Article de méthode

Une analyse de Microarray de protéine pour détermination sérologique de l’Infection à Clostridium difficile anticorps réponses suivantes spécifiques à l’antigène

DOI :

10.3791/57399

⸱

15 juin 2018

 ,  , 
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

Dans cet article

Résumé

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Cet article décrit une méthode de microarray de protéine simple pour profilage immunité humorale à un panel de 7-plex de hautement purifié des antigènes de Clostridium difficile dans les sérums humains. Le protocole peut être prolongé pour la détermination de la production d’anticorps spécifiques dans les préparations d’immunoglobulines par voie intraveineuse polyclonal.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous fournissons un aperçu détaillé d’un essai de microarray de nouvelle protéine de haut-débit pour la détermination de l’anti -Clostridium difficile taux d’anticorps dans le sérum humain et dans les préparations distinctes de polyclonal immunoglobulines intraveineuses (IgIV). Le protocole décrit les étapes méthodologiques impliqués dans la préparation de l’échantillon, impression de tableaux, mode opératoire et l’analyse des données. En outre, ce protocole pourrait être développé pour intégrer divers échantillons cliniques, y compris le plasma et les surnageants de culture de cellules. Nous montrons comment microarray de protéine peut être utilisée pour déterminer une combinaison d’isotype (IgG, IgA, IgM), de la sous-classe (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) et anticorps spécifiques à la souche hautement purifiée de toute c. difficile les toxines A et B (toxinotype 0, souche VPI 10463, ribotype 087), la toxine B d’une souche exprime c. difficile toxine-B-only (CCUG 20309), une forme de précurseur d’un fragment de B de la toxine binaire, pCDTb, des protéines spécifiques ribotype couche toute la surface (SLPs ; 001, 002, 027) et le contrôle des protéines (tétanos anatoxine tétanique et Candida albicans). Pendant l’expérience, microarrays sont détectés avec des sérums de personnes atteintes d’infection à c. difficile (CDI), personnes atteintes de fibrose kystique (FK) sans diarrhée, témoins sains (HC) et de personnes préalables et post-IVIg thérapie pour la traitement de la CDI, l’immunodéficience combinée trouble et polyradiculopathy démyélinisante inflammatoire chronique. Nous rencontrons en efficacité de neutralisation de la toxine et taux d’anticorps spécifiques multi-isotype des différences significatives entre les groupes de patients, les préparations commerciales d’IgIV et sérums avant et après administration d’IgIV. En outre, il y une corrélation significative entre microarray et immuno enzymatique (ELISA) pour les IgG d’antitoxine dans le sérum. Ces résultats suggèrent que « microarray » pourrait devenir un outil prometteur pour le profilage d’anticorps aux antigènes de C.difficile chez les humains vaccinés ou infectés. Avec plus de raffinement des panneaux de l’antigène et une réduction des coûts de production, nous prévoyons que microréseau technologie peut aider à optimiser et sélectionnez les immunothérapies plus cliniquement utiles pour l’infection à c. difficile d’une manière spécifique au patient.

Introduction

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Ce protocole décrit le développement et la validation d’un test de microarray de protéine originale et personnalisée pour la détection et la quantification semi de souche bactérienne et isotype-spécifiques d’anticorps aux antigènes de c. difficile . Nous utilisons avec succès notre c.difficile-dosage spécifique « microarray » comme un nouvel outil prometteur pour la bioanalyse composition du contenu spécifique d’anticorps dans le sérum du patient1,2, préparations d’IgIV3, et identification des spécificités anticorps qui sont en corrélation avec les mauvais résultats en CDI4. Nous démontrons comment fin des échantillons de sérum et de préparations commerciales d’IgIV peuvent être analysées sur lames microarray, permettant qualité reproductible profilage des réponses anticorps pathogène spécifique c. difficile dans cet essai.

