Mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale dans les fibres perméabilisées de la drosophile à l’aide de petites quantités de tissu

Résumé

Dans cet article, on décrit une méthode pour mesurer la consommation d’oxygène à l’aide de respirométrie haute résolution en thoraxes perméabilisées de drosophile. Cette technique nécessite une quantité minimale de tissu par rapport à la technique d’isolement mitochondrial classique et les résultats obtenus sont plus physiologiquement pertinents.

Résumé

La drosophile, Drosophila melanogaster, représente un nouveau modèle pour l’étude du métabolisme. En effet, drosophile possèdent des structures homologues aux organes humains, de posséder des voies métaboliques hautement conservées et ont une durée de vie relativement courte qui permet l’étude des mécanismes fondamentaux différents dans un court laps de temps. Toutefois, il est surprenant que l’un des mécanismes essentiels pour le métabolisme cellulaire, la respiration mitochondriale, n’a pas été soigneusement étudié dans ce modèle. C’est probablement parce que la mesure de la respiration mitochondriale chez la drosophile nécessite généralement un très grand nombre de personnes et les résultats obtenus ne sont pas très reproductibles. Nous décrivons ici, une méthode qui permet la mesure précise de la consommation d’oxygène mitochondriale en utilisant des quantités minimales de tissus de drosophile. Dans cette méthode, les thoraxes sont disséqués et perméabilisées mécaniquement avec une pince forte tant chimiquement avec saponine, permettant à différents composés de traverser la membrane cellulaire et moduler la respiration mitochondriale. Après perméabilisation, un protocole est effectué afin d’évaluer la capacité des différents complexes du système de transport d’électrons (ETS) pour oxyder les différents substrats, ainsi que leur réponse à un découpleur et à plusieurs inhibiteurs. Cette méthode présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes utilisant des isolations mitochondriales, car il est plus physiologiquement pertinente parce que les mitochondries sont toujours en interaction avec les autres composants cellulaires et la morphologie mitochondriale est conservée. En outre, préparation de l’échantillon est plus rapides, et les résultats obtenus sont très reproductibles. En combinant les avantages de la drosophile comme modèle pour l’étude du métabolisme avec l’évaluation de la respiration mitochondriale, important de nouvelles connaissances peuvent être dévoilés, surtout quand les mouches connaissent différents environnement ou physiopathologiques conditions.

Introduction

La drosophile, Drosophila melanogaster, a servi comme un organisme modèle pour la recherche génétique pour plus d’un siècle¹. L’étude de cet organisme n’a pas seulement permis d’importantes connaissances fondamentales sur la cellule sort dosage⁴, le développement du système nerveux et mutation taux³, hérédité liée au sexe², mais a aussi récemment émergé comme un outil précieux pour étudier les mécanismes inhérents à plusieurs maladies comme l’Alzheimer et Parkinson^5,6. En outre, c’est un modèle populaire po....

Protocole

1. préparation de réactifs

1. Préparer les solutions suivantes pour la dissection et la perméabilisation du tissu.
   1. Préparer la solution de préservation : 2,77 CaK₂EGTA, 7,23 mM K₂EGTA, 5,77 mM Na₂ATP, 6,56 mM MgCl₂, taurine, 20 mM 15 mM phosphocréatine de₂Na, imidazole de 20 mM, 0,5 mM dithiothréitol et 50 mM K-MES, pH 7.1 (peut être conservée à-20 ° C).
   2. Préparer la solution de saponine : 5 mg de saponine dans 1 mL de solution de préservation (préparer les frais du jour).
2. Préparer les solutions suivantes pour la mesure de la respiration.
   1. Préparer le milieu d....

Résultats

Une trace représentative de la consommation d’oxygène mitochondriale en utilisant le protocole décrit ci-dessus est fournie à la Figure 2. Le pyruvate et le malate injecté dans les chambres ainsi que les fibres musculaires perméabilisées sont désignés à la respiration CI-fuite, c'est-à-direlorsque le complexe I de l’ETS est stimulée par le NADH produit par oxydation du pyruvate et le malate via le cycle des acides tricarboxyliques (CI). Au cours de c.......

