Thrombose veineuse profonde induite par stase chez les souris surveillé par échographie de haute fréquence

Thromboembolie veineuse (TEV), qui est composé de thrombose veineuse profonde (TVP) et l’embolie pulmonaire, est la troisième cause de décès d’origine cardiovasculaire après infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral. C’est une affection fréquente qui touche 1 à 2 % de la population, avec une incidence annuelle de 1 500¹. VTE peut conduire à : 1) décès par embolie pulmonaire ; 2) syndrome post-thrombotique, caractérisé par une douleur chronique de jambe, gonflement et ulcérations ; ou 3) hypertension pulmonaire chronique entraînant importants compromis respiratoire chronique. VTE est une maladie multifactorielle et peut résulter de la stase de la circulation sanguine, dommages aux parois des vaisseaux, et/ou hypercoagulation États en raison d’une rupture de l’équilibre entre la coagulation et les systèmes fibrinolytiques, telle qu’elle a été décrite il y a plus de cent ans par Virchow et est connu comme la triade de la Rudolf Virchow.

Parce que dans la plupart des cas, il est impossible d’obtenir des échantillons humains de thrombose veineuse profonde, les chercheurs ont développé des modèles animaux expérimentaux de thrombose veineuse profonde. Plusieurs animaux dont rat²souris³, lapin⁴, porc⁵, chien⁶et primate non humain,⁷ ont été utilisés. Les souris peuvent être génétiquement modifiés et sont l’animal le plus souvent utilisé pour étudier la thrombose veineuse profonde. Toutefois, comme chez tous les animaux, DVT spontanée n'est pas observé chez les souris. Ainsi, des modifications physiques ou chimiques de la paroi veineuse sont utilisées pour créer la thrombose chez la souris. Nous avons déjà utilisé le modèle de chlorure ferrique pour thrombose de la veine cave inférieure (VCI) de souris^8,9,10. Ce modèle a l’avantage de produire efficacement des thrombi occlusifs quelques minutes et peut être utilisé pour étudier le rôle des médicaments anticoagulants et antiplaquettaires au cours de la thrombose veineuse profonde aiguë. Cependant, c’est une procédure terminale. Ainsi, pour étudier la thrombose veineuse profonde aiguë et chronique, la stase est plus adapté. Dans ce modèle, la formation du thrombus est induite par l’interruption complète de la circulation sanguine dans la VCI, l’un des facteurs dans la triade de Virchow pour le développement de la thrombose veineuse profonde. Ce modèle peut être utilisé pour étudier la formation de la thrombose veineuse profonde et de la résolution, qui est un avantage par rapport à la FeCl₃ modèle¹¹.

Nous avons développé une méthode non invasive pour suivre la formation du thrombus et la résolution au fil du temps en utilisant un système de micro-imagerie haute fréquence ultrason¹². Nous avons démontré précédemment que mesure de la thrombose veineuse par échographie est favorablement en corrélation avec thrombus obtenus à l’examen anatomo-pathologique. Dans deux études ultérieures, nous avons confirmé que les mesures obtenues par échographie en corrélation avec le poids du thrombus et zone de thrombus quantifié en histochimie^9,10. Plus important encore, nous avons montré que les ultrasons haute fréquence peuvent être utilisé pour surveiller la formation d’une thrombose veineuse profonde en souris¹². Il peut également servir à quantifier la résolution thrombus de façon non invasive.

Ici, nous allons décrire le protocole permettant la formation de thrombus en utilisant le modèle de souris de thrombose induite par la stase et comment la formation de thrombus peut être surveillée de façon non invasive au fil du temps en utilisant des ultrasons de haute fréquence.

Toutes les procédures ont été approuvées par le Canada Animal Care Comité d’Université McGill Montréal, QC, institutionnel. Tout l’équipement nécessaire est répertorié dans le tableau j’ai.