Beaucoup de santé des enfants et d’adultes ont des anticorps IgG et IgA sériques détectables toxines de c. difficile A et B5,6. Ceux-ci sont censés survenir suite à l’exposition transitoire au cours de la petite enfance et après une exposition à c. difficile à l’âge adulte. Pour cette raison, polyclonal IgIV a été utilisé hors AMM pour traiter les récurrentes et fulminante CDI7,8,9. Cependant, son rôle définitif et son mode d’action reste peu clair. Plusieurs études ont montré que la réponse immunitaire humorale aux toxines de Clostridium joue un rôle dans la présentation de la maladie et les résultats. Plus particulièrement, les patients asymptomatiques montrent une concentration accrue de sérum anti-toxine A IgG comparée aux patients qui développent une maladie symptomatique10. Une association démontrable a été rapportée pour médian anti-toxines IgG A des titres et11de la mortalité de toutes causes de 30 jours. Plusieurs rapports ont également révélé une liaison avec une protection contre les réponses anticorps et la récurrence à la toxine A, B et plusieurs antigènes non-toxine (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD et protéines de la couche superficielle (SLPs))12,13 , 14 , 15. ces observations ont stimulé le développement de la première Immunothérapie passive drogue ciblage c. la toxine B (bezlotuxumab), qui a récemment été approuvé par la US Food and Drug Administration et l’européenne des médicaments Agence pour la prévention des renouvelables CDI16. Stratégies de vaccination à l’aide de toxines inactivées ou fragments de toxine recombinantes sont également en cours de développement17,18,19. Ces nouvelles approches thérapeutiques stimulera sans doute l’exigence d’évaluation immunité humorale aux antigènes multiples dans vastes échantillons.

Aujourd'hui, il y a un manque notable d’essais disponibles dans le commerce de haut débit capable de mesurer simultanément la souche bactérienne et isotype-spécifiques d’anticorps aux antigènes de c. difficile . Il y a un besoin de développer ces tests afin de faciliter les efforts de recherche futurs et des applications cliniques. Microarrays de protéine sont une méthode d’immobiliser un grand nombre de protéines purifiées individuellement sous forme de tableau dans l’espace organisé des taches sur une surface microscopique axée sur la diapositive à l’aide d’un système robotisé qui peut être un contact20 ou un sans contact outil d’impression21. Les taches peuvent représenter des mélanges complexes tels que les lysats cellulaires, anticorps, homogénats tissulaires, protéines endogènes ou recombinantes ou peptides, fluides corporels ou médicaments22,23.

Technologie des microréseaux protéine offre des avantages distincts par ELISA interne standard techniques, qui ont traditionnellement été utilisées pour évaluer les réponses en anticorps anti -c. difficile . Il s’agit d’une capacité accrue pour détecter toute une série d’anticorps multi isotype-spécifiques contre un panel plus large de cibles protéiques, exigences de diminution du volume pour les antigènes, les échantillons et les réactifs et une capacité accrue d’intégrer un plus grand nombre de réplicats techniques, en plus du contrôle de qualité interne multiple (QC) mesure1. Puces sont donc plus sensible, précise et reproductible et ont une plus grande gamme dynamique. Ces facteurs rendent les microarrays une alternative meilleur marchée et potentiellement favorable à ELISA pour la détection à grande échelle des protéines connues. Cependant, inconvénients de la technologie des microréseaux résultent principalement des grandes coûts initiaux associés instituant un groupe d’antigènes hautement purifiés et mise en place de la plate-forme technologique.

Microarrays de protéine ont été largement utilisées pendant les deux dernières décennies comme un outil de recherche diagnostique et fondamentales en applications cliniques. Les applications spécifiques comprennent l’expression de la protéine de profilage, l’étude des relations d’enzyme / substrate, dépistage de biomarqueurs, analyse des interactions hôtes-microorganismes et profilage des anticorps spécificité23,24, 25,26,27,28. Nombreux nouveaux pathogènes/antigène de protéine microarrays ont été établis, y compris le paludisme (Plasmodium)29, VIH-1,30,31de la grippe, syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS)32, fièvre hémorragique virale33 , virus de l’herpès34et35de la tuberculose.

