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Article de méthode

Entier-Montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification Neuro-vasculaire et la Distribution de cellules immunitaires

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DOI :

10.3791/57406

⸱

29 mars 2018

 ,  , 
1Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Genetics and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Earle A. Chiles Research Institute, Robert W. Franz Cancer Center, Providence Portland Medical Center

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une méthode d’imagerie de haute résolution entier-montent dans la peau d’oreille de souris adulte entier, qui nous permet de visualiser la ramification de la morphogenèse et structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que distribution de cellules immunitaires.

Résumé

Nous présentons ici un protocole d’une peau d’oreille d’adulte entier-montent d’imagerie technique pour étudier la morphogenèse de ramification neuro-vasculaire tridimensionnelle complète et structuration, ainsi que distribution de cellules immunitaires au niveau cellulaire. L’analyse des structures anatomiques nerveuses et des vaisseaux sanguins périphériques dans les tissus adultes fournit un aperçu de la compréhension du câblage neuro-vasculaire fonctionnelle et la dégénérescence neuro-vasculaires dans certaines pathologies telles que la cicatrisation des plaies. Comme système modèle hautement instructif, nous avons concentré nos études sur peau d’oreille d’adulte, qui est facilement accessible pour la dissection. Notre protocole simple et reproductible fournit une description précise des composants cellulaires de la peau entière, tels que les nerfs périphériques (axones sensoriels, axones sympathiques et les cellules de Schwann), des vaisseaux sanguins (cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses vasculaires ) et des cellules inflammatoires. Nous croyons que ce protocole préparera le terrain pour enquêter sur des anomalies morphologiques dans les nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que l’inflammation dans la peau de l’oreille d’adulte dans des conditions pathologiques différentes.

Introduction

La peau se compose de trois couches : épiderme, derme et hypoderme. Il a servi comme modèle pour étudier les cellules souches entretien, différenciation et morphogenèse en développement ainsi que la régénération, tumorigenèse et l’inflammation chez les adultes. La peau est richement vascularisée et innervée tels que le développement du système nerveux périphérique et du système vasculaire est bien coordonné.

Nous avons déjà démontré une technique d’imagerie entier-Montez la peau embryonnaire avec étiquetage multiples pour l’étude des nerfs périphériques intacts et les vaisseaux sanguins, y compris leurs composants cellulaires1,2,3, 4: axones sensoriels, axones sympathiques, Schwann dans les nerfs, les cellules, les cellules endothéliales, péricytes et cellules de muscle lisse vasculaire (CMLV) dans les vaisseaux sanguins. Au cours de l’angiogenèse, un premier réseau capillaire subit un remodelage vasculaire intense et se développe en un réseau de ramification vasculaire hiérarchique. Dans le derme en développement/hypoderme, artères branche aux côtés des veines et des nerfs sensoriels périphériques puis forment adjacentes aux artères. Une fois le réseau vasculaire hiérarchique est complètement recouvert de CMLV, nerfs sympathiques s’étendent le long et innervent le grand diamètre des vaisseaux sanguins1,5,6. Malgré l’importance de l’association étroite entre les développement des systèmes nerveux et vasculaires, une question importante a consisté à aborder ce qui se passe aux réseaux neuro-vasculaires dans diverses situations pathologiques chez l’adulte. Une imagerie de haute résolution en trois dimensions est nécessaire pour apprécier la pathogenèse, ainsi que de la morphogenèse ramification reconnaissable anatomiquement et structuration.

Morphogenèse neuronale et vasculaire dans la peau de souris adulte est couramment analysée par la coloration de la section de tissu. D’autres études ont utilisé entier-Montez l’imagerie de la peau pour visualiser les nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, en plus les follicules pileux, glandes sébacées et arrecteur pili muscles7,8,9. Cependant, l’épaisseur de la peau adulte a rendu difficile analyser la peau dans son ensemble de la profondeur.

