Method Article

Fabrication d’un réseau multiplexé microenvironnement cellulaire artificiel

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit la méthodologie détaillée pour préparer un tableau microenvironnement cellulaire artificiel multiplexés (MACME) pour le haut débit manipulation physique et chimique cues imitant en vivo microenvironnements cellulaires et à identifier l’environnement cellulaire optimal pour les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) avec le profilage de cellule unique.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microenvironnements cellulaires se composent d’une variété d’indices, comme des facteurs de croissance, matrices extracellulaires et interactions intercellulaires. Ces signaux est bien orchestré et ils est essentiels à la régulation des fonctions cellulaires dans un système vivant. Bien qu’un certain nombre de chercheurs ont tenté d’enquêter sur la corrélation entre les facteurs environnementaux et les fonctions cellulaires désirées, une grande partie reste inconnue. C’est en grande partie en raison de l’absence d’une méthodologie appropriée pour imiter ces signaux environnementaux in vitroet de tester simultanément les différents signaux environnementaux sur les cellules. Nous rapportons ici une plateforme intégrée de canaux microfluidiques et un tableau de nanofibres, suivie haute teneur unicellulaires analyse, afin d’examiner les phénotypes de cellules souches modifiées par des facteurs environnementaux distincts. Pour illustrer l’application de cette plate-forme, cette étude se concentre sur les phénotypes de renouvellement automatique des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Nous présentons ici les procédures de préparation pour un tableau de nanofibres et de la structure de la microfluidique dans la fabrication d’un tableau du microenvironnement cellulaire artificiel multiplexés (MACME). En outre, les étapes globales de la seule cellule de profilage, cellule souillant avec plusieurs marqueurs fluorescents, imagerie de fluorescence multiples et des analyses statistiques, sont décrites.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De1,(hPSCs) des cellules souches pluripotentes humaines2 se renouveler de manière illimitée et se différencient en diverses lignées de tissu, qui pourraient révolutionner le développement des médicaments, thérapies cellulaires, génie tissulaire et la médecine régénérative 3 , 4 , 5 , 6. plats de culture générale et de microplaques, cependant, ne sont pas conçus pour permettre la manipulation précise de cellules physiques et chimiques au niveau cellulaire avec la gamme de nano - de micromètres, qui est un facteur critique pour l’expansion cellulaire, l’auto-renouvellement et différenciation. Pour remédier à cet inconvénient, les études ont examiné le rôle des micro-environnements cellulaires dans la régulation des décisions de la cellule-destin et cellule fonctions4. Ces dernières années, un nombre croissant d’études ont été mené pour reconstruire des micro-environnements cellulaire in vitro7,8. Processus de nano - et microfabrication ont établi ces micro-environnements à travers la manipulation de produits chimiques9,10,11,12,13, 14,15,16,17 et physique18,19,20 signaux environnementaux. Jusqu'à présent, aucune n’a été d’étudier systématiquement les mécanismes sous-jacents des signaux environnementaux chimiques et physiques sur les décisions de la cellule-destin et fonctions au sein d’une plate-forme unique.