Le présent protocole est liée à la mise en place d’un simple fonctionnement C. réactive antigène microarray test difficile , qui permet une quantification exacte, précise et spécifique des multi-isotype et production d’anticorps spécifiques à la souche à C. difficile antigènes dans le sérum et polyclonaux IgIV. Dans les présentes, nous incluons des résultats représentatifs se rapportant à une performance de dosage microarray acceptable par rapport à ELISA ainsi que le dosage de précision et reproductibilité de profils. Ce test pourrait être développé pour définir le profil des autres échantillons cliniques et établit un nouveau standard pour la recherche dans les bases moléculaires de l’IDC.

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Protocole

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1. préparer une plaque de Microarray

  1. Diluer les antigènes de c. difficile avec un tampon d’impression [PBS-Tween-tréhalose (50 mM)] à la concentration optimale (qui a été prédéfinie avant d’exécuter le sérum du patient) : toxines A (200 µg/mL) et B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL) et natif de purifiée SLPs ensemble dérivé ribotypes 001, 002 et 027 (200 µg/mL).
    Remarque : La toxine B proviennent d’une toxine B exprimant la souche CCUG 20309 (90 µg/mL).
    1. Diluer les contrôles positifs, lysats de c. albicanset de l’anatoxine tétanique avec le tampon d’impression à 100 µg/mL. Enfin, diluer l’immunoglobuline humaine purifiée correspondant l’isotype d’anticorps testés en série, en commençant à 50 µg/mL à travers 10 dilutions dans le tampon d’impression pour créer une courbe d’étalonnage.
  2. Transférer 10 µL des dilutions dans le tampon d’impression dans une plaque 384 puits.
  3. Couvrir la plaque avec un joint de la plaque et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.

2. impression tableaux avec un Robot Contact

  1. Chaleur la goupille de silicium à l’aide du brûleur à gaz portatif 3 x 2 s chaque et rincez-les à l’eau claire 3 x 3 s chaque.
  2. Placer la plaque de microarray dans la cartouche de chargement de l’arrayer.
  3. Placez les diapositives aminosilanes sur le plateau de la diapositive.
    Remarque : Le bac de diapositive peut contenir 27 diapositives : trois rangées de neuf diapositives. Les lames sont disposées en orientation portrait à partir de la gauche de la rangée du bas et le reste des espaces sont recouverts de lames vierges pour s’assurer que tous les trous sur la plaque de glissement sont recouvertes.
    1. Appuyez sur OK et vérifiez que le vide a été allumé et toutes les diapositives sont sécurisés. Laissez les diapositives dans l’environnement humide pendant au moins 1 h avant de commencer l’impression.
      NOTE : Les diapositives aminosilanes sont fournis dans un sachet scellé avec déshydratant. Une fois ouvert, aucune diapositive non utilisés doit être retournés immédiatement dans le dessiccateur pour stockage jusqu'à la date d’expiration.
  4. Mettre en place le programme d’impression approprié pour imprimer des antigènes de Clostridium difficile . Lancer l’Application TAS Suite et ouvrez le fichier de paramètres d’exécution impression requis à partir du répertoire « My quadrillant Runs ». Sélectionnez fichier de Clostridium difficile pour imprimer tous les antigènes de Clostridium difficile en quatre exemplaires.
  5. Sur un double-clic sur l’icône « microarray » sur la fenêtre principale une fenêtre dotée de trois onglets apparaîtront appelé « MicroArraying des paramètres ».  Les trois onglets sont « Source », « Cible » et « Options ». L’onglet « Source » montre les détails du nombre d’échantillons utilisés dans la plaque « microarray ». L’onglet « Cible » montre les détails de comment les diapositives doivent être chargés, lorsque le tableau doit être imprimé sur la diapositive et modifier la disposition de diapositive (16 sous-tableau formats). L’onglet « Options » affiche les détails du protocole de lavage et outil pour être utilisé par exemple. laver après chaque exemple terminé. Nettoyez la tige de silicone entre les échantillons afin d’éviter toute contamination croisée entre les différents échantillons.
  6. Les options de programmation sont situées sous Options > Préférences exécuter dans la barre d’outils de TAS Application Suite. Il y a 9 onglets à travailler par le biais de cette section et que vous complète un onglet passer à la suivante en cliquant dessus. En cliquant sur le le bouton « OK » vous emmènera hors « Préférences de Run ». Dans l’onglet « Général » des préférences « Run », il y a un certain nombre de cases à cocher disponibles en vertu du présent article relatives à la façon dont l’instrument comportera lorsqu’un programme est démarré. Cochez la case « Bain premier avant le début de la course », toutes les stations de lavage trois feront l’objet d’une séquence d’amorçage court avant le début d’exécution. Cochez la case « Laver en début de course », l’outil de NIP est lavé avant la visite de la première source. Cochez « Lavage à la fin de course », l’outil de NIP est lavé après visite de la dernière source. L’utilisateur peut définir le nombre de cycles de lavage. Dans l’onglet « Climat » des préférences « Run », commencer l’humidification. Le réglage que nous utilisons sont les suivantes : commencer le taux de 55 %, exécutez taux de 55 %, humidité minimum 55 %, cible humidité 60 %. Ne commencez pas la course jusqu'à ce que l’humidité de l’objectif a été atteint, sinon les taches sera la bonne taille et la bibliothèque va s’évaporer rapidement.
  7. Dans la barre de menu de TAS, cliquez sur le bouton go vert.  Lancer l’exécution et observer régulièrement l’arrayer pendant le tirage pour être certain que tout est OK.
    Remarque : Cela permet l’analyse des 15 échantillons en parallèle sur chaque diapositive comme un sous-tableau est utilisé comme contrôle négatif. La conception des sous-tableaux est déterminée par le nombre des imprimés protéines (antigènes) et le numéro de l’imprimé biologique réplique.
    Remarque : Après l’impression de chaque échantillon, la tête se déplace vers les bains de lavage pour permettre plusieurs trempage de l’axe dans les deux bains de lavage contenant de l’eau distillée et 0,002 % Tween-20 à 1. 5 s dans chaque bain, suivie de rinçage la tige avec de l’eau ultra pure et séchage de la goupille en la station de lavage principal pour 4 s.