Dans la présente étude, nous avons développé une nouvelle imagerie haute résolution d’entier-montent de peau d’oreille d’adulte pour surmonter ces difficultés. Peau de l’oreille est facilement accessible pour la dissection et l’imagerie entier-Montez subséquent de la peau sur l’ensemble de la profondeur. Ainsi, c’est une méthode simple et hautement reproductible qui peut être appliquée pour comparer l’architecture tridimensionnelle des systèmes nerveux et vasculaires périphériques dans la peau, avec des mesures de quantification globale. Nous avons démontré que l’alignement des nerfs sensitifs et sympathiques périphériques avec grand diamètre des vaisseaux sanguins est préservée dans la peau de l’adulte. Le but du présent protocole est de visualiser la ramification de la morphogénèse et la structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que la distribution des cellules immunitaires au niveau cellulaire dans les modèles de souris adulte dans diverses conditions telles que l’inflammation et régénération.

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Protocole

Toutes les expériences dans cette section ont été effectuées en vertu de l’approbation de la National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI) et animalier Comité d’urbanisme.

1. adult Mouse Ear peau Collection

  1. Euthanasier des souris adultes par l’exposition de dioxyde de carbone (CO2) dans une chambre fermée, puis vérifiez l’euthanasie par dislocation cervicale.
    Remarque : L’expérience fait suite à la recommandation de la National Institutes of Health (NIH) pour la méthode d’euthanasie.
  2. Disséquer l’oreille de la base et le placer dans un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri contenant 2 mL de Hank Balanced Salt Solution (HBSS). Brièvement couper les poils avec des ciseaux.
  3. Peler la peau postérieure et antérieure peau loin soigneusement de cartilage intermédiaire.
    Remarque : Le Cartilage s’attache à la peau antérieure.
  4. Transférer la partie postérieure et antérieure peau séparément à un 24 puits plaque contenant 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % frais glacé (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par puits. Aplatir la peau postérieure et antérieure sous les 4 % PFA.
  5. Fixer la peau postérieure et antérieure avec cartilage à 4 ° C pendant 1 h.
  6. Laver la peau postérieure et antérieure 3 fois pendant 5 min dans 1 mL de PBS avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.
  7. Transférer la peau postérieure et antérieure avec cartilage au fond d’un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri. Couper la base région, qui est pliée et a des tissus adipeux et les tissus conjonctifs. Décollez le cartilage de peau antérieur avec une pincette courbée fine.
  8. Retirez soigneusement les poils, les tissus adipeux et les tissus conjonctifs de l’intérieur de la peau postérieure à l’aide de la pincette courbée fine. Garder la peau humide avec du PBS.

2. entier-Montez Immunohistochemical souillant de peau d’oreille de souris

Remarque : Toutes les expériences dans les sections suivantes ont été effectuées selon les directives de sécurité de laboratoire de NIH.