Ici, nous introduisons une stratégie fondée sur les principes de conception simple pour établir une plate-forme robuste de dépistage (Figure 1). Tout d’abord, les auteurs décrivent la procédure d’élaboration d’une plate-forme intégrée pour créer des micro-environnements cellulaires polyvalents, artificielles en utilisant un tableau de nanofibres et une structure microfluidique : tableau The multiplexés artificiel cellulaire microenvironnement (MACME) (Figure 1A et 2 a). Le tableau de nanofibres a 12 microenvironnements différents dans diverses combinaisons de matériaux de nanofibres et de densité. Électrofilage servait à fabriquer des nanofibres. Les matériaux de nanofibres, tels que le polystyrène (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22et23de gélatine (GT), ont été conçus pour tester leurs propriétés chimiques, ce qui pourraient affecter adhésion cellulaire et maintien de la pluripotence ( Figure 2B). Les densités de nanofibres étaient variées en changeant de temps électrofilage et les nanofibres générés ont été définis selon leurs densités (DNF, avec D = XLow/Low/Mid/High). La structure de la microfluidique est composée de polydiméthylsiloxane (PDMS) hébergeant les 48 chambres de culture de cellules, qui peuvent être positionnés selon les dimensions standards de la Microplaque 96 puits. PDMS est un polymère biocompatible et gaz échangeable, généralement utilisé pour la fabrication de dispositifs microfluidiques24. Chaque canal microfluidique a été conçu pour être 700 µm large et 8,4 mm de long et avait deux anses sur ses bords (tableau 1). Les chambres ont des hauteurs différentes (250, 500 et 1000 µm) pour manipuler l’ensemencement des cellules densités initiales (0,3, 0,6 et 1,2 × 105 cellules/cm2), qui pourraient mettre en corrélation avec la survie, la prolifération et la différenciation des hPSCs25 (Figure 2C). Le nombre de cellules ensemencées dans une chambre est proportionnel à la densité de la colonne au-dessus du plancher de la chambre, et ainsi la cellule initiale, la densité de semis a contrôlé en introduisant la même suspension cellulaire dans des chambres de culture à différentes hauteurs. Tous les canaux ont été conçus pour être ≥ 250 µm-hauteur26 pour minimiser les effets de tension faible teneur en oxygène27 et contrainte de cisaillement28 sur les cellules. Hauteurs de canal de 250, 500 et 1000 µm sont abrégés ici comme XCD avec X = Low, Mid et High, respectivement. Les environnements avec des densités de nanofibres distinctes et densités d’ensemencement des cellules initiales ont été raccourcies comme « Material_NF density_Cell densité » (par exemple, GT_HighNF_HighCD : un environnement caractérisé par des nanofibres de GT haute densités et haute cellule-amorçage initial densité).

Par la suite, nous décrivons comment effectuer des analyses de cellules individuelles afin d’étudier systématiquement les comportement cellulaire en réponse à des facteurs environnementaux (Figure 1B). Comme une preuve de concept, nous avons identifié l’environnement cellulaire optimal pour hPSC autorenouvellement, qui est une fonction clée pour hPSC entretien (Figure 1B)29. Imageur cytométrie en flux, suivie d’analyses statistiques, permet une interprétation quantitative des réponses phénotypiques cellulaires individuelles aux environnements cellulaires. Parmi une variété de fonctions cellulaires, ce document fournit une procédure détaillée afin d’identifier les conditions optimales pour le maintien de hPSC l’auto-renouvellement.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. fabrication du tableau MACME

Remarque : Tous les matériaux et les équipements sont répertoriés dans la Table des matières.

  1. Préparation de masques pour un tableau de nanofibres et un moule pour une structure de microfluidique
    1. Créer des images tridimensionnelles (3D) de masques utilisés pour les tableaux de nanofibres et les moules de microfluidique de structures à l’aide de paquets de logiciels 3D-infographie (tableau 1).
      Remarque : Les images 3D sont lus et imprimés par une imprimante 3D. Les masques imprimés et la moisissure ont les mêmes dimensions avec des images 3D définis à l’aide du logiciel de graphisme à étape 1.1.1.
    2. Imprimez des masques et un moule basé sur ces dessins à l’aide d’une imprimante 3D.
      Remarque : Dans ce protocole, une imprimante 3D type-jet d’encre avec de la résine UV curable a été utilisé30. La résolution de l’imprimante était 635 × 400 dpi et 15 µm en X, Y et Z, respectivement, cependant, le réel X, Y de résolution est environ quatre fois plus faible.