Discussion

Dans cette étude, on décrit une méthode pour la préparation de l’échantillon avant la mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale chez la drosophile. Cette méthode a été développée pour résoudre les différents problèmes liés aux protocoles utilisant des isolations mitochondriales, notamment en termes de durée et nombre de personnes requis. Au lieu de travailler avec des isolations mitochondriales habituellement nécessitant une grande quantité de tissus obtenus à partir de plusieurs individus, cette expérience est .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Respiromètre haute résolution Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche	10022-02	Kit de respiromètre Startup O2K   ;
Kit de titrage O2K  ;	Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche	20820-03	Seringues Hamilton de différents volumes
Logiciel Datlab	Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche	20700	Logiciel pour l’acquisition et l’analyse de données
Pince antimagnétique à pointe fine	VWR	82027-400
Secura225D-1S-DQE	Sartorius AG, Göttingen, Allemagne		Balance semi-micro (distribuée par plusieurs sociétés)  ;   ;
Drosophila melanogaster type sauvage w1118	Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA		/> Condition de stockage : 24 ° ; C
Éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther )-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétique	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA Conditions de stockage : RT
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	ATTENTION : corrosif pour les métaux, toxicité aiguë, corrosion cutanée, lésions oculaires graves, toxicité aquatique aiguë. Condition de stockage : RT
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830	Conditions de stockage : RT
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383<	br/> Conditions de stockage : -20 ° ; C
MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	Conditions de stockage : RT
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Conditions de stockage : RT
Na2Phosphocréatine	Sigma-Aldrich	P7936	Conditions de stockage : -20 ° ; C
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	Condition de stockage : RT
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632	Condition de stockage : 2-8 ° ; C
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	Conditions de conservation : RT
Saponine d’écorce de quillaja	Sigma-Aldrich	S7900	Saponine Conditions de conservation : RT Préparation de la solution : 5 mg dans 1 mL de solution de conservation. Préparez des produits frais tous les jours.
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	État de stockage : RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	État de stockage : RT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	État de stockage : RT
BSA	Sigma-Aldrich	05470<	br/> État de stockage : 2-8 ° ; C
Na2S2O4	Sigma-Aldrich	157953	Dithionite de sodium. ATTENTION : substances et mélanges auto-échauffants, toxicité aiguë, toxine aquatique aiguë toxicité aquatique chronique. Conditions de stockage : RT
Pyruvate de sodium	Sigma-Aldrich	P2256	Pyruvate Conditions de stockage : 2-8 ° ; C Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Préparez des produits frais tous les jours.
Acide L-(-)-malique	Sigma-Aldrich	M1000	Malate Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Neutraliser avec du KOH et stocker à -20 ° ;C.
Adénosine 5'-diphosphate monopotassique hydrate	Sigma-Aldrich	A5285	ADP Conditions de stockage : -20 ° ; C Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Neutraliser avec du KOH et stocker à -80 ° ;C.
Cytochrome c du cœur équin	Sigma-Aldrich	C7752	Cytochrome c Condition de stockage : -20 ° ; C Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Conserver à -20 ° ;C.
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380	Proline Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Conserver à -20 ° ;C.
Succinate de sodium dibasique hexahydraté	Sigma-Aldrich	S2378	Succinate Conditions de conservation : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Neutraliser avec HCl et stocker à -20 ° ;C.
sn-Glycérol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) sel	Sigma-Aldrich	G7886	Glycérol-3-phosphate Condition de stockage : -20 ° ; C Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Neutraliser avec du HCl et stocker à -80 ° ;C.
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920	FCCP. ATTENTION : toxicité aiguë, sensibilisation cutanée, toxicité aquatique chronique. Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’éthanol absolu. Conserver dans des flacons en verre à -20 °C.
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	ATTENTION : toxicité aiguë, irritation cutanée, irritation oculaire, toxicité pour certains organes cibles (système respiratoire), toxicité aquatique aiguë, toxicité aquatique chronique. Solution Préparation : Dans l’éthanol absolu. Conserver dans des flacons à l’abri de la lumière à -20 °C.
Acide malonique	Sigma-Aldrich	M1296	Malonate. ATTENTION : toxicité aiguë, lésions oculaires graves. Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Neutraliser avec du KOH. Préparez des produits frais tous les jours.
Antimycine A de Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycine A. ATTENTION : toxicité aiguë, toxicité aquatique aiguë, toxicité aquatique chronique. Conditions de stockage : -20 ° ; C Préparation de la solution : Dans de l’éthanol absolu. Conserver à -20 ° ;C.
N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyl-p-phénylènediamine	Sigma-Aldrich	T7394	TMPD Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Conserver dans des flacons sombres à  ; -20 &°C.
(+)-L-ascorbate de sodium	Sigma-Aldrich	A4034	Ascorbate Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Conserver dans des flacons sombres à  ; -20 &°C.
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002	Azoture de sodium. ATTENTION : toxicité aiguë (orale et cutanée), toxicité pour certains organes cibles (cerveau), toxicité aquatique, toxicité aquatique chronique. Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Conserver à -20 ° ;C.