3. stockage des tableaux

  1. Garder les diapositives imprimées conservées une nuit à température ambiante dans un dessiccateur.
    Remarque : Les diapositives imprimées peuvent être stockés pendant une semaine.

4. tableau de palpage

  1. Placer soigneusement les diapositives imprimées dans un support de diapositive de format 16 chambres multipuits.
    Remarque : Les chambres, ayant une profondeur d’environ 7,5 mm, fournissent une surface généreuse au rapport de volume pour faciliter le mélange et étapes de lavage.
  2. Tous les réactifs laisser se réchauffer à température ambiante avant utilisation. Sauf indication contraire, effectuez toutes les opérations suivantes à la température ambiante.
  3. Ajouter 100 µL d’interpolation de 5 % d’albumine sérique bovine filtrée (BSAT ; utiliser un filtre de seringue 0,2 µm) pour chaque bloc, couvrir les diapositives et les incuber sous agitation pendant 1 h.
  4. Laver les diapositives 5 x 1 min chacun dans 120 µL de tampon phosphate salin avec Tween 20 (PBST ; 0,1 % Tween) / puits avec agitation. Ne laissez pas les diapositives dessécher.
  5. Décongeler les échantillons de sérum sur la glace pendant 20 min et diluer chaque échantillon avec un anticorps disponible dans le commerce en diluant avec fond réduisant le composant (voir Table des matières).
    1. Optimiser la dilution des échantillons de sérum selon l’immunoglobuline testé comme indiqué dans le tableau 2.
  6. Transférer 100 µL des échantillons de sérum dilué dans tous les blocs sauf un, qui sera utilisé comme témoin négatif ; à ce bloc, ajouter 100 µL d’anticorps diluant uniquement. Incuber les lames avec une agitation modérée pendant 1 h.
  7. Laver les diapositives 5 x 3 min chacun dans 120 µL de PBST (0,1 % Tween) / puits avec agitation.
  8. Ajouter 100 µL d’un anticorps anti-humain de chèvre biotinylé dilué avec le diluant d’anticorps.
    1. Optimiser la dilution de l’anticorps secondaire selon l’immunoglobuline testé comme décrit dans le tableau 2. Couvrir les diapositives et les incuber avec agitant doucement pendant 1 h.
  9. Laver les diapositives 5 x 3 min chacun dans 120 µL de PBST / puits avec agitation.
  10. Ajouter 100 µL de streptavidine Cy5 à chaque bloc dilué à 1 : 2000 à 5 % de BSA. Couvrir les lames d’aluminium pour les protéger de la lumière tout en agitant pendant 15 min avec agitation douce.
  11. Laver les diapositives 5 x 1 min chacun dans 120 µL de PBST / puits avec agitation, suivie de 2 lavages de 1 min chacun dans du PBS seulement avec agitation.
  12. Faites tourner les lames pendant 5 min à 300 g pour les faire sécher.
  13. Garder les lames dans une boîte sombre pour le transport et le stockage à température ambiante.
  14. Aller de l’avant pour analyser les tableaux immédiatement pour garantir la cohérence de signal après sondage.
    Remarque : Cependant, sondées diapositives peuvent être conservés dans l’obscurité et scannés sous une semaine à sonder.

