Analyse le rôle des plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique

Summary

Nous présentons ici une méthode expérimentale pour évaluer le rôle des plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique.

Abstract

Multicopie plasmides sont extrêmement abondants chez les procaryotes, mais leur rôle dans l’évolution bactérienne reste mal comprise. Récemment, nous avons montré que l’augmentation en nombre de copies du gène par cellule fournie par plasmides multi-copies pourrait accélérer l’évolution des gènes codés plasmide. Dans ce travail, nous présentons un système expérimental pour tester la capacité de Multicopie plasmides à promouvoir l’évolution des gènes. À l’aide de méthodes simples de biologie moléculaire, nous avons construit un modèle de système où un gène de résistance aux antibiotiques peut être inséré dans Escherichia coli MG1655, dans le chromosome ou sur un plasmide Multicopie. Nous utilisons une approche de l’évolution expérimentale pour propager les différentes souches au titre de l’augmentation des concentrations d’antibiotiques et nous mesurons la survie des populations bactériennes au fil du temps. Le choix de la molécule antibiotique et le gène de résistance est donc que le gène peut seulement conférer résistance grâce à l’acquisition de mutations. Cette approche « évolutionniste al Rescate » fournit une méthode simple pour tester le potentiel des plasmides multi-copies pour favoriser l’acquisition de la résistance aux antibiotique. Dans l’étape suivante du système expérimental, les bases moléculaires de résistance aux antibiotique sont caractérisés. Pour identifier les mutations responsables de l’acquisition de la résistance aux antibiotique nous utilisons profond séquençage de l’ADN des échantillons obtenus à partir de clones et de populations entières. Enfin, pour confirmer le rôle des mutations du gène à l’étude, les reconstituer en arrière-plan parental et tester le phénotype de résistance des souches qui en résulte.

Introduction

La résistance aux antibiotique chez les bactéries est un problème majeur de santé¹. À un niveau fondamental, la propagation de la résistance aux antibiotique chez les bactéries pathogènes est un exemple simple de l’évolution par sélection naturelle^2,3. Autrement dit, l’utilisation d’antibiotiques génère de sélection de souches résistantes. Un problème majeur en biologie de l’évolution, est donc de comprendre les facteurs qui influencent la capacité des populations bactériennes à évoluer de la résistance aux antibiotiques. Expériences de sélection ont émergé comme un outil très puissant ....

Protocol

1. construction du système expérimental codant le gène de résistance aux antibiotiques

Remarque : Ici MG1655 d’e. coli a été utilisé comme la souche réceptrice du gène plasmidique ou chromosomique-codé la résistance aux antibiotiques. Le gène de résistance aux antibiotiques est encodé dans le chromosome ou un plasmide Multicopie dans une souche sinon isogénique (Figure 1).

1. Insertion du gène de résistance aux antibiotiques dans le λ phage intégration site (attB)²⁰ du chromosome de MG1655.
   1. Amplifier 500 PB régions aux deux extrémités ....

Results

Dans nos travaux précédents, on a étudié l’évolution le gène les β-lactamase bla_TEM-1 vers conférant la résistance à la troisième génération de céphalosporines ceftazidime¹² . Ce gène a été choisi parce que, bien que TEM-1 ne confère pas de résistance à la ceftazidime, mutations bla_TEM-1 peuvent élargir l’éventail des activités de TEM-1 d’hydrolyser les céphalosporines comme ceftazidime²⁹. Enzymes de r.......

Discussion

Nous présentons un nouveau protocole combinant biologie moléculaire, évolution expérimentale et profond séquençage de l’ADN visant à examiner le rôle des plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique chez les bactéries. Bien que ce protocole combine les techniques de différentes disciplines, toutes les méthodes nécessaires pour le développer sont simples et peuvent être effectuées dans un laboratoire de microbiologie ordinaire. Les étapes plus critiques dans le protocole sont probablement la c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermocycleur	BioRad	C1000
Électroporateur	BiorRad	1652660
Cuvettes d’électroporation	Sigma-Aldrich	Z706078
NanoDrop 2000/2000c	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Déterminer la qualité de l’ADN en mesurant les rapports d’absorbance 260nm/280nm et 260nm/230nm
Incubateur	Memmert	UF1060
Incubateur (agitateur)	Cole-Parmer Ltd	SI500
Alimentation par électrophorèse	BioRad	1645070	Électrophorèse sur gel d’agarose
Chambre d’électrophorèse	BioRad	1704405	Électrophorèse sur gel d’agarose
Pippettes	Biohit	725020, 725050, 725060, 725070
Pipettes	multicanauxBiohit	728220, 728230, 728240
Lecteur de plaques Synergy HTX	BioTek	BTS1LF
Boucles d’inoculation	Sigma-Aldrich	I8388
Plaques 96 puits	Falcon	351172
LB	BD Difco	DF0446-17-3
LB	agar Fisher scientific	BP1425-500
Phusion Polymérase	Thermo Fisher Scientific	F533S
Gibson Assembly	New England Biolabs	E2611S
Enzymes de réstrication	Fermentas FastDigest
Antibiotiques	Sigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep	Kit Qiagen	27104	Kit d’extraction de plasmides
Wizard Kit de purification d’ADN génomique	Promega	A1120	Kit d’extraction d’ADNg
DNeasy Blood & Kits de tissus	Qiagen	69506	Kit d’extraction d’ADNg
Cuvettes d’électroporation	de Pétri	Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich	D9054
Cryotubes	ClearLine	390701
plaques à 96 puits (-80º ; C stockage)	Thermo Fisher Scientific	249945
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2670	Quantification de la concentration de l’ADN
Agarose	BioRad	1613100	Électrophorèse sur gel d’agarose
50x tampon TAE	BioRad	1610743	Électrophorèse sur gel d’agarose
T4 Polynucléotide kinase	Thermo Fisher Scientific	EK0031
T4 ADN Ligase	Thermo Fisher Scientific	EL0014