Cet article décrit la méthodologie détaillée pour préparer un tableau microenvironnement cellulaire artificiel multiplexés (MACME) pour le haut débit manipulation physique et chimique cues imitant en vivo microenvironnements cellulaires et à identifier l’environnement cellulaire optimal pour les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) avec le profilage de cellule unique.
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Article de méthode
Fabrication d’un réseau multiplexé microenvironnement cellulaire artificiel
Dans cet article
Résumé
Résumé
Microenvironnements cellulaires se composent d’une variété d’indices, comme des facteurs de croissance, matrices extracellulaires et interactions intercellulaires. Ces signaux est bien orchestré et ils est essentiels à la régulation des fonctions cellulaires dans un système vivant. Bien qu’un certain nombre de chercheurs ont tenté d’enquêter sur la corrélation entre les facteurs environnementaux et les fonctions cellulaires désirées, une grande partie reste inconnue. C’est en grande partie en raison de l’absence d’une méthodologie appropriée pour imiter ces signaux environnementaux in vitroet de tester simultanément les différents signaux environnementaux sur les cellules. Nous rapportons ici une plateforme intégrée de canaux microfluidiques et un tableau de nanofibres, suivie haute teneur unicellulaires analyse, afin d’examiner les phénotypes de cellules souches modifiées par des facteurs environnementaux distincts. Pour illustrer l’application de cette plate-forme, cette étude se concentre sur les phénotypes de renouvellement automatique des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Nous présentons ici les procédures de préparation pour un tableau de nanofibres et de la structure de la microfluidique dans la fabrication d’un tableau du microenvironnement cellulaire artificiel multiplexés (MACME). En outre, les étapes globales de la seule cellule de profilage, cellule souillant avec plusieurs marqueurs fluorescents, imagerie de fluorescence multiples et des analyses statistiques, sont décrites.
Introduction
De1,(hPSCs) des cellules souches pluripotentes humaines2 se renouveler de manière illimitée et se différencient en diverses lignées de tissu, qui pourraient révolutionner le développement des médicaments, thérapies cellulaires, génie tissulaire et la médecine régénérative 3 , 4 , 5 , 6. plats de culture générale et de microplaques, cependant, ne sont pas conçus pour permettre la manipulation précise de cellules physiques et chimiques au niveau cellulaire avec la gamme de nano - de mi....
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Protocole
1. fabrication du tableau MACME
Remarque : Tous les matériaux et les équipements sont répertoriés dans la Table des matières.
-
Préparation de masques pour un tableau de nanofibres et un moule pour une structure de microfluidique
- Créer des images tridimensionnelles (3D) de masques utilisés pour les tableaux de nanofibres et les moules de microfluidique de structures à l’aide de paquets de logiciels 3D-infographie (tableau 1).
Remarque : Les images 3D sont lus et imprimés par une imprimante 3D. Les masques imprimés et la moisissure ont les mêmes dimensions avec des imag....
- Créer des images tridimensionnelles (3D) de masques utilisés pour les tableaux de nanofibres et les moules de microfluidique de structures à l’aide de paquets de logiciels 3D-infographie (tableau 1).
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Résultats
Tableaux MACME : conception et fabrication : En combinaison avec la technologie de nanofibres, nous avons utilisé la culture cellulaire microfluidique et dépistage des techniques employées précédemment pour identifier les conditions optimales pour hPSC l’auto-renouvellement ou différenciation35,36 (Figure 1). C’est bien adapté pour l’établissement robustes haut débit basés sur les cel.......
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Discussion
Ce protocole illustre la première méthode de dépistage pour établir un système robuste de la culture pour l’entretien des hPSCs qualifiés. Tout d’abord, nous avons décrit comment préparer une plateforme mettant en vedette divers SEGDA artificiel et cellule ensemencement des densités à l’aide d’un dispositif microfluidique intégré avec un tableau de nanofibres, le tableau MACME. Deuxièmement, quantitative imageur unicellulaires phénotypage était effectué50 pour évaluer les résultats cellulaires ind.......