1. murin (C57BL/6J) Protocole de stase IVC

1. Préparation de la chirurgie
   Remarque : Il s’agit d’une chirurgie de survie et par conséquent, une technique aseptique appropriée doit être suivie à tout moment. Cela inclut en s’assurant que tous les matériaux sont à portée de main, nettoyage et stérilisation des instruments avant et entre utilisation et désignant une zone stérile sur la surface de travail pour tout le matériel stérile.
   1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux et matériel par autoclave. Un stérilisateur de perle de verre suffit stériliser les conseils d’instrument entre les animaux, si plus d’une procédure se faite en une seule fois.
   2. Anesthésier les souris mâles de 8 à 10 semaine vieux C57Bl/6 avec un mélange de 100 % d’oxygène et de 2,5 % isoflurane.
      Remarque : Régler le débit d’oxygène et isoflurane comme nécessaire.
   3. Confirmer anesthetization en pinçant la patte arrière de l’animal entre les orteils avec une pince. Aucune réponse de la pincée n’indique que l’animal est anesthésié.
   4. Administrer un analgésique de libération lente (buprénorphine) par injection sous-cutanée. Donne souris une dose de 1 mg d’analgésique par 1 kg de poids corporel (1 mg/kg).
   5. Placez onguent sur les deux yeux de l’animal à n’assurer aucune cornée dessiccation pendant la durée de la procédure.
   6. Administrer par voie sous-cutanée 0,2 - 0,5 mL de liquide isotonique par 10 g de poids corporel.
   7. Fixer l’animal en place à la table de chirurgie à l’aide de ruban chirurgical. Placer l’animal dans une position en décubitus dorsal pour exposer l’abdomen. Opérer sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie.
   8. Enlever les poils de l’abdomen de la souris en application d’une épilation crème pendant 1-2 min. essuyer la zone abdominale, nettoyer avec de la gaze et l’eau distillée, si nécessaire.
   9. Vous pouvez également enlever les poils de l’abdomen par le rasage avec un rasoir électrique petit.
   10. Stériliser l’abdomen avec Baxedin (Solution de Chlorhexidine Gluconate BP) avant de faire des incisions. Appliquer l’éthanol légèrement avec de la gaze pour éviter la perte de chaleur excessive causée par l’évaporation de l’alcool.
2. Exposition de la veine cave inférieure (VCI)
   1. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, effectuer une laparotomie pour ouvrir la cavité abdominale.
      1. Soulever la peau avec une pince au bas du ventre et de pratiquer une incision verticale parallèle de part et d’autre de la linea alba. Faire l’incision première à gauche ou à droite de la linea alba, selon le caractère gaucher ou droitier de l’opérateur. L’incision est faite loin de la ligne médiane pour aider à l’imagerie par ultrasons, par la suite.
      2. Faire une incision Deuxièmement, horizontale en haut de l’abdomen.
         Remarque : Dès la pénétration dans l’abdomen, la musculature doit être « tentes » et ensuite pénétrée avec des ciseaux chirurgicaux pour éviter tout dommage aux organes abdominaux.
      3. Répétez les incisions verticales et horizontales sur la couche de muscle de l’abdomen de l’animal. N’oubliez pas de la musculature de tente lors de la pénétration dans l’abdomen de manière à ne pas endommager les organes sous.
         ATTENTION : Soulever la peau et des muscles des intestins et autres organes internes en faisant des incisions de manière à ne pas perforer les.
   2. Pliez la peau et le muscle de l’incision pour exposer la cavité abdominale.
   3. Appliquez la gaze, imbibé d’une solution isotonique, aux côtés de l’ouverture de la plaie et externaliser les intestins. Appuyez sur les deux côtés de l’abdomen pour aider l’externalisation de l’intestin. Utilisez des mouvements douces avec un coton-tige pour déplacer les intestins. Tremper la gaze dans une solution isotonique et placez-le sur les intestins externalisés.
      1. Gaze doit être de démaquillage avant le placement sur le tissu.
   4. Écarter toute graisse péritonéale et exposer la VCI entre les veines rénales et iliaques.
   5. Faire une identification initiale des branches latérales évidentes. Une branche latérale apparaît comme plus petite, mais les veines veine importante qui bifurque de la VCI, entre le rein et iliaque. Système vasculaire peut varier considérablement entre les souris. Souris peuvent avoir des branches latérales présentes sur une ou deux faces de la VCI.
3. Ligature des branches latérales
   Remarque : Si les branches secondaires sont présents, la procédure suivante est suivie pour chacun d’eux. Si non présent, passez à l’étape 4 : mise en place de suture Initial en vertu de la VCI. Le site de la ligature de l’IVC sera immédiatement distal par rapport à la veine rénale gauche, indépendamment de la présence de branches latérales.
   1. Effectuer une dissection émoussée sur chaque côté de la branche de côté. Par dissection par clivage est le processus d’ouverture à plusieurs reprises pince émoussée par légère pression, afin de percer le carénage sans endommager les vaisseaux avoisinants.
      Mise en garde : Éviter toute perforation ou d’endommager la veine.