  1. Préparer le tampon de blocage. Sérum de chèvre filtre chaleur 10 % inactivé (HIGS) dilué dans du PBS avec 0,2 % triton de tampon de blocage de X-100 (TX-100), ou 10 % de sérum d’âne (DS) dilué dans du PBS avec 0,2 % de tampon de blocage TX-100, à l’aide d’un filtre de 0,45 µm.
  2. Transférer la partie postérieure et antérieure peau à un 24 plaque bien contenant 1 mL de tampon de blocage de HIGS 10 % ou 10 % tampon de blocage DS / puits. Incuber la peau pendant 30 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.
  3. Préparer la solution d’anticorps primaire en diluant l’anticorps primaires (Table des matières) dans un tampon bloquant (soit 10 %, soit 10 % HIGS DS).
    NOTE : Ensemble-mout immunohistochemical analyse de peau d’oreille d’adulte avec des anticorps de classe de neurone-spécifique de marqueurs pan-neuronale III β-tubuline (Tuj1, IgG ou souris lapin polyclonal monocloncal IgG2a, dilution de 1/500 à la concentration finale de 2 µg/mL), molécule d’adhésion cellulaire endothéliale Pan-endothélial marqueur plaquettes 1 (PECAM-1, hamster monoclonale IgG, dilution de 1 : 300 à la concentration finale de 3,3 µg/mL), la protéine basique de la myéline de marqueur de gaine de myéline (MBP, lapin IgG polyclonaux, dilution de 1 : 200 à la concentration finale de 5 µg/mL) et un marqueur inflammatoire cellulaire myéloïde CD11b (Rat monoclonal IgG2b, 01:50 dilution à une concentration finale de 20 µg/mL) a été montré dans la Figure 1 et Figure 2. La peau a été incubée avec l’anticorps conjugué Cy3 pour le muscle lisse vasculaire marqueur α muscle lisse actine cellulaire (αSMA) ainsi que des anticorps secondaires (2.6). Les anticorps primaires testées par nous-mêmes ne figuraient dans la Table des matières. Les anticorps primaires multiples provenant de différentes espèces peuvent être mélangées en même temps.
  4. Transférer la peau postérieure et antérieure à nouveau puits contenant 150 µL de la solution d’anticorps primaires. Incuber la peau avec un mélange doux sur une table de mixage à 4 ° C durant la nuit.
  5. Le lendemain, la peau de la partie postérieure et antérieure de transfert de nouveaux puits dans la plaque 24 puits ou aspirer le tampon de blocage contenant des anticorps primaires. Ajouter 1 mL de soit 2 % HIGS dilué dans du PBS avec du tampon de lavage pour le TX-100 0,2 % ou 2 % DS dilué dans du PBS avec du tampon de lavage pour le TX-100 0,2 %. Laver la peau avec 3 changements de la mémoire tampon de lavage toutes les 15 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.
  6. Préparer la solution d’anticorps secondaire (Table des matières). Diluer l’anticorps secondaires dans le tampon de blocage (soit 10 % HIGS ou 10 % DS) et filtre le tampon de blocage contenant des anticorps secondaires à travers un filtre de seringue en membrane 0,22 µm polyvinylidène difluoride (PVDF) relié à une seringue de 1 mL.
    NOTE : Alexa 488 ou chèvre 633-conjugués du anti-lapin IgG (H + L) ou IgG2a de souris pour Tuj1, anti-hamster de chèvre Alexa 647 Conjugué IgG (H + L) pour chèvre PECAM-1, conjugué Alexa 488 du anti-lapin IgG (H + L) pour MBP, et rat Alexa 594 Conjugué IgG (H + L) pour CD11b servaient avec la dilution de 1/250 à la concentration finale de 8 µg/mL. La peau est incubée avec un anticorps conjugué Cy3 αSMA (dilution 1/500 à la concentration finale de 2 à 3 µg/mL) en combinaison avec ces anticorps secondaires.
  7. Centrifuger la solution à 13 000 x g pendant 10 min enlever les particules agrégées de l’anticorps secondaires de la mémoire tampon de blocage.
    Remarque : Les types d’anticorps secondaires conjugués fluorescents provenant de différentes espèces peuvent être mélangées en même temps.
  8. Transférer la peau postérieure et antérieure à cupule contenant 150 µL de la solution d’anticorps secondaires. Enrouler la plaque 24 puits dans du papier aluminium pour éviter la lumière et incuber la peau pendant 1 h avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.
  9. Transférez la peau postérieure et antérieure aux nouveaux puits de la plaque 24 puits ou aspirer la solution d’anticorps secondaire en pipette complètement. Ajouter 1 mL de tampon de lavage HIGS 2 % ou 2 % tampon de lavage DS.
  10. Enrouler la plaque 24 puits dans du papier aluminium et laver avec 3 changements de la mémoire tampon de lavage toutes les 15 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.