  2. Préparation de nanofibres-tableau (Figure 3A)
    1. Préparer des solutions de polymère électrofilage.
      1. Diluer 13 % PMGI liquide avec le tétrahydrofurane par 9 % (p/v)22.
      2. Dissoudre 0,08 g de PS (poids moléculaire de moyenne en nombre (Mn) : 130 000) en THF:dimethylformamide (ratio 1:1 volume)21et ajouter THF:dimethylformamide pour porter le volume jusqu'à la finale 1 mL (solution de PS de 8 % (p/v)).
      3. Dissoudre 0,1 g de GT dans l’eau : acétique acide : éthylacétate (rapport de volume de 1:1.6:2.1) et ajouter de l’eau : l’acide acétique : éthylacétate pour porter le volume jusqu'à la finale 1 mL (solution à 10 % (p/v) GT) comme décrit23,31.
    2. Utiliser un magnetron sputtering machine, déposer une fine couche de platine d’une épaisseur de 5 nm sur une platine de polystyrène (PS) (127,7 × 85,5 mm), qui sert une cathode dans le setup électrofilage.
    3. Chargez chaque solution de polymère dans une seringue de 5 mL équipée d’une aiguille émoussée inox de 23-G.
    4. Place et ancre la seringue avec l’aiguille sur un pousse-seringue avec 12 cm en plus du collecteur de l’appareil électrofilage.
    5. Connectez l’aiguille de la seringue à une alimentation haute tension et d’appliquer à 11 kV.
    6. Régler le débit de pompage de 0,2 mL/h.
    7. Maintenir la température et l’humidité à 30 ° C et < 30 % (v/v).
    8. Mettre le masque sur la plaque de base établi à l’étape 1.2.2.
    9. Fabriquer des nanofibres sur la plaque de base à travers les trous du masque avec des densités différentes en changeant le temps électrofilage (p. ex., 20, 60, 90 et 180 s).
    10. Retirer le masque de la plaque de base.
      Remarque. L’éthanol peut être pulvérisé sur les nanofibres GT électrofilées avant d’enlever le masque pour éviter d’épluchage nanofibres GT ainsi que le masque.
    11. Répétez l’étape 1.2.4-1.2.10 jusqu'à l’achèvement de la fabrication de nanofibres-tableau.
    12. Placer le tableau de nanofibres dans un dessicateur à 25 ° C pendant 16 h faire évaporer le solvant résiduel.
    13. Nanofibres Crosslink GT avec 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) et 0,2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) dans l’éthanol à 25 ° C pendant 4 h23.
    14. Rincer les nanofibres GT deux fois avec 99,5 % (v/v) d’éthanol et de séchage sous vide à 25 ° C pendant 16 h.
  3. Fabrication de structures microfluidiques (Figure 3B)
    1. Dissoudre 2 g de PDMS polymérisation agent et 20 g de base PDMS (01:10 poids ratio ; Pre-PDMS). 24
    2. Verser le mélange de pre-PDMS sur le moule fabriqué à l’étape 1.2.
    3. Dé-gaz du mélange de pre-PDMS dans un dessiccateur pendant 30 min.
    4. Guérir le mélange de pre-PDMS dans un four à 65 ° C pendant 16 h.
  4. Baies de montage de MACME (Figure 3B)
    1. Décollez la structure PDMS guérie à étape 1.3.4 du moule et nettoyer avec de l’éthanol à 70 % (v/v).
    2. Traiter la décharge corona atmosphérique sur la face inférieure de la structure PDMS32.
      Remarque : Dans ce protocole, la Couronne s’acquitte de la totalité de la surface d’une couche de 3 ou 4 fois avec un appareil à décharge corona « Handy ». Traitement au plasma d’oxygène a été remplacé par décharge corona atmosphérique d’altérer la surface de l’adhérence.
    3. Assembler la structure PDMS avec le tableau de nanofibres de rapidement.
    4. Cuire au four à 65° C pendant 2 jours.

2. chargement CSEh en tableau MACME

  1. Pour la culture courante de H9 cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), maintenir les cellules en xeno-free définies chimiquement milieu de culture pour l’entretien de hPSC33 additionné de 10 µM Y-27632 ROCK inhibiteur34 (nommé hPSC moyen) dans une culture cellulaire de 35 mm plat recouvert de matrice de gel de membrane basale (MG).