   2. Soulever la branche et passer d’une section de 6-0 de suture en soie sous la veine. Toujours prendre soin quand soulever ou déplacer des bateaux. Il est préférable de saisir la graisse autour des vaisseaux, dans le cas contraire, il y a un risque d’endommager le bateau.
   3. À l’aide de pinces à suture, faire une ligature chirurgicale autour de la branche de côté aide standard noeud chirurgicale liant technique. La ligature complet est faite pour assurer 100 % occlusion de la veine. Utilisez au moins trois lancers liant la ligature est bien fixée.
   4. Répétez l’étape 1.3 pour toutes les branches latérales restantes.
4. Dissection de l’aorte abdominale de la VCI
   1. Effectuer une dissection émoussée autour de la VCI immédiatement distale de la veine rénale gauche. L’aorte abdominale est attaché à l’IVC via le fascia, donc effectuer une dissection émoussée initiale autour de l’IVC et de l’aorte abdominale.
      ATTENTION : Évitez de percer ou d’endommager la veine. Ne pas se rompre ou perforer deux navires. C’est la partie la plus critique de la procédure, avec le plus haut risque de lésion vasculaire.
   2. Continuer à appliquer une légère pression par dissection par clivage jusqu'à ce qu’une fenêtre transparente est prise entre l’aorte et la VCI.
5. Suture et ligature IVC
   1. Passer d’une section de 6-0 la suture soie sous l’IVC et l’aorte abdominale.
   2. Localiser la suture à travers la fenêtre créée entre l’IVC et l’aorte. Forceps permet de tirer la suture et le passer entre l’aorte abdominale et IVC. La suture par fil avec soin, essayant de ne pas tirer/ponction l’IVC et l’aorte abdominale.
   3. Faire une ligature chirurgicale autour de la VCI avec pinces à suture, assurant une occlusion totale de la veine. Encore une fois, faire la ligature immédiatement distale de la veine rénale gauche.
   4. Faire trois lancers de suture pour garantir la ligature.
      Remarque : Il est également possible de passer la suture sous l’IVC et l’aorte avant de séparer les deux comme solution de rechange. Par ailleurs, les sutures de prolène 7-0 peuvent être utilisés pour la ligature des branches secondaires et la VCI.
6. Fermeture de la plaie et soins post-opératoires
   1. Vérifiez que l’aorte abdominale a été laissée sans interruption et que toutes les branches latérales ont été ligaturés. La VCI apparaîtra dilatée distale sur le site de ligature et pas de sang écoulement sera visible.
   2. Replacez toute la graisse péritonéale ainsi que les intestins dans la cavité abdominale.
   3. Refermer la plaie à l’aide de pinces à suture et suture de soie de 6-0. Utiliser une suture en cours d’exécution (simple continue) et veiller à ce que la suture ne sera pas trop serrée. Une suture serrée va se rompre lorsque l’animal se réveille et se déplace autour de sa cage.
      1. Vous pouvez également utiliser les clips PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon ou inox pour refermer les plaies.
   4. Suture de la couche de muscles abdominaux tout d’abord à l’aide de sutures appropriées liant technique.
   5. Répétez la technique de suture pour la peau et vérifier la fermeture de la plaie est suffisante.
      Remarque : Si vous utilisez la même aiguille à suture fil pour plusieurs animaux, stériliser tous les deux dans l’éthanol à 70 % avant chaque utilisation.
   6. Retirer l’animal de gaz anesthésique et les placer dans un incubateur à 34 ° C pendant au moins 30 minutes.
   7. Encore une fois, administrer 0,2 - 0,5 mL de liquide isotonique par 10 g de poids corporel par voie sous-cutanée. Fluides peuvent être donnés dans les jours suivants pour maintenir le poids corporel au stade préopératoire, si nécessaire.
   8. Surveiller l’animal jusqu'à la guérison d’assurer avec succès une intervention et d’évaluer la santé globale de l’animal.
      Mise en garde : S’attendre à une posture voûtée légère pour une procédure invasive comme celui-ci, mais l’animal se comportera normalement dès post-opération de 30 minutes.
   9. Placer l’animal dans sa propre cage et ne le jetez pas avec les autres animaux jusqu'à ce que complètement guéri.
   10. Re-administrer des analgésiques par jour pour jusqu'à 48 h postop.
   11. Placer les aliments sur le plancher de la cage de l’animal tout en récupération. Autres soins spéciaux n’est généralement pas nécessaire.
   12. Examiner la plaie pour la rougeur, l’enflure, ou décharge et tout autre signe d’infection.
   13. Si nécessaire, enlever les sutures après 7-10 jours.
   14. Effectuer l’euthanasie immédiatement si la chirurgie est infructueuse (p. ex. perte dommages et/ou de sang d’important navire) ou animal ne s’améliore pas avec les soins post-opératoires. L’euthanasie est généralement effectuée à postop 48 h. Pour des plus longues expériences, utilisez prolène 7-0 pour ligaturer les branches secondaires et la VCI et sutures Vicryl 5-0 pour fermer la cavité abdominale.
       1. Effectuer l’euthanasie par anesthetization de l’animal dans une induction comme décrit précédemment, sauf à l’isoflurane 5 %. Elle est suivie d’asphyxie avec 100 % de CO₂ tandis qu’anesthésiés.
       2. Après confirmation de l’euthanasie par asphyxie (perte de rythme cardiaque et ne respire pas), effectuer la dislocation cervicale afin d’assurer l’euthanasie complet.