5. les tableaux d’analyse

  1. Allumer le scanner au laser (voir Table des matières) 30 min avant de les numériser pour réchauffer le laser. Télécharger le logiciel du scanner et de connecter l’ordinateur au scanner.
  2. Placez une lame avec le visage de face imprimée vers le haut dans le scanner jusqu'à ce que le jeu lumineux devient vert.
  3. Appuyez sur le bouton paramètres et ajustez les paramètres suivants lors de la numérisation des diapositives comme suit : Scan Mode, médiane ; Acquisition, 635 Mode d’acquisition, manuel ; Gain, 20 ; Puissance, faible ; Chariot Type, diapositive sans étiquette ; Mise au point, mise au point automatique. Désactiver le défilement automatique et affectez Barcode Reading Pixel taille 10 et 35 Scan.
  4. Enregistrer les images qui en résultent comme en niveaux de gris 16 bits format TIFF image multiple. Appuyez sur le bouton Importer la grille , puis sélectionnez la liste de tableau approprié.
    NOTE : La liste de tableau décrit la taille et la position des sous-tableaux ainsi que les noms des substances imprimés associées à chaque indicateur de fonctionnalité.
    1. Aligner la grille pour les taches sur la lame.
  5. Analyser les images en appuyant sur le bouton le processus de Quantification pour mesurer l’intensité de signal de fluorescence de chaque spot et enregistrer les résultats dans un format de texte appelé GenePix résultats (GPR).
    Remarque : Le fichier GPR contient les variables localisation et identification des cibles antigène sur le tableau et l’intensité de la fluorescence médian et le contexte local qui représente la liaison de l’anticorps signalent les valeurs de chaque spot.

6. analyse de données

  1. Calculer la médiane pour les répétitions de chaque antigène après soustraction de fond à l’aide d’un logiciel d’analyse microarray gratuit appelé analyseur de phase inverse protéine tableau (RPPA), un module dans le langage statistique R CRAN36.
  2. Tracer la courbe d’étalonnage et d’interpoler les signaux de chaque antigène par rapport à la courbe d’étalonnage à l’aide de graphiques scientifiques commerciales et des logiciels de statistiques (voir Table des matières) pour calculer le taux d’anticorps immunoglobulines.

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Résultats

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La figure 1 illustre un organigramme décrivant les principales étapes dans le protocole décrit. La figure 2 montre des essais de corrélation de Spearman démontrant l’important accord entre microarray et ELISA IgG et IgA anti-toxine A et B niveaux dans le sérum de patients test. La figure 3 montre classe-anticorps IgG et IgA différentielle d’anticorps spécifiques à la toxine A et la toxine B toxine bi...

