Article de méthode

La détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse MALDI-TOF : manipulation PH afin de provoquer des modifications de la spécificité

DOI :

10.3791/57469

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25 mai 2018

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1Department of Microbiology and Molecular Cell Biology, Nihon Pharmaceutical University, 2Department of Clinical Pharmaceutics, Nihon Pharmaceutical University

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole pour déterminer la spécificité de la protéase dans les tissus de souris brut extraits par spectrométrie de MALDI-TOF.

Résumé

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Protéases ont plusieurs fonctions biologiques, y compris la digestion des protéines activation/inactivation et la nourriture. Identifier la spécificité de la protéase est important pour avoir révélé les fonction de protéase. La méthode proposée dans la présente étude détermine la spécificité de la protéase en mesurant le poids moléculaire de substrats uniques à l’aide de désorption/ionisation Laser assistée par matrice spectrométrie de masse à temps de vol (MALDI-TOF). Les substrats contiennent des iminobiotin, tandis que le site clivé est composé d’acides aminés et l’entretoise est constitué de polyéthylène glycol. Le substrat clivé générera un poids moléculaire unique à l’aide d’un acide aminé clivé. L’un des mérites de cette méthode est qu’elle peut être réalisée dans un pot à l’aide d’échantillons bruts, et il est également approprié pour l’évaluation des échantillons multiples. Dans cet article, nous décrivons une méthode expérimentale simple optimisée avec des échantillons extraits de tissus pulmonaires de souris, y compris l’extraction tissulaire, placement des substrats digestifs dans des échantillons, purification des substrats digestifs dans des conditions de pH différents et mesure le poids moléculaire des substrats par spectrométrie de masse MALDI-TOF. En résumé, cette technique permet l’identification de la spécificité de la protéase dans les échantillons bruts provenant d’extraits de tissus à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF, qui peut facilement être ajustée vers le haut pour le traitement des échantillons multiples.

Introduction

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Protéases régulent les processus physiologiques par clivage des protéines, et l’initiation de l’activité de la protéase à certains moments et endroits est réglé1. Il est donc important d’identifier l’expression et l’activité des tissus qui sont réglementés localement et de développer une nouvelle méthode pour détecter les protéases. La méthode proposée dans la présente étude vise à identifier la spécificité de la protéase en parallèle afin de détecter les protéases.

Il y a quelques méthodes pour détecter la spécificité de la protéase. La méthode azocaséine est bien connue pour son utilisation dans la détection des protéases2 mais est limitée dans sa capacité à obtenir des informations complémentaires. Zymographie est une autre méthode de détection de protéase complète qui peut être utilisée pour déterminer le poids moléculaire de protéases3, mais il ne peut pas servir à examiner la spécificité de substrat. Spécificité de protéase peut être déterminée par les analyses spectrométriques, en utilisant des substrats tels que p-nitroanilide4et essais fluorimétrique, à l’aide de substrats de coumarine5 ou Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) essais6. Ces méthodes permettent la détection de single-spécificité des substrats contenues dans un seul puits. Dans la présente étude, la spécificité de la protéase des extraits de tissus est examinée dans diverses conditions, car ces extraits contiennent plusieurs protéases. Activité de la protéase est régie par plusieurs facteurs, notamment le pH, coenzymes, groupes prosthétiques et force ionique. Récemment, des méthodes axées sur la protéomique ont été utilisés pour identifier la spécificité de la protéase ; par exemple, la méthode mentionnée par Biniossek et al. 7 le protéome pour déterminer la spécificité de substrat même dans des extraits bruts et permet une détermination précise de l’activité de clivage des protéases qui tiennent compte de plusieurs acides aminés séquences8. Toutefois, cette méthode ne consiste pas pour l’analyse de nombreux échantillons. En revanche, notre méthode permet le traitement simultané de plusieurs échantillons et l’utilisation de Matrix-Assisted Laser désorption-ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) spectrométrie de masse pour l’analyse de l’échantillon facilite la détection rapide et facile de la clivés substrats.