2. protocole d’ultrasons haute fréquence

Remarque : Ce protocole est adapté de la Lady Davis Institute rongeur phénotypage Core SOP pour imagerie par ultrasons haute fréquence. Ce protocole est effectué post-opératoire de 24 h, mais peut être fait plus tôt tant que l’animal répond bien à la chirurgie. Le protocole peut être effectué à tout moment sur des souris saine et est souvent fait de comparer avant et après la chirurgie.

1. Préparation de l’Animal
   1. Placer l’animal dans une chambre à induction et anesthésier l’animal avec un mélange de 100 % d’oxygène et de 2,5 % isoflurane.
   2. Tourner sur la fréquence cardiaque et de surveiller la température. Feu de position chaleur tableau pour réchauffer l’animal au cours de la procédure ci-dessus.
   3. Retirer l’animal de la chambre de l’induction et appliquer du lubrifiant oculaire pour empêcher la dessiccation cornéenne. Placez l’animal sur la plate-forme d’analyse et d’apposer le tube anesthésique à la bouche/nez de l’animal.
   4. Chaud ultrasons gel à 37 ° C et placer le gel sur le ventre de l’animal. Le gel d’échographie est chauffé à l’aide d’un système de chauffage de l’eau que les pompes réchauffent l’eau à travers des bobines qui sont enroulées autour de la bouteille de gel.
   5. Pour les mesures de la fréquence cardiaque (au besoin), mettre le gel de l’électrode sur les 4 électrodes de la plateforme d’analyse et de fixer les pattes de l’animal aux plate-forme/électrodes avec ruban chirurgical. Placer l’animal dans une position en décubitus dorsal pour l’imagerie de la VCI. L’échographie, système d’imagerie comprend une plate-forme d’analyse qui est réchauffée et contient des électrodes pour la surveillance de l’animal.
   6. Pour les mesures de température, mettre le gel de l’électrode sur le thermomètre et insérer dans le rectum de l’animal.
   7. Ajuster la lampe chauffante et isoflurane nécessaires assurer cet animal est confortable, a une respiration entre 30-70 bpm et est maintenu à 37 ° C.
   8. Si nécessaire, raser le ventre de l’animal ou enlever les poils avec la crème dépilatoire. Appliquez pendant 1-2 minutes et essuyez avec une gaze et de l’eau distillée.
      NOTE : Trop de cheveux peut affecter la qualité des images.
   9. Placez la gaze sous ou à côté de l’animal à attraper tout gel échographie excès.
2. Imagerie de l’IVC et Thrombus
   1. Ouvrez le logiciel d’imagerie et commencer une nouvelle étude.
   2. Sélectionnez un transmissent approprié pour l’imagerie. Le transmissent utilisé ici est pour les organes abdominaux (fréquence : 35 MHz, la longueur focale : 12,8 mm).
   3. Consigner toute information pertinente concernant l’animal. Ceci peut inclure l’animal ID, sexe, poids, date de naissance, souche, etc..
   4. Abaisser le transmissent jusqu'à ce qu’il est en contact avec le gel d’échographie sur l’animal.
   5. Commencer la sonde transmissent pour commencer l’imagerie 2D de l’animal. Dans ce mode, les images sont présentées en deux dimensions, dans différentes nuances de gris.
   6. Localiser l’IVC et l’aorte abdominale en déplaçant la plate-forme souris tout au long de le x - et/ou plan-y, tout en déplaçant également le transmissent à travers le plan z.
