L’isolement et la Culture de cellules primaires épicardiques spécimens de coeur adultes et du foetus humain

Résumé

L’épicarde joue un rôle crucial dans le développement et la réparation du coeur en fournissant des cellules et facteurs de croissance à la paroi myocardique. Nous décrivons ici une méthode aux cellules humaines d’épicardique principale culture qui permet l’étude et la comparaison de leurs caractéristiques développementales et adultes.

Résumé

L’épicarde, une couche de cellules épithéliales couvrant le myocarde, a un rôle essentiel au cours du développement cardiaque, ainsi que dans la réponse de réparation du coeur après une lésion ischémique. Lorsqu’il est activé, les cellules épicardiques subissent un processus appelé épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT) pour assurer les cellules vers le myocarde en régénération. En outre, l’épicarde contribue par l’intermédiaire de la sécrétion de facteurs paracrines essentiel. Pour apprécier pleinement le potentiel de régénération de l’épicarde, un modèle de cellule humaine est nécessaire. Ici, nous présentons un modèle de culture cellulaire roman pour dériver des cellules dérivées épicardiques primaires (EPDCs) de tissu cardiaque adult et du foetus humain. Pour isoler le EPDCs, l’épicarde est disséqué de l’extérieur de l’échantillon de cœur et transformée en une suspension monocellulaire. Ensuite, les EPDCs sont plaqués et cultivées dans un milieu contenant l’inhibiteur de kinase-5 ALK SB431542 pour maintenir leur phénotype épithélial EPDC. EMT est induite par la stimulation avec TGFβ. Cette méthode permet, pour la première fois, l’étude du processus de l’humain EMT épicardique dans un milieu contrôlé et permet de gagner plus de perspicacité dans la sécrétome de EPDCs qui peut aider la régénération cardiaque. Par ailleurs, cette approche uniforme permet une comparaison directe des comportements humains adultes et foetale épicardique.

Introduction

L’épicarde, une couche épithéliale monocellulaires qu’enveloppes le coeur, est d’une importance vitale pour le développement cardiaque et réparation (examinées par Smits et al. ¹). développemental, l’épicarde découle de l’orgue de proepicardial, une petite structure située à la base du cœur en voie de développement. Autour du jour du développement E9.5 à la souris et après la conception 4 semaines chez les humains, les cellules commencent à migrer à partir de cette structure de chou-fleur et de couvrir les pays en développement de myocarde². Une fois qu’une couche unique de cellules épithéliales est formée, une ....

Protocole

Toutes les expériences avec des échantillons de tissus humains ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Leiden University Medical Center et est conforme à la déclaration d’Helsinki. Toutes les mesures sont effectuées avec du matériel stérile dans un flux de culture cellulaire du cabinet.

1. les préparatifs

1. Préparer EPDC milieu en mélangeant de Dulbecco mis à jour le milieu Eagle (DMEM basse-glucose) et milieu 199 (M199) dans un rapport 1:1. Ajouter 10 % chaleur inactivé sérum fœtal (SVF, chaleur inactivé pendant 25 min à 56 ° C) et compléter à 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 mg/mL. Réchauffez le milie....

Résultats

Ici, nous exposons un protocole simple pour isoler EPDCs des adult et du foetus humain tissu cardiaque (Figure 1). Ce protocole tire parti de l’emplacement facilement accessible de l’épicarde à l’extérieur du cœur (Figure 1 a). Coloration de l’oreillette cardiaque après que dissection montre que l’épicarde WT1 + est supprimé tandis que le sous-épicardique sous-jacente de la matrice extracellulaire et le tissu myocardique restent .......

Discussion

Nous décrivons ici un protocole détaillé d’isoler et de la culture des cellules primaires épicardiques dérivés de coeurs adultes et du foetus humains. Une caractérisation de ces cellules a été précédemment publié¹⁷. Nous avons montré que les deux types de cellules peuvent être maintenues tant que les cellules épithéliales de pavées comme lorsqu’il est cultivé avec l’inhibiteur de kinase de ALK5 SB431542. EMT est partie intégrante du épicardique activation in vivo au cours de développement.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco' Eagle modifié' s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199  ;	Gibco	31150-022
Sérum de veau fœtal  ;	Gibco	10270-106
Trypsine 0,25 %	Invitrogen	25200-056
Pénicilline G sel sodique	Roth	HP48
Sulfate de streptomycine	Roth	HP66
Trypsine 1:250 du pancréas bovin	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gélatine de la peau de porc	Sigma-Aldrich	G1890
Plaques de culture 6 puits	Greiner bio-one	657160
Plaques de culture 12 puits	Corning	3512
Plaques de culture 24 puits	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000et micro ; L Pointes de pipette filtrées	Corning	4809
Pipette de 10 ml	Greiner bio-one	607180
Pipette de 5 ml	Greiner bio-one	606180
Plat de culture cellulaire 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Ou tubes Eppendorf faits maison et stérilisés
1,5 mL	Eppendorf
Tubes à centrifuger de 15 ml	Greiner bio-one	188271
Tubes à centrifuger de 50 ml	Seringue Becton bio-one	227261
10 mL	Becton Dickinson	305959
Aiguilles de calibre 19	Becton Dickinson	301700
Calibre 21	Becton Dickinson	304432
Tamis à cellules EASYstrainer, 100 & micro ; m	Greiner bio-one	542000
TGF&beta ; 3  ;	R& D systems	243-B3
Anti-actine monoclonale, &alpha ;-Muscle	lisse Sigma	A2547  ;
Anti-souris Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Pipette P1 000	Gilson	F123602
Contrôleur de pipette	Integra	155 015
Stéréomicroscope	Leica	M80
Microscope à lumière inversée	Olympus	CK2
Centrifugeuse	Eppendorf	5702
Bain d’eau	GFL	1083

0030120086