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Remerciements
Nous remercions Prof. N. Nakatsuji à SIGEI, Université de Kyoto, pour fournir les cellules ES humaines. Nous remercions également le Prof. A. Maruyama au Tokyo Institute of Technology pour son soutien dans l’utilisation du microscope à force atomique. A été généreusement financé par la société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS ; 22350104, 23681028, 25886006 et 24656502) ; le financement provient également de la nouvelle énergie et Industrial Technology développement Organization (NEDO) et la Fondation de sciences de la vie de Terumo. Le WPI-SIGEI est pris en charge par le monde Premier International Research Centre Initiative (WPI), le ministère de l’édu....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Polystyrène (PS) | Sigma | #182435 | Mw moyen : 290 000, Mn moyen : 130 000 |
| Polyméthylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| gélatine (GT) | Sigma | G2625 | À partir de peau porcine, |
| le kit d’élastomère de silicone Sylgard 184 | Doe Corning Toray | #1064291 | L’agent de durcissement PDMS et la base d’élastomère de silicone sont des composants de ce kit. |
| OpenSCAD | Il s’agit d’un logiciel d’infographie 3D (http://www.openscad.org/) gratuit utilisé pour concevoir le moule du dispositif microfluidique. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | Il s’agit d’un logiciel d’infographie 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) utilisé pour la conception du masque utilisé sur la préparation des réseaux de nanofibres. | |
| Imprimante 3D, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| durcissable aux UV, AR-M2 | Keyence | Ceci est utilisé pour l’impression 3D par Agilista. | |
| Acide acétique | Sigma | #338826 | &ge ; 99,99 % |
| acétate d’éthyle | Sigma | #270989 | anhydre, 99,8 % |
| tétrahydrofurane (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Dispositif | à vide Machine de pulvérisation magnétron | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | Il s’agit d’une plaque de base en polystyrène sur laquelle le réseau de nanofibres est créé. La taille de cette plaque est généralement de 127,7 x 85,5 mm. |
| Machine à décharge corona de type pistolet | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | Ce dispositif pratique est utilisé pour générer une couronne pour l’activation de la surface inférieure de la couche PDMS à l’étape 1.5 « Assemblage des réseaux MACME » dans le protocole. |
| Seringue de 5 mL | Terumo | SS-05SZ | |
| Aiguille émoussée en acier inoxydable (calibre 23) | Nipro | #2166 | Le diamètre extérieur et la longueur sont respectivement de 0,6 et 32 mm. |
| Alimentation haute tension | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, chlorhydrate | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | Cette protéine est appelée matrice de gel de membrane basale dans le protocole. |
| CellAdhere Vitronectine, humaine, solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Milieu de culture sans nourricier et sans xéno pour l’entretien des cellules humaines ES et iPS |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| Enzyme TrypLE Express (1X), rouge phénol | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | Il s’agit d’une protéase recombinante de type trypsine pour la dissociation des cellules de mammifères adhérentes. |
| Kit d’imagerie Click-iT EdU avec Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | Le marquage fluorescent des cellules proliférantes dans la coloration fluorescente sur plaque a été effectué conformément au manuel du produit de ce kit. |
| Annexine V, Alexa Fluor 594 conjugué | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Anticorps (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Âne Anti-souris IgG H& L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | Il s’agit d’un anticorps secondaire utilisé dans la coloration cellulaire fluorescente sur plaque. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | Il s’agit d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’un objectif CFI Plan Fluor 4&x ;/0.13 N.A. (Nikon), d’une caméra CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), d’une lampe à mercure (Intensilight, Nikon), d’une platine automatisée XYZ (platine motorisée Ti-S-ER avec encodeurs, Nikon) et de cubes de filtre pour quatre canaux de fluorescence (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5 ; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | Il s’agit d’un logiciel d’imagerie microscopique utilisé pour l’acquisition automatique d’images. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | Il s’agit d’un logiciel libre et gratuit pour l’analyse d’images cellulaires (http://cellprofiler.org/). | ||
| L’analyse R | SOM est effectuée par le package kohonen de ce logiciel. Celui-ci est disponible gratuitement (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | Il s’agit du logiciel de clustering open source (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Le clustering hiérarchique non supervisé est effectué avec ce logiciel. | ||
| Java TreeView | Ce logiciel open source (http://jtreeview.sourceforge.net/) est utilisé pour visualiser les données de clustering sous forme de carte thermique et de dendrogramme. | ||
| Cellule souche embryonnaire humaine H9 | Banque de cellules souches WiCell | WA09 |
Références
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al.
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Réimpressions et autorisations