  2. Cellules de passage tous les jours 4 à 7 à l’aide d’une protéase recombinante de la trypsine.
  3. Stériliser un tableau MACME avec 99,5 % d’éthanol, de chargement dans les chambres pendant 10 min et retirez l’éthanol. Répétez cette opération 3 fois.
  4. Introduire 12 µL de MG, 10 µg/mL la vitronectine (VL), et 0,1 % (p/v) GT en contrôle culture chambers et incuber les chambres à 37 ° C pendant 1 h à enduisez-les sur les surfaces de la chambre.
    Remarque : Dans ce protocole, MG, VN et GT ont été choisis comme protéines de référence pour l’adhésion cellulaire et de la culture. Parce que MG et VN sont des matrices de culture cellulaire standard utilisés pour maintenir les hPSC autorenouvellement, ils sont utilisés comme témoins positifs ; deux dimensions revêtement GT (2DGT) ou non-revêtement (NC) étaient utilisés comme témoins négatifs.
  5. Introduire hPSC préchauffé moyen dans toutes les chambres du tableau MACME. Incuber les chambres pendant 30 min à 37 ° C.
  6. CSEh H9 laver cultivé sur un plat de 35 mm avec le SPD, ajouter 0,5 mL d’une protéase de trypsine recombinante au plat et incuber à 37 ° C pendant 1 min et aspirer soigneusement uniquement les fractions surnageantes mélangés avec la protéase.
    Remarque : À l’étape de l’aspiration, les cellules ne sont pas détachés.
  7. Ajouter immédiatement le hPSC moyen, verser doucement le support contre la surface de plat à plusieurs reprises pour dissocier les cellules et transférer les cellules individuelles dans un tube conique de 15 mL.
  8. Centrifuger à 200 x g pendant 3 min. aspirer le surnageant et suspendre les cellules dans un milieu hPSC préchauffé.
  9. Introduire 12 µL de la suspension cellulaire (1,2 × 106 cellules/mL) dans chaque chambre de la microfluidique.
    Remarque : Introduire des cellules à une chambre de l’autre à l’aide d’une micropipette. Parce que le nombre de cellules ensemencées aux chambres est proportionnel à la densité de la colonne au-dessus du plancher de la chambre, la densité de semis cellule initiale pourrait être contrôlée même si des échantillons de la même suspension cellulaire ont été utilisés. Ce pipetage se fasse doucement. Supprimer les excès du milieu des chambres à l’aide d’un bâtonnet de coton-tige après le chargement. Le tableau MACME est compatible avec les pipettes de laboratoire couramment utilisés et les systèmes automatisés de pipette, et il ne nécessite aucun équipement spécial.
  10. Changer hPSC moyenne chaque 12 h et la culture pendant 4 jours.
    Remarque : Les volumes constantes du milieu (1.6, 3.2 et 6.4 µL) sont maintenues à l’aide de chambres de tailles différentes. Cellules en culture dans des conditions statiques pour minimiser les contraintes de cisaillement à l’exception de l’échange du milieu de culture cellulaire35,36.

3. quantitatives unicellulaires profilage

  1. Coloration de cellules fluorescentes sur plaque
    Remarque :     pour analyser les changements phénotypiques du renouvellement automatique hPSCs, ce protocole sélectionné trois marqueurs phénotypiques clés de ce protocole : OCT4, éthynyl-5-2'-déoxyuridine (EdU) et l’annexine V, pour mesurer l’état de pluripotence, prolifération et apoptose , respectivement (Figure 2b). 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est utilisé pour identifier des noyaux cellulaires. Oct4 est l’un des facteurs de transcription critique de pluripotence.
