Article de méthode

Analyser le comportement larves de drosophile en réponse à une Stimulation des neurones olfactifs Optogenetic

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DOI :

10.3791/57353

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21 mars 2018

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1Department of Biology, MS-0314, University of Nevada, 2Integrated Neuroscience Graduate Program, University of Nevada

Dans cet article

Résumé

Ce protocole analyse le comportement de navigation de larve de drosophile en réponse à la stimulation simultanée d’optogenetic de ses neurones olfactifs. Lumière de longueur d’onde de 630 nm permet d’activer les neurones olfactifs individuels exprimant une rhodopsine canal décalée vers le rouge. Mouvement larvaire est suivi en même temps, d’enregistrement numérique et analysées à l’aide du logiciel d’écriture personnalisée.

Résumé

La capacité des insectes pour naviguer vers les sources d’odeurs est basée sur les activités de leurs neurones récepteurs olfactifs de premier ordre (ORN). Alors qu’une quantité considérable de renseignements s’est dégagée au sujet de l’ORN réponses aux substances odorantes, le rôle d’Orn spécifiques à la conduite des réponses comportementales reste mal compris. Des complications dans les analyses de comportement résultant de différentes volatilités des substances odorantes qui activent individuels Orn, Orn multiples activées par odorisants unique et la difficulté à reproduire les variations temporelles naturellement observées en utilisant des stimuli olfactifs méthodes conventionnelles odeur-livraison en laboratoire. Nous décrivons ici un protocole qui analyse le comportement larve de drosophile en réponse à la stimulation simultanée d’optogenetic de ses Orn. La technologie optogenetic utilisée ici permet pour la spécificité de l’activation de l’ORN et un contrôle précis des patterns temporels d’activation ORN. Mouvement de larve correspondant est l’objet d’un suivi, enregistrés numériquement et analysées à l’aide personnalisé écrit logiciel. En remplaçant des stimuli odeur par des stimuli lumineux, cette méthode permet un contrôle plus précis de l’activation de ORN individuel afin d’étudier son impact sur le comportement des larve. Notre méthode pourrait être étendu afin d’étudier l’impact des neurones de projection de second ordre (PNs) ainsi que les neurones les (LNs) sur le comportement des larve. Cette méthode permettra donc une dissection complète de fonction circuit olfactif et complément des études sur les activités de neurones olfactifs comment traduisent aux réponses de comportement.

Introduction

Les informations olfactives dans l’environnement d’une larve drosophile sont captées par seulement 21 Orn fonctionnellement distinctes, les activités dont finalement déterminer comportement larvaire1,2,3,4. Pourtant, relativement peu est connu sur la logique par laquelle l’information sensorielle est codée dans les activités de ces 21 Orn. Il est donc nécessaire de mesurer expérimentalement la contribution fonctionnelle de chaque larve ORN au comportement.

Bien que le profil de réponse sensorielle de tout le répertoire de Drosophila Orn larvaires a été étudié en détail1,4,5, les contributions d’Orn individuels pour le circuit olfactif et donc comportement de navigation demeurent largement inconnus. Jusqu’ici, des difficultés dans les études de comportement larvaire, surgir en raison de l’incapacité à spatialement et temporellement activer Orn unique. Un panel de substances odorantes qui activent spécifiquement les 19 de la 21 Orn de larves de drosophile a été récemment décrit1. Chaque substance odorante dans le panneau, à faible concentration, suscite une réaction physiologique qu’à partir de ses apparenté ORN. Cependant, des concentrations plus élevées qui sont normalement utilisés pour les essais de comportement conventionnel, chaque substance odorante suscite des réactions physiologiques de plusieurs Orn1,5,6. En outre, odorisants dans ce panneau ont varié de volatilités qui compliquent l’interprétation des études de comportement qui dépendent de la formation d’odeurs stable dégradés7,8. Enfin, naturellement, des stimuli naturels odeur ont une composante temporelle qui est difficile à reproduire en laboratoire. Il est donc important de développer une méthode permettant de mesurer les comportement larvaire tout en activant simultanément Orn individuels de façon spatiale et temporelle.