      NOTE : Sang navires apparaîtra avec leur blanc des murs et du sang à l’intérieur presque noire. L’aorte abdominale va vibrer intensément et ont des parois plus épaisses, tandis que l’IVC aura des murs plus minces et compression/expansion facilement sur l’image de l’écran lorsque le transmissent est déplacé vers le haut et vers le bas. Le site de ligature sera apparent, car la veine va se dilater et de la paroi veineuse viendra à un point. Aucun thrombus formé à l’intérieur sera solide sous échographie et ne compressera pas facilement comme le fait de la paroi veineuse. La veine va compresser seulement au-dessus de la ligature, où aucun thrombus ne se forme.
   7. À localiser l’IVC et le site de la ligature, centrer sur le point focal de l’échographie, afin de réaliser l’image plus précise.
      1. Si l’image est trop sombre pour voir clairement, ajuster le gel et éliminez les bulles d’air avec un coton-tige.
      2. Si nécessaire, inclinez le transmissent 45° à gauche ou à droite et réajuster la plate-forme animale pour discerner la veine. Cela, s’il y a interférence avec le transmissent. Dans ce scénario, la veine doit être photographié à un angle de côté pour éviter la suture.
         NOTE : Brouillage de l’Image est plus souvent causée par des taches sombres de la peau animale, placement de suture plaie pauvres, ou de bulles dans le gel d’échographie.
   8. En utilisant le logiciel, prendre des photos de toutes les structures désirés et effectuer des mesures à l’aide d’outils de mesure. Mesures courantes incluent le thrombus section transversale ou la largeur de l’emplacement de la ligature.
   9. Changer le mode d’imagerie à la vague d’impulsion Doppler pour faire des mesures du débit sanguin. Ce mode permet l’imagerie du flux sanguin vasculaire et la mesure de la vitesse d’écoulement, entre autres variables.
   10. Penchez la plateforme d’analyse pour abaisser l’extrémité postérieure de l’animal.
   11. Changer l’angle et la position du transmissent afin qu’il communiquera avec le gel à un angle de 30° environ de l’extrémité postérieure de l’animal.
   12. Repositionner la plate-forme animale et transmissent. Relocaliser l’IVC et ligature si nécessaire.
   13. Faire des mesures du débit sanguin autour du site de ligature pour confirmer la stase et de prendre toutes les images désirés. Les mesures courantes de la circulation sanguine incluent la vitesse moyenne, vitesse maximale ou la vitesse médiane.
   14. Enregistrez toute les mesures ou les images prises.
3. Récupération de nettoyage et des animale
   1. Soulever le transmissent à position initiale et repositionner la plate-forme animal dans sa position initiale, aussi bien.
   2. Retirer l’excès gel hors l’animal avec de la gaze. Pour ce faire doucement pour que la suture de la plaie ne va pas se rompre.
   3. Retirer le thermomètre du rectum de l’animal et de prendre l’animal hors de la plate-forme.
   4. Placer l’animal dans sa cage et un incubateur de 34 ° C.
   5. Surveiller l’animal jusqu'à la guérison. La procédure est très mineure et non invasif. L’animal va réveiller rapidement. Continuer de surveiller l’animal dans les jours suivants, conformément à l’article 1.6 du présent protocole.
   6. Nettoyer la plate-forme animale avec gaze et désinfectant.
   7. Essuyez le transmissent avec gaze et de l’eau distillée.
      Mise en garde : Nettoyer le transmissent très doucement et uniquement avec l’eau distillée.
   8. Pour le prochain animal, répétez l’étape 2.
      1. Si fait avec tous les sujets, vérifier que toutes les images et les enregistrements ont été enregistrées. Avant de s’éteindre tous les équipements et logiciels.