    1. Incuber les CSEh H9 dans les baies de MACME dans hPSC additionné de 10 alcyne de EdU µM à 37 ° C pendant 30 min.
    2. Après le lavage avec le tampon de l’annexine-liaison (HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2de 10 mM), détachant les cellules avec un conjugué de V annexine-colorant orange fluorescente à 20 ° C pendant 15 min.
    3. Fixer les cellules dans du PBS avec paraformaldéhyde à 4 % (v/v) à 20 ° C pendant 15 min et deux fois, puis rincez les cellules avec du PBS.
    4. Permeabilize des cellules à l’aide de PBS avec 0,3 % (v/v) X-100 Triton à 20 ° C pendant 16 h.
      Remarque : Paraformaldéhyde affaiblit la liaison entre une plaque de base en plastique et une structure de microfluidique PDMS. Ainsi, le détachement de la couche PDMS du tableau à l’étape 3.2.1 peut également être effectué juste après cette étape.
    5. Incuber les cellules dans un tampon Tris-base réaction avec un azoture de colorant fluorescent rouge à 20 ° C pendant 30 min.
    6. Incuber les cellules dans un tampon bloquant (PBS avec sérum de chèvre normal de 5 % (v/v) de sérum de 5 % (v/v) âne normal, 3 % (p/v) d’albumine sérique bovine, 0,1 % (v/v) de Tween-20 et 0,1 % de (p/v) N-dodécyl-β-D-maltoside) à 4 ° C pendant 16 h.
    7. Incuber dans du PBS contenant 0,5 % (v/v) solution de Triton X-100 et humaines OCT3/4 anticorps (IgG de souris) à 4 ° C pendant 16 h.
    8. Incuber dans un tampon bloquant avec anti-souris vert fluorescent dye-labeled âne IgG (H + L) à 37 ° C pendant 60 min.
    9. Incuber dans du PBS au DAPI à 20 ° C pendant 30 min.
    10. Remplacez PBS-DAPI par PBS.
    11. Garder le tableau MACME à 4 ° C jusqu'à l’acquisition d’images.
  2. Acquisition d’image (Figure 4)
    1. Décollez la structure microfluidique PDMS du tableau MACME.
    2. Supprimez le PBS résiduel du tableau MACME, appliquer 90%(v/v) glycérol dans du PBS aux cellules et placez les lamelles sur les cellules colorées.
    3. Mettre la plaque de tête en bas sur la scène d’un microscope à fluorescence inversé.
    4. Acquisition d’images de couleur 12-bit automatiquement à l’aide de tous les composants motorisés (scène, filtres, obturateur et les systèmes de mise au point) qui étaient contrôlés par un microscope, logiciels d’imagerie.
      Remarque. Dans ce protocole, les temps d’exposition sont ajustées pour atteindre près de valeurs de l’intensité maximale (intensité maximale de pixel : 4096), mais aucune saturation, pour chaque image, DAPI, OCT4, Annexin V et EdU.
  3. Traitement de l’image guidée par ordinateur et fluorescence signal quantification (Figure 5)
    Remarque :     l’analyse d’image cellule suivante est effectuée selon la méthode décrite précédemment37.
    1. Convertir des images en couleur en niveaux de gris.
    2. Calculer une valeur de seuil unique pour chaque image DAPI avec la méthode d’Otsu et classer les pixels au-dessus du seuil comme de premier plan et en dessous comme toile de fond. Assurez-vous que la valeur foreground correspond à l’intensité de fluorescence de DAPI.
      Remarque : Le processus d’analyse image contient 5 étapes ; identification des objets primaires au DAPI images, identification des objets secondaires OCT4, Annexin V et EdU images, respectivement et la mesure de l’intensité de l’objet. La figure 3 fournit les images de l’interface utilisateur graphique (GUI) sur le cadre du traitement de l’image.
    3. Mesurer les intensités de fluorescence des OCT4 et EdU sur chaque image.
    4. Indiquez la région tachée avec annexine V avec la méthode de propagation et de quantifier l’intensité de fluorescence.
