer les conditions optimales pour la quantification.
    4. Enregistrer les fichiers en format TIF pour éviter toute perte de données due à la compression.
      NOTE : Exposition typique fois varient de Mme 100-1000 ayant un temps de pose optimale, utilisez-le pour tous les échantillons pour maintenir la cohérence d’imagerie.
  7. Quantification d’image coloration NR
    1. Télécharger les micrographies sur ImageJ. Dans le menu déroulant Plugins, utilisez la fonction de Bio-Formats si le fichier image n’est pas reconnu.
    2. Dans le menu déroulant Image, la fonction Stacks, utilisez des Images-de-pile pour créer une pile d’image lorsqu’on compare les micrographies plusieurs.
    3. Dans le même menu déroulant, régler la luminosité/contraste de la pile de l’image et propager les modifications à toutes les images en cliquant sur Apply.
    4. Utiliser l’outil de sélection polygone pour délimiter chaque ver imagé et utiliser la fonction de mesure sous le menu déroulant de l’analyse pour quantifier l’intensité de la fluorescence émise par NR.
    5. Pour chaque image, mesurer cinq emplacements de fond et calculer l’intensité de fluorescence de fond moyenne.
    6. Soustraire l’intensité de fluorescence de fond de chaque ver imagé à l’aide de la formule N = G - (A x B), où N représente la fluorescence nette, G pour fluorescence brut, A pour superficie totale ver et B pour la fluorescence de fond moyenne.
    7. Pour normaliser l’intensité de la fluorescence de la taille de la vis sans fin, diviser la fluorescence nette de chaque ver par sa superficie. Les résultats sont signalés comme l’intensité de la fluorescence, en unités arbitraires (UA), par pixel.
      Remarque : Évitez d’exportation des images au format JPEG. Alors que la compression rend les fichiers plus facile à gérer pour stocker, l’intégrité des données est compromise par ce format. S’assurer que toutes les images sont modifiées et analysées de manière identique. N’oubliez pas d’inclure une échelle graphique pour évaluer correctement la taille à différents grossissements. Pour mieux visualiser les différences dans l’intensité de la fluorescence à l’aide de ImageJ, changer le type d’image RVB 8 bits et sélectionnez Fire dans le menu image lookup tables (LUT). Cela crée une image de carte thermique chez quelle couleur accrue luminosité est corrélée avec l’intensité de la fluorescence accrue.