Ici, nous démontrons une méthode qui a des avantages par rapport aux décrite précédemment suivi larvaire dosages1,8. Le suivi décrit dans Gershow al repose sur des soupapes de commandés électronique pour maintenir un gradient stable d’odeur dans l' arène de comportement8. Toutefois, en raison du niveau d’ingénierie complexe impliqué pour construire la configuration de stimulation d’odeur, cette méthode est difficile à reproduire dans d’autres laboratoires. En outre, les questions liées à l’utilisation des substances odorantes pour activer spécifiquement Orn unique demeurent irrésolues. Le test de suivi décrit dans Mathew et coll. utilise un système de livraison odeur plus simple, mais le gradient d’odeur qui en résulte dépend de la volatilité de la substance odorante test et est instable pour la longue durée de l' essai1. Ainsi, en remplaçant des stimuli odeur par des stimuli lumineux, notre méthode a les avantages de la spécificité et un contrôle temporel précis d’activation ORN et n’est pas tributaire de la formation de gradients de l’odeur des différentes forces.

Notre méthode est facile à mettre en place et convient pour les chercheurs qui s’intéressent à la mesure des aspects de la navigation larve de drosophile . Cette technique pourrait être adaptée à d’autres systèmes de modèle pourvu que le chercheur est capable de conduire l’expression de CsChrimson dans neuron(s) de leur système préféré de choix. CsChrimson est une version décalée vers le rouge de la rhodopsine canal. Il est activé à longueurs d’onde qui sont invisibles au système phototaxie de la larve. Nous sommes donc en mesure de manipuler l’activité des neurones avec la spécificité, la fiabilité et la reproductibilité,9. En modifiant la coutume écrite logiciel pour tenir compte des modifications de la taille des sujets, cette méthode pourrait être facilement adaptée pour les larves d’autres espèces d’insectes rampants.

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Protocole

1. construction d’un aréna de comportement et de préparer le matériel pour permettre la Stimulation de Optogenetic dans l’arène de comportement

  1. Pour construire un aréna de comportement privés de lumière, construire une boîte avec une dimension de 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24" L x 26" H) faite de feuilles d’acrylique plexiglas couleur noire (3 mm d’épaisseur) (voir la Table des matières). Matériaux pour construire une telle boîte devraient être disponibles dans les quincailleries locales. Placez cette boîte sur un dessus de table dans la salle de comportement (Figure 1A).
  2. Montage d’une caméra USB 3.0 CCD monochrome munie d’un filtre de nm de long-pass 830 IR et une lentille de 8 mm F1.4 monture C (voir Table des matières) au centre du plafond de la boîte noire. Place deux LED infrarouge bandes (voir la Table des matières) sur le dessus de table afin d’éclairer les larves dans l’arène foncé (Figure 1A).
  3. Pour construire la plate-forme de LED, obtenir une plaque d’aluminium 22 cm × 22 cm carrée (préférence vaporisées avec un fini noir mat pour éliminer les reflets). Dans le centre de la plaque, à l’aide d’un couteau métal, découper un trou qui est assez grand pour s’adapter autour de la caméra CCD.
  4. Couvrir la plaque de métal avec l’éclairage de bande LED rouge (voir Table des matières). Soudez les fils bande lumineuse LED en série et faire passer les fils de bande dans un optocoupleur relais contrôlé par un microprocesseur de 2 b Raspberry Pi (voir la Table des matières) (Figure 1B et 2).
  5. Installer et configurer le système d’exploitation Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux basé sur le processeur Raspberry Pi avant de brancher le relais opto-coupleur pour les bandes de LED. Raccordez un bloc d’alimentation pour alimenter les bandes LED et l’optocoupleur (Figure 2) (voir la Table des matières). Installez la plate-forme de LED autour de la caméra CCD (Figure 1B).
    NOTE : Ubuntu Mate v16.04 operating system est disponible gratuitement. Un ensemble de commandes Python basé simples peut être facilement adapté aux modèles de programme des stimuli lumineux LED (voir fiche de syntaxe).
  6. Veiller à ce rayonnement homogène en divers points de l’arène de comportement. Mesurer l’irradiance absolu à la surface de l’arène à l’aide d’un spectromètre et déterminer qu’il est ~1.3 W/m2 sur toute la surface de l’arène.
    NOTE : À cette intensité, pas de changements significatifs ont été observés en température au cours des expériences. Une autre étude10 utilisé un éclairement supérieur de ~1.9 W/m2 et n’observé aucun changement dans la température au cours des expériences.