Le présent document décrit une méthode permettant d’évaluer la spécificité de protéase à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour mesurer le poids moléculaire de substrats uniques. Les formes moléculaires de substrats clivés, ainsi que leurs poids moléculaires théoriques, sont indiquées dans la Figure 1 et tableau 1. Des études antérieures ont utilisé des substrats contenant polyglycine entretoises et biotine9; Toutefois, ces substrats sont imparfaites parce que la séquence de polyglycine peut être clivée par des enzymes qui reconnaissent la séquence glycine. En outre, la forte affinité entre l’avidine et biotine peut conduire à un taux de récupération faible. Afin d’améliorer ces inconvénients, dans cette étude, que nous avons synthétisé un support unique qui était composé de polyéthylène glycol (PEG), iminobiotin et un acide aminé qui pouvait identifier le site de clivage (Figure 1). D’établir une discrimination entre les acides aminés de poids moléculaires semblables, la D-sérine a été ajoutée entre l’entretoise de PEG et de l’acide aminé du site clivées.

Le N-terminal du substrat a été marqué avec iminobiotin, qui permet la purification d’affinité des échantillons bruts. L’utilisation d’iminobiotin au lieu de biotine est critique ; Biotine a une forte affinité avec l’avidine, qui se traduit par des faibles taux de récupération des substrats biotine-étiquetés de la résine de l’avidine, tandis que l’affinité d’iminobiotin pour l’avidine peut être modifiée par pH. Marqué Iminobiotin substrats seront liera à avidine dans des conditions au-dessus de pH 9, tandis qu’avidine libère des substrats marqués au iminobiotin en conditions en dessous de pH 4. Par conséquent, iminobiotin a été utilisé pour affinité purification10. En résumé, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour détecter les spécificité de protéase en utilisant des substrats uniques.

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Protocole

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Protocoles expérimentaux animaux ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’Université Nihon Pharmaceutical et effectués conformément aux directives pour le soin et l’Use of Laboratory Animals de la Nihon University Pharmaceutical. Le protocole a été ajusté pour les extraits de tissus provenant de souris ICR. Souris ICR ont été achetés chez Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japon)

1. préparation du substrat marqué Iminobiotin

Le substrat subit une synthèse en phase solide à l’aide de groupe 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-acides aminés protégés tel que décrit ci-dessous11. Tableau 2 permet de déterminer le Fmoc-composé utilisé, selon le désiré d’acides aminés et le stade de synthèse.