2. huile rouge O coloration (ORO) des lipides

  1. Préparation de la solution mère de ORO
    1. Dans un flacon de 250 mL, ajouter 500 mg de poudre de ORO à 100 mL d’isopropanol 100 % et mélanger bien.
    2. Une fois préparée, conserver la solution hermétiquement fermée avec aucune exposition à la lumière.
  2. Préparation de la solution de travail ORO
    1. Diluer la solution mère de ORO dans l’eau (3:2) à 60 % isopropanol.
    2. Avant utilisation, filtrer la solution d’ORO à travers un filtre de seringue stérile d’acétate de cellulose 0,2 µm.
      Remarque : Pour une qualité de solution optimale, préparer ORO solution la veille et laissez-le mélanger du jour au lendemain. Toutefois, si la solution est nécessaire même jour, diluer et mélanger ORO solution sur un balancier pendant au moins 2 h avant utilisation. Avant bascule, enrouler le tube conique en ruban de paraffine pour éviter toute fuite de solution d’ORO.
  3. Préparation vers pour la coloration des lipides ORO
    1. Cultiver les vers à 20 ° C sur un milieu de croissance nématode (NGM) ensemencé avec fin-log OP50 e. coli à l’étape de vie souhaité.
    2. Ajouter 1 mL de solution PBST à la plaque et agiter jusqu'à ce que tous les vers sont la plaque. Inclinaison de la plaque et le laver avec 1 mL de PBST. Transférer la suspension ver dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    3. Centrifuger que les vers à 560 x g pendant 1 min. Retirer le surnageant sans déranger le culot et répéter l’étape de la laver avec 1 mL de PBST trois fois. Supprimer tous les µL surnageant mais 100.
    4. Ajouter 600 µL d’isopropanol 40 % dans le culot de ver et bougez-le à température ambiante pendant 3 min.
    5. Centrifuger les vers à 560 x g pendant 30 s et supprimer tout surnageant mais 100 µL sans perturber le culot à vis sans fin.
      Remarque : Utiliser des volumes importants de PBST pour laver vers plaques si faire une coloration haut débit. Ne pas laver les vers dans le PBST de plus de 15 min avant la fixation de l’échantillon. Faire des nouveaux lavages si surnageant ne s’efface pas de bactéries. Effectuer d’incubation dans l’isopropanol 40 % à l’aide d’un nutator ou bascule. Toujours surveiller les tubes pour s’assurer que l’agitation de l’échantillon complet se produit.
  4. Lipides, coloration avec ORO
    1. Ajouter 600 µL de solution de travail ORO à chaque échantillon. Renverser le tube trois fois et mélanger les vers bien à ORO.
    2. Faire pivoter les échantillons à 30 tr/min pendant 2 h à température ambiante.
    3. Centrifuger les échantillons à 560 x g pendant 1 min et éliminer tous les µL surnageant mais 100.
    4. Remettre en suspension les échantillons dans 600 µL de PBST et tourner les tubes à 30 tr/min pendant 30 min enlever tache ORO excédentaire.
    5. Centrifuger les échantillons à 560 x g pendant 1 min et éliminer tout sauf 50 µL de liquide surnageant.
    6. Pour mieux distinguer l’emplacement des cellules germinales et les cellules intestinales de l’animal, détachant les noyaux en ajoutant 1 µL de (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indole-6-carboxamidine) (DAPI) pour chaque 1 mL de solution d’ORO. Effectuer de ORO coloration pendant 2 h avec l’ajout de DAPI avant le montage de diapositives pour l’imagerie. Noyaux intestinaux sont plus grands dans la taille et la gonade se distingue par les développement des cellules germinales.
      NOTE : Après ORO coloration, vers peuvent adhérer aux parois du tube à centrifuger et ne parviennent pas à former une boulette notable. Dans ce cas, centrifuger les vers à nouveau ou permettre à worms se contenter par gravité d’au moins 10 min.
  5. Préparation des lames pour le ver d’imagerie
    1. Remettre en suspension les vers dans le surnageant restant et bien mélanger la solution.
    2. Mettre 5 µL de suspension de ver sur une lame de microscope et placez un lamelle couvre-objet avec précaution, s’assurer qu’aucun air bulles se forment.
    3. Sceller la lamelle avec vernis à ongles et les vers l’image.
      Remarque : Après fixation et coloration, les vers peuvent être très rigide et difficile à pipeter. Pour contourner cela, faire des pipettes d’échelle-alésage en coupant leurs conseils.
    4. Stocker les diapositives dans un rack de micro-centrifuger à 4 ° C pendant 24 h, si ne pas d’imagerie immédiatement après la coloration.
  6. Imagerie de worms colorés à l’ORO
    1. Utiliser une caméra couleur capacité à worms ORO teinté en image.
    2. Grossissement de X 5 permet d’image plusieurs vers un champ de vision.
    3. Passer à un grossissement de 10 X pour le meilleur examen de worms individuels.
    4. Exporter des images au format TIF pour éviter la perte de données due à la compression.
      Remarque : Si la coloration avec ORO + DAPI, basculez la caméra couleur compatible à celui qui peut capturer la fluorescence.
  7. Analyse d’images de worms colorés à l’ORO
    1. Télécharger micrograph(s) sur ImageJ. Dans le menu déroulant Plugins, utilisez la fonction de Bio-Formats si le fichier image n’est pas reconnu.
    2. Dans le menu déroulant Image, la fonction Stacks, utilisez des Images-de-pile pour créer une pile d’image lorsqu’on compare les micrographies plusieurs.
    3. Régler la luminosité/contraste sous le même menu déroulant afin d’améliorer la visibilité des gouttelettes lipidiques.
    4. Classer les images selon l’accumulation de lipides dans le corps de l’animal ou dans des tissus spécifiques.
    5. Pour une meilleure évaluation de la localisation de lipide et d’identification des artefacts d’image non spécifique à l’aide de ImageJ, sélectionner la fonction de la couleur dans le menu déroulant de Image et cliquez sur la pile en RVB pour montrer les signaux de chacune des composantes RVB.

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Résultats

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SKN-1 est un bZip, facteur de transcription cytoprotecteurs qui partage une homologie avec NRF2 mammifères et a été montré à la médiation d’oxydation des acides gras. Selon la concentration de glucose dans leur alimentation, worms avec un allèle constitutivement activées skn-1 montrent des niveaux de lipides différents lorsqu’elle est colorée avec Nil rouge7. Figure 1 a -C indique activé skn-1 animaux...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’augmentation de l’obésité et les taux de maladies métaboliques rend c. elegans , un modèle approprié pour étudier les mécanismes qui régulent l’accumulation de graisses dans les cellules et les tissus. Des preuves récentes suggèrent que les changements dans les taux de lipides sont corrélés avec des processus cellulaires, allant de l’insuline signalisation8, l’activation des récepteurs hormone2, à la capacité reproductrice5. Par rapport à ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été rendu possible par l’octroi de NIH : R01GM109028 (S.P.C.)

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Imager.M2m MicroscopeZeissn/aMicroscope à fluorescence
Caméra ERC5sAxiocamn/acompatible avec les couleurs
Axiocamn/aCapable de fluorescence
Rouge du NilThermo FisherN1142Coloration
lipidique Rouge huile OAlfa AesarA12989Coloration lipidique
DAPIThermo FisherD1306Coloration à l’ADN
Alcool isopropyliqueBDHBDH1133-1LPSolution fixatrice
0.2 µ ; Filtre à seringue séterielm VWR28145-477Filtre en acétate de cellulose
Centrifugeuse 5430Eppendorf5428000015
Centrifugeuse Agitateur Rôtissoirede laboratoire Quake400110QAgitateur
Tube RotateurVWR10136-084Rotateur
K2HPO4Sigma-Aldrich7758-11-4NGM
KH2PO4Sigma-Aldrich7778-77-0NGM
MgSO4Alfa Aesar7786-30-3NGM
CaCl2Sigma-Aldrich10035-04-8NGM
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
NGM CholestérolSigma-Aldrich57-88-5
NGM PeptoneBD Biosciences211677NGM
Agar TeknovaL9110NGM
LB mediaSigma-AldrichL3147Croissance bactérienne
Caméra MRm

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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