Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole simple et facile pour mesurer enhancement dépendante anticorps d’infection par virus de Zika sérum convalescent à l’aide de particules virales journaliste virus de la Dengue.

Résumé

Amélioration dépendante anticorps d’infection a été démontrée à jouer un rôle majeur dans la pathogénie virale de la Dengue. Traditionnels tests qui mesurent la capacité d’anticorps ou de sérum d’augmenter l’infection dans les lignées cellulaires inadmissible ont compté sur l’utilisation de production virale dans les médias, suivies par des essais de plaque pour quantifier l’infection. Plus récemment, ces tests ont examiné infection par le virus (DENV) la Dengue dans les lignées cellulaires à l’aide d’anticorps fluorescent étiquetés. Ces deux approches ont des limites qui restreignent l’utilisation généralisée de ces techniques. Nous décrivons ici un essai simple in vitro à l’aide de Dengue virus journaliste particules virales (VPR) qui expriment la protéine fluorescente verte et les cellules K562 à examiner l’amélioration dépendante des anticorps (ADE) d’infection DENV sérum obtenu à partir de rhésus macaques 16 semaines après l’infection par le virus Zika (ZIKV). Cette technique est fiable, implique la manipulation des cellules, ne nécessite pas l’utilisation de virus compétente de réplication direct et peut être effectuée dans un format haut débit pour obtenir une lecture quantitative à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce test peut être facilement adapté pour examiner l’amélioration dépendante des anticorps (ADE) d’autres infections flavivirus tels que les virus de la fièvre jaune (SVA), virus de l’encéphalite équine japonais (tarek), virus du Nil occidental (VNO) etc. où les VPR est disponibles. La facilité de mise en place du test, analyse des données et interprétation des résultats rendent très favorable à la plupart des paramètres de laboratoire.

Introduction

Amélioration dépendante des anticorps (ADE) de l’infection est un processus par lequel partiellement une réaction croisée d’anticorps induits par un sérotype de virus augmente l’absorption d’un autre sérotype du virus, conduisant à une virémie et une augmentation de la réplication virale. ADE a été largement documenté dans les infections de virus (DENV) la Dengue où quatre principaux sérotypes sont fréquentes. Dans un sous-groupe de patients, l’ADE est associée à une fièvre hémorragique (DHF). Nous avons récemment démontré que Zika infection par le virus (ZIKV) induit des réponses en anticorps croisée DENV origine ADE de DENV in vitro et probablement contribu....

Protocole

Les échantillons de sérum utilisés pour démontrer le protocole décrit ici proviennent de macaques rhésus qui étaient logés et pris en charge conformément à l’état local et fédérales politiques dans une Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC)-accrédités par facilité. Toutes les expériences animales ont été examinées et approuvées par animalier institutionnel et Comité de l’emploi et des échantillons ont été acquis par un protocole de partage des tissus.

1. jour 1

Remarque : Effectuez toutes les étapes décrites ci-dessous dans une armoire de biosafety stérile à fl....

Résultats

Des sérums provenant de 4 rhésus macaques ont été recueillies à 16 semaines après l’infection avec ZIKV et testés pour leur potentiel d’amélioration DENV-1, 2, 3 et 4 infection dans les cellules K562. Les animaux avaient une virémie pic de ~ 1 x 10⁵ copies de ZIKV RNA/mL de plasma par jour 3 après l’infection qui a diminué à des niveaux inférieurs à la limite de détection de 7 jours après l’infection. Aucun virémie a été détectée dans le plasma à l’infection après 16 semaines. .......

Discussion

Flavivirus comme DENV et ZIKV partagent des preuves significatives d’homologie dans les deux leurs protéines structurales et non structurales qui produisent des anticorps qui réagissent avec l’autre^13,14. Ces réponses anticorps une réaction croisée ont été démontrés pour améliorer d’infection aussi bien in vivo et in vitro avec un sérotype hétérologue ou autres associés flavivirus^1,2. Le.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cellules	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10 % FBS dans RPMI-10
Pénicilline-Streptomycine	MP biomedicals	1670049	100 UI Pen/mL, 100 ug Strep/mL dans RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-CL	0.025M dans une solution d’acides aminés non essentiels RPMI-10
MEM (100× ;)	Sigma	M7145	1x dans RPMI-10
Pyruvate de sodium	Cellegro	25-000-Cl	1mM dans RPMI-10
L-glutamine	Fisher	Scientific MT25005CI  ;
Plaques stériles à fond en V	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylène 5 ml Tubes FACS	VWR	60819-728
Plaques à fond en U non stériles	Falcon Ref	353910	Une alternative à haut débit aux tubes FACS
5mL, stérile, pipette sérologique	Denville	P7127
200uL pointes	de pipette stérilesDenville	P3020 CPS
	Denville	P1121
50-200uL pipette multicanaux	Denville	P3975-8-B
5-50uL pipette multicanaux	Denville	P3975-9-B
20 % formadehyde	Tousimis	#1008B
bain-marie	ThermoFisher	TSCOL35
thermomélangeur	Eppendorf	2231000387	Une alternative au bain-marie pour l’inactivation thermique
Incubateur CO2	ThermoFisher	13-998-213
Éthanol	Sigma Aldrich	E7023
Eau de Javel	liquide Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Logiciel d’analyse de cytométrie en flux
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II cytomètre	en flux Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher	Scientific NC9724348

20uL pointes de pipette stériles