3. montage de la peau de l’oreille de la diapositive

  1. Placez la peau sur le fond d’un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri. Retirez soigneusement les poils, les tissus adipeux, les tissus conjonctifs, poussières et les fibres à l’intérieur de la peau à l’aide de fine pince courbée sous stéréomicroscope avec faible éclairage afin de minimiser la grande photo de blanchiment. Garder la peau humide avec du PBS.
  2. Transférer la peau à une lame de microscope adhésif avec une pincette. Placez la peau postérieure et antérieure avec l’intérieur vers le haut sur la diapositive. Aplatir la peau à l’aide de pinces.
  3. Montez la peau dans un milieu liquide anti-fondu montage pour éviter le photoblanchiment et préserver les signaux fluorescents. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est sur ou autour de la peau.
  4. Couvrir avec une lamelle couvre-objet sur les échantillons de peau soigneusement et entreposer les diapositives échantillon de peau monté dans la nuit sombre à température ambiante pour permettre que le support de montage se ferme. Sceller la lamelle couvre-objet de la diapositive avec vernis à ongles et conserver à 4 ° C pour le stockage à long terme.

4. confocal Microscopy

  1. Mettre en place des lasers pour fluorophores. Un microscope confocal avec trois sources laser (Argon 488 nm, DPSS 561 nm et HeNe 633 nm) est utilisé dans cette expérience.
  2. Utilisez l’outil de balayage séquentiel, qui excite en même temps les échantillons colorés à triple, pour éviter et réduire les chevauchements.
    NOTE : Images seront prises de manière séquentielle, en utilisant le mode de balayage séquentiel.
  3. Image sous un objectif 10 X. Utilisez l’outil d’analyse de tuile pour capturer la peau toute oreille. La valeur de Z-pile et s’assurer que la position z couvre toute l’épaisseur de la peau de l’oreille.

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Résultats

Souris adulte oreille postérieure (Figure 1 a) et peaux oreille antérieure (Figure 1 b) ont été immunomarquées avec anticorps anti-αSMA (rouge), Tuj1 (vert) et PECAM-1 (bleu). Peau postérieure a été immunomarquées pour étudier la distribution de neuro-immunitaire à l’aide d’anticorps anti-CD11b (rouge) et MBP (vert), ainsi que Tuj1 (bleu) (Figure 2 a). Distribution de CD11b+ des cellules i...

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Discussion

Ce protocole décrit l’imagerie immunonohistochemical entiers de peau d’oreille d’adulte pour l’analyse des structures neuro-vasculaires et de la distribution de cellules immunitaires. Nous croyons que cette méthode a de nombreux avantages expérimentales aux chercheurs d’étudier la ramification de la morphogénèse et la structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que la répartition en trois dimensions des composants de peau y compris les cheveux et les cellules immunitaires follicules. Les résult...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions la direction du laboratoire de K. Gill et appui technique, J. Hawkins et le personnel du National Institutes of Health (NIH) construction animalerie 50 pour l’aide avec soin de la souris et R. Reed et F. bartherline pour l’assistance administrative. Merci aussi à Motegi S. et M. Uwimana pour le partage de leur protocole de dissection du peau oreille, N. Burns pour aide rédactionnelle et les membres de la laboratoire de cellules souches et biologie Neuro-vasculaire de l’aide technique et une discussion réfléchie. T. Yamazaki a été appuyée par la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) NIH-KAITOKU. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Heart, Lung, and Blood Institute (HL005702-11 à Y.M.)