2. préparation des larves de drosophile pour des Analyses de comportement

  1. Maintenir les mouches sur la nourriture volée standard (voir la Table des matières) à 25 ° C, 50-60 % HR et un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h.
  2. Afin d’exprimer les CsChrimson en une seule paire d’Orn, traverser les femelles vierges d’une lignée de SAMU-IVS-CsChrimson aux mâles d’une ligne OrX-Gal4 (« X » correspond à l’une des 21 récepteurs odeur larvaire (ou) gènes qui sont exprimés de façon unique chacune de 21 paires d’ORN)9,11.
    1. Alternativement, afin d’exprimer CsChrimson dans tous les 21 Orn larvaire, Croix des femelles vierges d’un SAMU-IVS-CsChrimson ligne aux mâles d’une ligne de Orco-Gal4 (« Orco » est le corécepteur s’exprime dans tous les 21 ORN).
    2. Utiliser le SAMU-IVS-CsChrimson ligne par lui-même comme témoin lors de ces expériences.
      Remarque : Les stocks mouches répertoriés ici sont tous disponibles au centre de Stock Drosophila Bloomington (voir Table des matières).
  3. Une fois les mouches mâles et femelles dans un croisement sont autorisés à s’accouplent et pondent pendant 48 h, transférez adultes dans un nouveau flacon.
    1. À la surface de la cuvette de nourriture contenant des oeufs, ajouter 400 µL d’un mélange contenant 400 rétinal en tout-trans µM (RTA) dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) et du sucrose de 89 mM dissous dans l’eau distillée.
      Remarque : La faible quantité de saccharose favorise l’alimentation larvaire de la solution de l’ATR. ATR est un cofacteur nécessaire pour régulariser CsChrimson expression9,10. ATR est sensible à la lumière.
    2. Une fois qu’ATR est ajouté pour les flacons de produits alimentaires contenant des oeufs, incuber les flacons dans l’obscurité pendant 72 h supplémentaires.
      NOTE : Alors que cette étude et les deux études susmentionnées n'ont pas observé les effets sur le comportement des larve en raison de l’ATR d’alimentation, il est recommandé de contrôler les effets de l’ATR alimentation en soumettant les lignées tests à la même quantité du mélange ci-dessus qui ne contient-elle pas de RTA.
  4. Extrait troisième stade larvaire (~ 120 h après la ponte) de la surface des aliments mouche en flottant à l’aide d’une solution de sucrose à haute densité (15 %). En utilisant un P1000 micropipette séparer les larves flottant à la surface de la solution de saccharose dans un bécher de verre de 1000 mL.
  5. Laver les larves 3 à 4 fois en échangeant 800 mL d’eau distillée fraîche dans le bol de verre chaque fois. Permettre aux larves se reposer pendant 10 min avant en les soumettant à l’analyse de comportement.

3. comportement Assay

  1. Maintenir une température constante (entre 22 et 25 ° C) et humidité (entre 50 et 60 % HR) dans la salle de comportement.
  2. Préparer le larvaire moyen rampant en verser 150 mL d’agarose fondu (1,5 %) dans un carré de 22 cm x 22 cm boîte de Pétri. Une boîte de Pétri est versé pour chaque essai de l’essai, les essais de 8 à 10 par expérience. Permettre d’agarose solidifier et refroidir pendant 1 à 2 h dans les boîtes de Pétri avant de les utiliser dans l’analyse de comportement.
    1. Transfert à pas plus de 20 sur les larves de troisième stade préparées pour le centre de Pétri (Figure 1C). Couvrir le plat de Pétri avec son couvercle. Placez la boîte de Pétri dans l’arène de comportement sous la caméra CCD.
      Remarque : Selon l’expérience, des essais de comportement sont effectués en général pendant 3 à 5 min. Si une substance odorante est utilisée dans le test pour offrir des repères de guidage, il a été observé que le gradient d’odeur qui en résulte reste stable pendant environ 5 min1. Les temps de dosage plus longs ne sont pas recommandés. Des effets délétères sur les larves due à une déshydratation ou exposition prolongée de feux rouges du nm 630 n’ont pas observés au sein de ces points dans le temps.
  3. Tourner sur le 850 nm infra rouge source lumineuse LED pour visualiser des larves dans la vidéo. Commencer la caméra CCD pour enregistrer le mouvement larvaire.
  4. En utilisant le logiciel associé au processeur de Raspberry Pi, programme de la procédure pour administrer des modèles appropriés de stimulation de la lumière rouge.
    Remarque : Un ensemble de commandes Python basé simples peut être facilement adapté aux modèles de programme des stimuli lumineux LED (voir fiche de syntaxe).