  4. 3.4. analyse statistique pour visualiser les différents phénotypes cellulaires sur l’imagerie de cellules individuelles
    1. Normaliser les intensités de fluorescence d’entrée de chaque marqueur phénotypique de centrage et de mise à l’échelle de ces variables pour leur donner un poids égal.
    2. Effectuer une analyse de carte (SOM) self-organizing en utilisant un environnement logiciel pour le calcul statistique et graphique tel que décrit par les précédentes études38,39.
      1. Créer 25 nœuds SOM avec distinctif quatre « codebook vecteurs » correspondant à l’intensité fluorescente des quatre marqueurs, DAPI, EdU, annexine V et OCT4.
      2. Assigner des cellules individuelles dans chaque microenvironnement vers un nœud « gagnante » (plus proche) et tracer comme fréquence de cellules, selon lequel les vecteurs codebook du nœud gagnant sont mises à jour à l’aide d’une moyenne pondérée, où le poids est le taux d’apprentissage (en l’occurrence, 0,05 comme valeur par défaut).
        Remarque : Omettre les données de chambres contenant moins de 1 000 cellules, parce que les ensembles de données contenant quelques cellules n’a pas fourni de résultats statistiquement pertinents de SOM.
    3. Effectuer un regroupement hiérarchique sans surveillance avec les valeurs de SOM-nœud en utilisant la méthode de liaison moyenne basée sur la corrélation de Pearson par un regroupement de logiciels40.
    4. Afficher les données de clusters dans le dendrogramme et heatmap41vue (s).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tableaux MACME : conception et fabrication : En combinaison avec la technologie de nanofibres, nous avons utilisé la culture cellulaire microfluidique et dépistage des techniques employées précédemment pour identifier les conditions optimales pour hPSC l’auto-renouvellement ou différenciation35,36 (Figure 1). C’est bien adapté pour l’établissement robustes haut débit basés sur les cel...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole illustre la première méthode de dépistage pour établir un système robuste de la culture pour l’entretien des hPSCs qualifiés. Tout d’abord, nous avons décrit comment préparer une plateforme mettant en vedette divers SEGDA artificiel et cellule ensemencement des densités à l’aide d’un dispositif microfluidique intégré avec un tableau de nanofibres, le tableau MACME. Deuxièmement, quantitative imageur unicellulaires phénotypage était effectué50 pour évaluer les résultats cellulaires ind...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Prof. N. Nakatsuji à SIGEI, Université de Kyoto, pour fournir les cellules ES humaines. Nous remercions également le Prof. A. Maruyama au Tokyo Institute of Technology pour son soutien dans l’utilisation du microscope à force atomique. A été généreusement financé par la société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS ; 22350104, 23681028, 25886006 et 24656502) ; le financement provient également de la nouvelle énergie et Industrial Technology développement Organization (NEDO) et la Fondation de sciences de la vie de Terumo. Le WPI-SIGEI est pris en charge par le monde Premier International Research Centre Initiative (WPI), le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT), Japon. Une partie de ce travail a été soutenue par Kyoto University nanotechnologie Hub et l’installation de Nano-traitement AIST au « Projet de plate-forme de nanotechnologie » parrainé par le MEXT, Japon.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polystyrène (PS)Sigma#182435Mw moyen : 290 000, Mn moyen : 130 000
Polyméthylglutarimide (PMGI)MicroChemG113113
gélatine (GT)SigmaG2625À partir de peau porcine,
le kit d’élastomère de silicone Sylgard 184Doe Corning Toray#1064291L’agent de durcissement PDMS et la base d’élastomère de silicone sont des composants de ce kit.
OpenSCADIl s’agit d’un logiciel d’infographie 3D (http://www.openscad.org/) gratuit utilisé pour concevoir le moule du dispositif microfluidique.
AutoCAD 2014AutodeskIl s’agit d’un logiciel d’infographie 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) utilisé pour la conception du masque utilisé sur la préparation des réseaux de nanofibres.