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 x solution saline tamponnée au phosphateKD MedicalRGE-3210PBS, sans Ca2+/mg2+
Hank' s Solution saline équilibréeGibco14025-092HBSS, avec Ca2+/Mg2+
16 % ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences15710PFA, fixateur, dilué dans PBS
Triton X-100SigmaX100Détergent
Sérum de chèvre normalGibco16210064Composant du tampon de blocage/lavage
Normal Normal sérum d’âneJackson Immuno research017-000-121Composant du tampon de blocage/lavage
Pince à épiler fine incurvéeDumontRS-5047
Pince à épiler incurvéeIntegra Miltex VantageV918-782, V918-784
Unité de filtration 0,45 mmThermo Scientific157-0045Pour la filtration
Seringue de 1 mLCoviden8881501400Pour filtration
Filtre à seringue Unité 0,22 mmMillex-GVSLGVR04NLPour la filtration
ProLong GoldThermo ScientificP36934Support de montage anti-décoloration
Vernis à onglesMicroscopie électronique Sciences72180Pour l’étanchéité
Microscope de dissectionLeicaMZ95
Microscope confocalLeicaTCS SP5
Photoshop CC 2017Logiciel d’éditiongraphique Adobe
Illustrator CC 2017Logiciel d’éditiongraphique Adobe
Image JNIHLogiciel de traitement d’images
Anticorps anti-PECAM-1 (CD31)MilliporeMAB1398ZHamster IgG, marqueur de cellules endothéliales vasculaires, anticorps
anti-PECAM-1 (CD31)BD Pharmingen553369Rat IgG2a kappa, marqueur de cellules endothéliales vasculaires, anticorps
anti-α ;SMA 1:300 conjugué à cy-3SigmaC6198IgG2a de souris, marqueur de cellules musculaires lisses vasculaires, 1:500
Anticorps anti-EphB1Santa Cruzsc-9319Polyclonal de chèvre, marqueur de cellules endothéliales veineuses 1:100, 1:100
Classe III spécifique aux neurones β ;-tubuline (Tuj1)AbcamAB18207Tuj1, IgG polyclonales de lapin, marqueur panaxonal, 1:500
Anticorps anti-Tuj1CovanceMMS-435PIgG2a de souris, marqueur panaxonal, 1:500
Anticorps anti-MBPAbcamAB40390IgG polyclonale de lapin, marqueur de myélinisation, 1:200
Anticorps anti-tyrosine hydroxylaseChemiconAB152Marqueur de neurone sympathique polyclonal de lapin, 1:500
Anticorps anti-périphérineChemiconAB1530Polyclonal de lapin, marqueur neuronal périphérique, 1:1000
Anticorps anti-CD11bBio-RadMCA74GIgG2b de rat, marqueur cellulaire inflammatoire (macrophages),
anticorps anti-CD45Thermo Fisher Scientific14-0451-85IgG2b kappa de rat, marqueur cellulaire pan-hématopoïétique, anticorps anti-CD3 1:500
Bio-RadMCA1477TRat IgG1, marqueur de cellules immunitaires, 1:100
Anticorps anti-CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific14-0452Rat IgG2a kappa, marqueur de cellules inflammatoires, 1:200
Anticorps anti-GFPThermo Fisher ScientificA11122Polyclonal de lapin, 1:300
Anticorps anti-GFPAbcamAb13970Polyclonal de poulet, 1:500
Anticorps anti-β ;-galCappel55976Polyclonal de lapin, 1:5000
Anticorps anti-RFPAbcamAb62341Polyclonal de lapin, 1:300
IgG anti-lapin de chèvre (H+L) Alexa 488 ThermoFisher ScientificA11034Anticorps secondaire polyclonal de lapin, 1:250
IgG anti-hamster de chèvre (H+L) Alexa 647Jackson Immuno research127-605-160Anticorps secondaire polyclonal de hamster, 1:250
IgG anti-rat de chèvre (H+L) Alexa 594Jackson Immuno research112-585-167Anticorps secondaire polyclonal de rat, 1:250
IgG2a anti-souris de chèvre Alexa 633Thermo Fisher ScientificA21136Anticorps secondaire IgG2a de souris, 1:250
1:300 1:50

Références

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
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  3. Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
  4. Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
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  6. Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
  7. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749(2014).
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