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Discussion

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Dans ce protocole, nous avons montré que « microarray » est une plate-forme appropriée pour définir l’immunité humorale aux antigènes de protéines de c. difficile dans le sérum du patient (Figures 3 et 6) et les préparations commerciales d’IgIV (Figure 5). Nous avons aussi démontré que la technique de microarray effectue bien par rapport aux classique ELISA (Figure 2) et montre excellente reproductibilité, avec variabil...

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Remerciements

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Cette recherche a été financée par une bourse Hermes à Ola Negm et Tanya Monaghan et grâce à un financement séparé depuis le Centre de maladies digestives de Nottingham et NIHR Nottingham digestif maladies Centre de recherches biomédicales.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BioRobotics MicroGrid II arrayerDigilab, Malborough, MA, États-Unis n/aArray de contact utilisé pour le repérage automatisé des antigènes sur les lames.
Scanner InnoScan 710.InnopsysN/AUn scanner de lames à microréseau fluorescent avec un laser rouge (Cy5) pour lire la réaction.
Logiciel MAPIX version 7.2.0InnopsysN/AMesurer l’intensité du signal des spots.
Broche de contact en siliciumParallel Synthesis TechnologiesSMT-P75Imprimez les échantillons sur les lames.
Dessiccateur Thermo Scientific NalgeneThermo Scientific 41102426Pour stocker les lames neuves et imprimées.
Plaque à 384 puitsGenetixX7022UNPour préparer les antigènes.
Couvercle de plaqueSigma Aldrich, Royaume-UniCLS6570-100EAPour réduire l’évaporation des échantillons.
Glissières aminosilaneSchott,  ; Allemagne1064875La lame de choix pour l’impression des antigènes.
Supports de lamesGraceBio Labs, États-Unis204862Divisez les lames en 16 sous-tableaux identiques. Ces supports sont des puits réutilisables, amovibles et étanches.
Lysat de Candida albicansNIBSCPR-BA117-SContrôle positif
l’anatoxine tétanique  ;Athènes Recherche et technologie04/150Contrôle positif
Immunoglobuline G (IgG), Plasma humain normal  ; Recherche à Athènes et  ; Technologie  ;   ;16-16-090707Immunoglobuline G humaine native purifiée IgG, plasma humain.
Immunoglobuline G1 (IgG1), plasma humain normal  ; Recherche à Athènes et  ; Technologie  ;   ;16-16-090707-1Immunoglobuline humaine native G1 IgG1, plasma humain.
Immunoglobuline G2 (IgG2), plasma humain normal  ; Recherche à Athènes et  ; Technologie  ;   ;16-16-090707-2Immunoglobuline humaine native G2 IgG2 purifiée, plasma humain.
Immunoglobuline G3 (IgG3), plasma humain normal  ; Recherche à Athènes et  ; Technologie  ;   ;16-16-090707-3Immunoglobuline humaine native G3 IgG3 purifiée, plasma humain.
Immunoglobuline G4 (IgG4), plasma humain normal  ; Recherche à Athènes et  ; Technologie  ;   ;16-16-090707-4Immunoglobuline humaine native G4 IgG4, plasma humain.
Immunoglobuline A (IgA), plasma humain  ; Recherche à Athènes et  ; Technologie  ;   ;16-16-090701Immunoglobuline A (IgA) humaine native purifiée, plasma humain.
Immunoglobuline A1 (IgA1), plasma du myélome humain  ; Recherche à Athènes et  ; Technologie  ;   ;16-16-090701-1MImmunoglobuline A1 humaine native purifiée (IgA1), plasma humain.
Immunoglobuline A2 (IgA2), plasma du myélome humain  ; Recherche à Athènes et  ; Technologie  ;   ;16-16-090701-2MImmunoglobuline A2 humaine native purifiée (IgA2), plasma humain.
Immunoglobuline M (IgM), plasma humain  ; Recherche à Athènes et  ; Technologie  ;   ;16-16-090713Immunoglobuline M humaine native purifiée (IgM), plasma humain.
Anticorps anti-IgG humains de chèvre biotinylée, spécifique de la chaîne gammaVector Labs BA-3080L’anticorpsanti-IgG humain de chèvre (spécifique de la chaîne gamma)-biotine réagit spécifiquement avec les IgG humaines, mais pas avec d’autres immunoglobulines.
Souris Anti-Humain IgG1 Charnière-BIOTSouthern Biotec9052-08  ;L’anticorps anti-IgG1 de la biotine de chèvre réagit spécifiquement avec les IgG1 humaines, mais pas avec d’autres immunoglobulines.
souris anti-humaine IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08  ;   ;L’anticorps anti-IgG2-biotine humaine de la chèvre réagit spécifiquement avec les IgG 2 humaines, mais pas avec d’autres immunoglobulines.
Souris Anti-Humain IgG3 Charnière-BIOTSouthern Biotec9210-08  ;   ;   ;L’anticorps anti-IgG3-biotine humaine de chèvre réagit spécifiquement avec les IgG3 humaines, mais pas avec d’autres immunoglobulines.
souris anti-humaine IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08  ;   ;L’anticorps anti-IgG-biotine humaine de chèvre réagit spécifiquement avec les IgG humaines, mais pas avec d’autres immunoglobulines.