  1. Swill 0,2 g de résine Fmoc-NH-SAL avec 10 mL de N, N-diméthylformamide (DMF) dans une colonne de synthèse.
  2. Ajouter 5 mL de pipéridine de 30 % dans le DMF. La solution pendant 10 min en conjonction avec le Fmoc-groupe de rock.
  3. Vérifiez Fmoc clivage avec l’acide trinitrobenzènesulfonique (TNBS) tester12: ajouter 10 µL de 1 % tube de TNBS DMF et 10 µL de diisopropyléthylamine (DIPEA) pour un tube de verre de2 mm 10 x 75, puis transfert une petite quantité de résine sur le verre. La résine Fmoc-clivés doit développer une couleur orange.
    1. Répétez les étapes 1,2-1,3 si ce résultat est négatif.
  4. Laver la résine trois fois avec 5 mL de DMF.
  5. Ajouter 5 mL de DMF contenant 0,3 mmol du Fmoc-composé figurant au tableau 2 (à partir du composé utilisé dans l’étape 1), 0,3 mmol de hexafluorophosphate de O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol de 1- Hydroxy-1H-benzotriazole, monohydraté (HOBt) et 0,6 mmol de diisopropyléthylamine (DIPEA). Balancer la solution pendant 30 min à coupler avec la résine.
    1. Vérifier cette étape avec le test TNBS. Si le résultat est positif, cela signifie que la réaction n’a pas suffisamment progressé, et cette étape doit être répétée.
  6. Laver la résine trois fois avec 5 mL de DMF.
  7. Répétez la réaction d’allongement en répétant les étapes 1,2 à 1,6, changeant le Fmoc-composé utilisé à l’étape 1.5 selon le tableau 2.
  8. Ajouter 1 mL d’eau de 2,5 %, 1 % éthanedithiol de triisopropylsilane (TIS) et de 2,5 % (EDT) dans l’acide trifluoroacétique en conjonction avec des peptides des résine et la protection des groupes. Roche la solution pendant 60 min.
  9. Filtrer et recueillir le filtrat dans un tube de 50 mL.
  10. Ajouter 40 mL d’éthanol froid diéthylique et magasin du jour au lendemain à-20 ° C.
  11. Centrifugeuse 4 000 x g à-20 ° C pendant 30 min. recueillir le culot.
  12. Utilisez un dessiccateur pendant 3 h pour éliminer l’éther.
  13. Ajouter 1 mL d’acétonitrile 50 % d’eau et dissoudre les peptides bruts. Lyophiliser la solution pour enlever l’acide trifluoroacétique. Répétez cette opération plusieurs fois.
  14. Purifier les peptides utilisant une colonne C18 à cartouche.
    1. Activer la résine dans la colonne de cartouche C18 en utilisant les 3 mL d’acétonitrile (ACN).
    2. Équilibrer avec 5 mL d’ACN de 5 %, 0,1 % TFA dans H2O.
    3. Charger les peptides synthétiques bruts dans la colonne de cartouche C18.
    4. Laver avec 10 mL d’ACN de 5 %, 0,1 % TFA dans H2O.
    5. Éluer les échantillons avec 3 mL de 60 % ACN, 0,1 % TFA dans H2O.
  15. Vérifiez les peptides en mesurant leur poids moléculaire par spectrométrie de masse MALDI-TOF.
    1. Pipetter 1 µL d’éluant sur une plaque de mire. Ajouter immédiatement la solution de (ACSSD) acide α-cyano-4-hydroxycinnamique saturée dans 50 % d’acétonitrile dans 0,1 % d’acide trifluoroacétique
    2. Cristalliser le mélange par séchage à l’air.
    3. Acquisition de spectres de masse des échantillons selon le protocole du fabricant de l’instrument.
      1. Régler manuellement le spectromètre de masse MALDI-TOF à un positif reflète mode.
      2. Calibrer le spectromètre de masse à l’aide de CHCA, bradykinine fragment 1-7 (monoisotopique moléculaire = Da 756.3997) et l’angiotensine II (monoisotopique moléculaire = Da 1,045.5423).
      3. Acquérir les spectres de masse de peptides synthétiques et ensuite évaluer par comparaison avec le poids moléculaire théorique.

2. préparation des extraits de tissus

  1. Offrir une souris ICR mâles dans une chambre d’inhalation isoflurane et vérifier la profondeur de l’anesthésie par l’intermédiaire de pincement de l’orteil. Euthanasier les souris par dislocation cervicale.
  2. À l’aide de ciseaux, faire une incision abdominale médiane à travers la peau, s’étendant jusqu'à le processus xiphoïde.
  3. Couper à travers la membrane et de recueillir tous les tissus pulmonaires. Couper le tissu en petits morceaux.
  4. Laver le tissu trois fois avec glacée 50 mM Tris salin (pH 7,4).
  5. Peser les tissus et les transfert environ 100 mg de tissus à un tube de verre de 12 x 75 mm2 .
  6. Ajouter 0,3 mL de tampon d’extraction (50 mM Tris-tampon pH 7,4, contenant 0,1 % éther d’octylphényle poly (oxyéthylène)).
  7. Homogénéiser les échantillons de tissus pulmonaires à l’aide d’un mélangeur homogénéisateur.
    1. Laisser refroidir les échantillons sur la glace.
    2. Homogénéiser les échantillons à 20 000 tr/min pendant 30 s dans un mélangeur. Répétez cette étape jusqu'à ce que les échantillons soient parfaitement homogènes.
      Remarque : Ne pas homogénéiser pendant plus d’une minute en continu, afin d’éviter une augmentation de température.
  8. Transférer 1 000 µL de l’homogénat dans un tube de 1,5 mL et centrifuger pendant 5 min à 10 000 x g à 4 ° C.
  9. Transférer 500 µL du liquide surnageant dans un nouveau tube en plastique de 1,5 mL.
  10. Utiliser 10 µL de l’échantillon pour déterminer la concentration de protéines, à l’aide de méthodes telles que le bicinchoninic acide (BCA) ou la méthode Coomassie brillant bleu (CBB).
  11. Pour éviter le gel, ajouter 80 % de glycérol pour les échantillons destinés à une concentration finale de 50 % de glycérol.
  12. Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.