Modèle de stase veineuse thrombose

Dans le modèle de stase, les souris sont anesthésiés, et une incision est faite pour exposer la veine cave inférieure (VCI). L’incision est faite sur le côté gauche ou droit de la souris au lieu d’une laparotomie médiane d’une manière qui ne porterait pas atteinte avec la sonde d’échographie. Les muscles abdominaux et la peau sont pli arrière pour exposer l’IVC (Figure 1). Tout d’abord, les branches latérales sont ligaturés avec une suture de soie de 6-0 (Figure 2). Ensuite, la VCI est séparée de l’aorte par dissection par clivage et la soie est placée autour de la VCI (Figure 3 a-C). La VCI est ligaturée avec une suture de soie de 6-0. Dilatation de la VCI sous le site de la ligature est une indication de succès interruption du débit sanguin (Figure 3D). Enfin, la cavité péritonéale et la peau sont suturées retour de façon continue (Figure 3E).

Suivi de la formation du thrombus à l’aide de l’échographie

Comme nous l’avons déjà montré, échographie de haute fréquence, qui est couramment utilisée pour évaluer la thrombose veineuse en milieu clinique, peut servir à mesurer la formation du thrombus et la résolution au fil du temps dans un modèle expérimental murin. Nous avons utilisé un système de micro-imagerie haute fréquence12. Avant la ligature, la VCI peut être identifiée dans la vue longitudinale. Après la ligature de la veine, le succès de la procédure peuvent être visualisé. Le mode PW-Doppler peut être utilisé pour déterminer la vitesse d’écoulement de sang avant (34,8 mm/s) et après (5,6 mm/s) la ligature. Thrombus étant plus denses que l’écoulement sanguin, nous avons pu apprécier le thrombus formé à l’intérieur de la VCI à l’aide de l’échographie, 24 heures après la ligature (Figure 4 a). L’échographie permet à la quantification de la vélocité du flux sanguin dans les vaisseaux à l’aide de color Doppler. Comme le montre la Figure 4 b, nous pouvons mesurer le débit dans la veine avant la ligature et apprécier l’interruption de la circulation après la ligature, lorsque le thrombus se forme. Données de notre laboratoire montrent une taille moyenne de thrombus 4,85 ± 0,22 mm2 à 24 heures et 5.05 ± 0,47 mm2 à 48 heures (moyenne ± SEM).

Figure 1. Modèle de stase : procédure pour exposer la veine cave inférieure. (A) cheveux de souris de l’abdomen est supprimée à l’aide de crème dépilatoire. (B) une première incision est faite sur le côté gauche de l’abdomen et une deuxième ventrale (C) de gauche à droite. (D) un regard stérile humide sert à extérioriser les intestins et exposer la veine cave inférieure (VCI) et la branche latérale (SB). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Modèle de stase : procédure pour ligaturer la branche côté. (A) l’exposition de l’IVC et Placement SB. (B) de la soie de suture sous le SB. (C) Ligation de la LRV SB. : veine rénale gauche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3. Modèle de stase : procédure pour ligaturer la veine cave inférieure. (A-B) Par dissection par clivage pour séparer la VCI de l’aorte. (C) mise en place de la soie de suture sous la VCI. (D) la ligature de la VCI. Dilatation de la VCI est observée. (E) les muscles abdominaux et la peau sont fermées séparément. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4. Suivi de la formation du thrombus à l’aide de l’échographie. (A) échographie représentante les images avant, immédiatement après et 24 heures après la ligature de la VCI. (B) les représentants des images de sang coulent représentée par color Doppler de la vitesse à l’aide de traitement des couleurs. Le barème des plages de débit de sang couleur du rouge au jaune pour dépeindre élevé à faible débit. Chez les animaux ligaturés, l’absence de flux est représenté par l’absence de couleur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.