IgA anti-humaines, spécifiques de la chaîne alpha, fabriquées chez la chèvre - BiotinylatedVector LabsBA-3030L’anticorps anti-IgG -biotine de chèvre réagit spécifiquement avec les IgG humaines mais pas avec d’autres immunoglobulines.
Souris anti-IgA1-BIOT humaineSouthern Biotec9130-08L’anticorps anti-IgG-biotine humaine de la chèvre réagit spécifiquement avec les IgG humaines, mais pas avec d’autres immunoglobulines.
souris anti-humaine IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08  ;   ;L’anticorps anti-IgG-biotine humaine de chèvre réagit spécifiquement avec les IgG humaines, mais pas avec d’autres immunoglobulines.
Souris Anti-Humain IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08  ;L’anticorps anti-IgG-biotine humaine de chèvre réagit spécifiquement avec les IgG humaines, mais pas avec d’autres immunoglobulines.
Filtre à seringue de 0,2 mmThermo scientific723-2520Filtre à 5 % BSA.
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma Aldrich, UKA7284Utilisez 5 % BSA pour bloquer les lames.
Diluant d’anticorpsDako, UKS3022Pour diluer le sérum et l’anticorps secondaire.
Streptavidin Cy5eBioscienceSA1011Détection de la réaction immunitaire.
Toxines A et B de C. difficile entières purifiées (toxinotype 0, souche VPI 10463, ribotype 087)Groupe des toxines, Public Health EnglandNA
Toxine B entière purifiée (CCUG 20309 toxine B exprimant uniquement la souche)Groupe des toxines, Public Health EnglandNA
Forme précurseur du fragment B de la toxine binaire, pCDTbUniversité de Bath  ;NAProduit chez E. Coli à partir d’une construction génique recombinante entièrement synthétique. Séquence d’acides aminés basée sur la séquence publiée du ribotype 027 (http :www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Protéines de couche superficielle spécifiques du ribotype entier natif purifié (001, 002, 027)Université de Dublin City  ;
Vigam (préparation IVIg 1)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Privigen (préparation IVIg 2)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Intratect (préparation IVIg 3)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
de NA

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
  2. Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
  3. Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
  4. Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31(2017).
  5. Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
  6. Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
  7. Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
  8. Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
  9. Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
  10. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
  11. Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
  12. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
  13. Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
  14. Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
  15. Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
  16. Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
  17. Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
  18. Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
  19. Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
  20. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  21. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
  22. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21(2013).
  23. Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
  24. Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
  25. Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
  26. Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
  27. Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
  28. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
  29. Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
  30. Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
  31. Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529(2011).
  32. Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
  33. Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580(2015).
  34. Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842(2013).
  35. Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349(2015).
  36. Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
  37. Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452(2013).
  38. Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
  39. Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
  40. Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).

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