Imprimante 3D, AGILISTA-3000Keyence
durcissable aux UV, AR-M2KeyenceCeci est utilisé pour l’impression 3D par Agilista.
Acide acétiqueSigma#338826&ge ; 99,99 %
acétate d’éthyleSigma#270989anhydre, 99,8 %
tétrahydrofurane (THF)Sigma#401757
MSP-30TDispositifà vide Machine de pulvérisation magnétron
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811Il s’agit d’une plaque de base en polystyrène sur laquelle le réseau de nanofibres est créé. La taille de cette plaque est généralement de 127,7 x 85,5 mm.
Machine à décharge corona de type pistoletShinko Electric & InstrumentationCFG-500Ce dispositif pratique est utilisé pour générer une couronne pour l’activation de la surface inférieure de la couche PDMS à l’étape 1.5 « Assemblage des réseaux MACME » dans le protocole.
Seringue de 5 mLTerumoSS-05SZ
Aiguille émoussée en acier inoxydable (calibre 23)Nipro#2166Le diamètre extérieur et la longueur sont respectivement de 0,6 et 32 mm.
Alimentation haute tensionTechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, chlorhydrateDojindoW001
N-HydroxysuccinimideSigma#56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning#354277Cette protéine est appelée matrice de gel de membrane basale dans le protocole.
CellAdhere Vitronectine, humaine, solutionSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940Milieu de culture sans nourricier et sans xéno pour l’entretien des cellules humaines ES et iPS
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
Enzyme TrypLE Express (1X), rouge phénolThermo Fisher Scientific#12605028Il s’agit d’une protéase recombinante de type trypsine pour la dissociation des cellules de mammifères adhérentes.
Kit d’imagerie Click-iT EdU avec Alexa Fluor 647 AzidesThermo Fisher ScientificC10086Le marquage fluorescent des cellules proliférantes dans la coloration fluorescente sur plaque a été effectué conformément au manuel du produit de ce kit.
Annexine V, Alexa Fluor 594 conjuguéThermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 Anticorps (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Âne Anti-souris IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875Il s’agit d’un anticorps secondaire utilisé dans la coloration cellulaire fluorescente sur plaque.
ECLIPSE Ti-ENikonIl s’agit d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’un objectif CFI Plan Fluor 4&x ;/0.13 N.A. (Nikon), d’une caméra CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), d’une lampe à mercure (Intensilight, Nikon), d’une platine automatisée XYZ (platine motorisée Ti-S-ER avec encodeurs, Nikon) et de cubes de filtre pour quatre canaux de fluorescence (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5 ; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonIl s’agit d’un logiciel d’imagerie microscopique utilisé pour l’acquisition automatique d’images.
CellProfiler, Version 2.1.0Il s’agit d’un logiciel libre et gratuit pour l’analyse d’images cellulaires (http://cellprofiler.org/).
L’analyse RSOM est effectuée par le package kohonen de ce logiciel. Celui-ci est disponible gratuitement (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0Il s’agit du logiciel de clustering open source (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Le clustering hiérarchique non supervisé est effectué avec ce logiciel.
Java TreeViewCe logiciel open source (http://jtreeview.sourceforge.net/) est utilisé pour visualiser les données de clustering sous forme de carte thermique et de dendrogramme.
Cellule souche embryonnaire humaine H9Banque de cellules souches WiCellWA09
de type A résine

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
  4. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  5. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  6. Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
  7. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  8. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  9. Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
  10. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
  11. Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  12. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
  13. Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
  14. Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
  15. Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
  16. Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
  17. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  18. Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
  19. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
  20. Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
  21. Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
  22. Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
  23. Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
  24. Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
  25. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  26. Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
  27. Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
  28. Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
  29. Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
  30. Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
  31. Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
  32. Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
  33. Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
  34. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  35. Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
  36. Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
  37. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  38. Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
  39. Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
  40. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  41. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  42. Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
  43. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
  44. Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473(2014).
  45. Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
  46. Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
  47. Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
  48. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  49. Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
  50. Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
  51. Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
  52. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
  53. Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).

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