3. digestion des substrats en modèle protéase et des extraits de tissus

  1. Ajouter 10 µL de 0,1 µg/µL de N-tosyl-L-phénylalanine chlorométhyl cétone (TPCK)-trypsine, 0,1 µg/µL de protéase de Staphylococcus aureus V8 ou 10 µg/µL d’extraits de tissus en 890 µL d’un tampon de la digestion.
    1. Pour clarifier la différence de spécificité de protéase selon le pH, utiliser les tampons ajustés à pH 3, 5, 7 et 9. La composition de la mémoire tampon de digestion est indiquée dans le tableau 3.
    2. Effectuer un contrôle négatif à l’aide de protéase inactive dans les extraits de tissus, préparés par une incubation dans l’eau bouillante (ou chauffage à 100 ° C) pendant 10 min.
  2. Ajouter 10 µL de substrats marqués au iminobiotin (dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), concentration finale = 100 pmol/10 µL).
  3. Incuber pendant 3 heures à 37 ° C, pour digérer les substrats marqués iminobiotin.
  4. Après incubation, arrêter la digestion des supports à l’eau bouillante (ou par chauffage à 100 ° C) pendant 10 min.
  5. Centrifuger les substrats digérés pendant 5 min à 10 000 x g à 4 ° C.
  6. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.

4. la purification du substrat marqué Iminobiotin

  1. Ajouter 50 µL de streptavidine 50 % Sépharose perles dans 1 M Tris-tampon (pH 9) contenant 0,1 % poly (oxyéthylène) octylphényle l’éther.
    1. Papier réactif pH permet de s’assurer que la solution est autour de pH 9. Si le pH de la solution est faible, le réglage à environ pH 9 en ajoutant 1 M Tris-tampon (pH 9) contenant 0,1 % poly (oxyéthylène) octylphényle l’éther. Cette étape est importante, car elle implique la liaison du substrat de streptavidine marquée iminobiotin.
  2. Incuber une nuit à 4 ° C, avec un mélange doux continu sur une roue rotator pour lier les substrats marqués au iminobiotin à la streptavidine. Les perles doivent rester suspendus tout au long de l’incubation.
  3. Centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g à 4 ° C. Retirez le surnageant.
  4. Laver les perles cinq fois comme suit :
    1. Ajouter 1 000 µL d’un tampon de lavage (50 mM Tris-tampon à pH 9) aux talons.
    2. Se laver pendant 10 min à 4 ° C, avec un mélange doux continu sur une roue de rotator. Les perles doivent rester suspendus tout au long de l’incubation.
    3. Centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
  5. Ajouter 100 µL de 0,2 % d’acide trifluoroacétique aux talons.
    1. Utilisez du papier pH test pour s’assurer que la solution est en dessous de pH 2. Si le pH de la solution est élevé, ajuster le pH à moins de 2 en ajoutant 1 % d’acide trifluoroacétique.
  6. Incuber 30 min à température ambiante avec un mélange doux continu sur une roue de rotator.
  7. Centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g à 4 ° C, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.

5. préparation des échantillons et spectrométrie de désorption-ionisation Laser assistée par matrice Time-of-Flight masse (spectrométrie de masse MALDI-TOF)

Remarque : Toutes les solutions dans les étapes suivantes doivent être préparées avec la chromatographie liquide haute performance (HPLC)-eau de séquençage-grade grade ou d’acides aminés.