4. traitement des données et analyse

  1. Importer la vidéo enregistrée de chaque essai dans n’importe quel logiciel de programmation disponible comme Matlab.
  2. Obtenir les coordonnées XY de chaque larve dans un film en fonction du temps. Basé sur les limites du logiciel suivi, les larves de troisième stade de 15 – 20 peuvent être suivis dans un seul film1,8.
    Remarque : Un ensemble de simples codes Matlab (« Tracklarva ») qui peut être facilement adaptée aux conditions appropriées (voir la fiche de syntaxe) est fourni. Ce programme combine tous les essais lors d’une expérience et renvoie les coordonnées XY de chaque larve pendant toute la durée de l’essai (voir Syntaxe de code ci-dessous). Alternativement, on peut utiliser plusieurs programmes de base open source sont disponibles gratuitement pour les chercheurs. Par exemple JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.
  3. Utilisez les coordonnées XY générées pour tracer les trajectoires larvaires et à poursuivre l’analyse locomotion larvaire.
    1. Pour les analyses du comportement, utilisez navigation statistiques comme la vitesse, la courbure de la trajectoire, angle de position, segmenter les trajectoires individuelles de larves en alternant des séquences de courses et de tours.
    2. Pistes sont définis comme des périodes continues de mouvement vers l’avant. Tour à tour séparer les séries successives. Tour à tour est signalées lors de changements d’angles d’orientation de trajectoire sont > 45° (voir le fichier de syntaxe).
  4. Calculer les valeurs moyennes de vitesse exécution, exécutez longueur, course d’orientation et d’autres paramètres comme l’exige.
    Remarque : Un jeu de syntaxe simple pour extraire « fonctionne » et « s’arrête » de trajectoires larvaires est fourni (voir la fiche de syntaxe). Simple de Matlab ou d’Excel fonctions de base peuvent être appliquées aux données extraites pour calculer les valeurs de « vitesse d’exécution », « exécuter en longueur » etc.
  5. Représenter des données pour chaque indicateur comportemental en moyenne ± SEM

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Résultats

Pour démontrer la spécificité de l’activation d’ORN, notre méthode a été appliquée avec succès pour déterminer l’impact des deux ORN différentes (ORN::7a et ORN::42a) activation (ORN exprimant soit Or7a ou Or42a) sur le comportement des larve (Figure 3). Conforme aux récentes études cet individu Orn larvaires est fonctionnellement distinctes1,10,13, nos données repré...

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Discussion

Ici, nous avons décrit une méthode qui permet de mesurer le comportement larve de drosophile en réponse à l’activation simultanée d’optogenetic de neurones olfactifs. Décrit précédemment larvaire suivi des méthodes1,8 utilisent la technologie de livraison différentes odeurs pour activer Orn. Cependant, ces méthodes ne peuvent pas contrôler la spécificité ou les tendances temporelles de l’activation de ORN. Notre méthode permet de surmonter ces déficits e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de l’Université du Nevada, Reno et par NIGM de l’Institut National de la santé sous le numéro de licence GM103650 P20.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Caméra <> vidéo forte pour capturer les mouvements larvaires CCD >
Edmund Optics106215
Adaptateur de filetage de filtre M52 à M55Edmund Optics59-446
Porte-filtre à filetage carré 2" pour objectifs d’imagerie  ;Edmund Optics59-445
RG-715, 2" Sq. Filtre passe-longEdmund Optics46-066<
strong>Électronique pour configuration optogénétique
Raspberry Pi 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
Alimentation programmable 3 canauxnewegg.com9SIA3C62037092
8 Relais optocoupleur de canalamazon.com6454319
630nm Bandes lumineuses LED à quatre rangéesenvironmentallights.comrouge3528-450-bobine
Bandes LED 850nmenvironmentallights.comwp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software  ;
MatlabMathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
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Plexiglass acrylique noirHome DepotMC1184848bl
Nourriture pour mouches et autres réactifs
Nourriture pour mouches NutriflyGenesee Scientific66-112
Poudre d’agaroseGenesee Scientific20-102
Boîte de Pétri carrée de 22 cm x 22 cmVWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
SaccharoseSigma-Aldrich84097
Tout trans-rétinienSigma-AldrichR2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson  ; BloomingtonDrosophila Stock Center55134
Orco-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center26818
Or42a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center9970
Or7a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center23907
forte

Références

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  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
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Mots-clés

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