  1. Pipeter 500 µL de l’acétonitrile sur une résine C18 pour l’activer. Supprimer l’acétonitrile utilisé. Répétez cette opération trois fois.
  2. Equilibrer la résine C18 avec 100 µL de 0,1 % d’acide trifluoroacétique. Supprimer l’éluant. Répétez cette opération trois fois.
  3. Pour charger les échantillons, lier les échantillons à la résine à l’aide d’une pipette.
  4. Laver la résine avec 20 µL de 0,1 % d’acide trifluoroacétique. Répétez cette opération cinq fois.
  5. Éluer les échantillons avec 3 µL de 60 % d’acétonitrile dans 0,1 % d’acide trifluoroacétique. Pipette de l’éluant sur une plaque de mire pour la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Immédiatement ajouter saturée solution de (ACSSD) acide α-cyano-4-hydroxycinnamique dans 50 % d’acétonitrile dans 0,1 % d’acide trifluoroacétique.
  6. Cristalliser le mélange par séchage à l’air.
  7. Acquisition de spectres de masse des échantillons selon le protocole du fabricant de l’instrument.
    1. Régler manuellement le spectromètre de masse MALDI-TOF à un positif reflète mode.
    2. Calibrer le spectromètre de masse à l’aide de CHCA, bradykinine fragment 1-7 (monoisotopique moléculaire = Da 756.3997) et l’angiotensine II (monoisotopique moléculaire = Da 1,045.5423).
    3. Acquisition de spectres de masse des échantillons, très attentif aux spectres de masse de 700 à 900 Da pour la forme clivée des substrats marqués à la biotine.
  8. Identifier les pics détectés à l’aide du tableau 1. Détection de poids moléculaire approprié indique un clivage à l’extrémité C-terminale de l’acide aminé pertinente.

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Résultats

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Évaluation de la méthode d’identification de la spécificité de la protéase de protéase de modèle

L’efficacité de ce système a été évaluée à l’aide de TPCK-trypsine et protéase V8, dont spécificités de substrat ont été obtenues. TPCK-trypsine et protéase V8 ont été estimées en conjonction avec la séquence d’acides aminés au C-terminal des résidus lysine et arginine et du côté de carboxy des résidus d’acide glutamique, acide aspartiq...

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Discussion

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Ce protocole utilise la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour identifier la spécificité de la protéase dans les échantillons bruts provenant d’extraits de tissus et peut facilement être ajustée vers le haut pour le traitement des échantillons multiples. En particulier, nous avons manipulé le pH afin de provoquer un changement de spécificité de substrat.

La méthode avidine-biotine complexe (ABC), qui a été largement utilisée en biochimie en raison de sa spécificité de liaison, a été utilisée da...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu en partie par la subvention de recherche de l’Université Nihon pharmaceutique de Nihon Pharmaceutical University (2016) et le MEXT KAKENHI Grant nombre JP17854179.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Résine Fmoc-NH-SAL (-[2,4-Diméthoxyphényl-N-(9-fluorénylméthoxycarbonyle)
résine aminométhyl]phénoxy)		Watanabe Chemical Co., Ltd.A00102
N,N-diméthylformamide (DMF)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00185
pipéridineWatanabe Chemical Co., Ltd.A00176
acide trinitrobenzènesulfonique (TNBS)WAKO Chemical209-1483
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HCTU)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazole, monohydraté (HOBt)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00014
diisopropyléthylamine (DIPEA)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00030
triisopropylsilane (TIS)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00170
ethanedithiol (EDT)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00057
acide trifluoroacétique (TFA)MilliporeS6612278 403
acétonitrileKokusan Chemical2153025
C18cartouche colonne EauxWAT051910
poly(oxyéthylène) octylphénylétherWAKO Chemical168-11805Triton X-100
mélange homogénéisateurKinematicaPT3100Homogénéisateur Polytron
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250Nakarai Chemical094-09
glycérolNakarai Chemical170-18
N-tosyl-L-phénylalanine chlorométhylcétone (TPCK)-trypsineSigma-AldrichT1426
diméthyl sulfoxyde (DMSO)WAKO Chemical043-07216
streptavidine sépharoseGE Healthcare17-511-01
ZipTipC18MilliporeAcide ZTC18S096
&alpha ;-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA)Sigma-AldrichC2020
MALDI-TOF spectrométrie de masseBruker Daltonics, Allemagneautoflex
2-iminobiotineSigma-AldrichI4632
Acides aminés FmocWatanabe Chemical Co., Ltd.

Références

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  13. Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
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Mots-clés

Manipulation du pHHomog n isation des tissusPurification du substratBilles de Sepharose streptavidineR sine C18Clivage des acides amin sMesure de la masse mol culaire

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