Article de méthode

CAIRP-Seq et ChIP-Seq : méthodes pour identifier les ARN associée à la chromatine et Interactions protéine-ADN dans les cellules souches embryonnaires

DOI :

10.3791/57481

⸱

25 mai 2018

1Department of Oncology, Wayne State University School of Medicine, 2Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons des méthodes pour effectuer des ChIP-Seq et cartes de CAIRP-Seq, y compris la préparation de la bibliothèque pour l’ordonnancement de nouvelle génération, pour générer l’épigénomique global et l’ARN associée à la chromatine dans les cellules ES.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires (ES) et de différenciation est régie par des signaux extrinsèques et intrinsèques réseaux de facteurs de transcription, régulateurs épigénétiques et traduction après modification des histones qui combinatoirement influent sur le gène État d’expression des gènes voisins. RNA a également été montré pour interagir avec diverses protéines pour réguler la dynamique de la chromatine et expression du gène. Immunoprécipitation de RNA associées à la chromatine (CAIRP) suivie de la nouvelle génération séquençage (CAIRP-Seq) est une nouvelle méthode pour sonder l’ARN associée à des protéines de la chromatine, tandis que de l’immunoprécipitation de la chromatine suivie par séquençage de prochaine génération ( ChIP-Seq) est une technique puissante de génomique pour mapper l’emplacement du post-traductionnelles des histones, facteurs de transcription et épigénétiques modificateurs à l’échelle mondiale-dans les cellules ES. Nous décrivons ici les méthodes pour exécuter CAIRP-Seq et ChIP-Seq, y compris la construction de la bibliothèque de SEQUENÇAGE de nouvelle génération, pour générer des global associées à la chromatine RNA et épigénomique cartes dans les cellules ES.

Introduction

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Décisions de devenir cellules souches embryonnaires (ES) sont réglementées par la communication entre des signaux extracellulaires et une foule de régulateurs transcriptionnels, y compris les modificateurs d’histone et traduction après modification des queues d’histone. Ces interactions facilitent l’accessibilité de la chromatine et l’emballage de la chromatine dans l’un des deux États : euchromatine, qui est ouvert et transcriptionally actif, et l’hétérochromatine, qui est compact et généralement transcriptionnellement inactif. Facteurs de transcription et les affinités de liaison de séquence spécifique d’ADN modificateurs épigénétique associé régions euchromatiques à participer dans le contrôle de l’expression des gènes. Méthodes de séquençage de nouvelle génération, dont ChIP-Seq1, ont grandement contribués à cartographier le génome réseaux transcriptionnels qui sont fondamentales pour ES cellules autorenouvellement et pluripotence2,3,4 ,5,6. De plus, tout en immunopreciation RNA suivie de prochaine génération séquençage (RIP-Seq)7 évaluations des interactions ARN-protéine suggèrent que protéines liant l’ADN interagissent avec l’ARN pour réglementer les événements transcriptionnelle7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, peu d’études ont étudié la localisation de tout le génome d’ARN associée à la chromatine12ou interactions globales entre les ARN et histone modifications. Longtemps non codantes RNAs (lncRNAs) sont une classe d’ARN qui ont été trouvés à réguler l’activité des protéines associées à la chromatine13,14,15. Par exemple, Xist est un lncRNA qui réglemente, dans les cellules mammifères femelles, inactivation d’un chromosome X, grâce au recrutement de répresseurs épigénétique16,17. Toutefois, l’éventail complet des ARN associée à la chromatine est en grande partie inconnu. Nous décrivons ici un protocole roman, associée à la chromatine RNA immunoprécipitation (CAIRP) suivi par séquençage de prochaine génération (CAIRP-Seq), pour identifier les ARN associée à la chromatine sur une base du génome dans les cellules ES, y compris la préparation de la bibliothèque pour séquençage de prochaine génération et ChIP-Seq pour mapper l’occupation globale des modifications d’histone, facteurs de transcription et modificateurs de l’épigénétiques. Contrairement aux autres méthodes de RIP-Seq7, CAIRP-Seq inclut des étapes de réticulation et sonication, permettant l’identification directe d’ARN associée à la chromatine. Ensemble, ChIP-Seq est un outil puissant pour identifier les interactions protéine-ADN de Génome-large, tandis que CAIRP-Seq est une méthode puissante d’arpenter RNAs sont associées aux composantes de la chromatine.

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Protocole

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1. culture de souris ES cellules dans des Conditions sans chargeur.

NOTE : Souris ES cellules sont traditionnellement cultivées dans les médias sur une boîte de Petri de cellule recouverte de gélatine et un mono-couche de fibroblastes embryonnaires de souris (force expéditionnaire des marines), qui ont été mitotically inactivés (iMEFs). Toutefois, les MEFs doivent être retirés avant les analyses épigénétiques ou expression en aval pour éviter la contamination de la chromatine associées à MEF et de l’ARN.

  1. Préparation d’une couche de conducteur : gélatine recouvrir une plaque de culture de cellules de 6 puits en ajoutant 2 mL de 0,1 % de gélatine dans l’eau et incuber les plaques à 37 ° C pendant 20-30 min.
  2. Préparer les médias de haut-glucose 10 % DMEM contenant 2 mM de L-glutamine, 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 x pénicilline/streptomycine.
  3. Isoler les MEFs de E13.5 à E14.5 souris18,19 , ou acquérir auprès d’un fournisseur commercial. Inactiver mitotiquement MEFs en traitant avec la mitomycine C ou l’irradiation gamma à l’aide de protocoles standard19. Vous pouvez également mitotically inactivés MEFs (iMEFs) peuvent être acquis auprès d’un fournisseur commercial.
  4. Culture de MEFs. Réchauffez les médias MEF à 37 ° C, décongeler des surgelés flacon d’iMEFs et de la culture dans 10 % médias FBS MEF à 37 ° C, avec 5 % de CO2. Plaque MEFs à ~ 200 000 cellules / puits d’une boîte de Petri de 6 puits.
  5. Culture de cellules ES sur une couche de cellules nourricières (iMEFs).
    1. 12 à 24 heures après l’ensemencement iMEFs, préchauffer un tube de 50 mL de milieux cellulaires ES (DMEM haute-glucose, FRV (10 ng/mL), 15 % ES complet cellule FBS, qualifiée de culture cellulaire de 1 × 2-mercaptoéthanol, 1 × glutamine, acides aminés non essentiels (NEAA), 1 × pénicilline/streptomycine), à 37 ° C avec 5 % de CO2.
    2. Aspirer les médias des plaques de culture cellulaire contenant iMEFs, remettre en suspension les cellules ES dans 2 mL de médias (après décongélation à 37 ° C) et les cellules de la couche d’iMEFs de la plaque. Lorsque vous placez la boîte de Pétri dans l’incubateur, il est important de passer le plat en forme de « t » pour répartir les cellules et pour empêcher l’agrégation vers le centre du plat.
  6. Le passage des cellules ES sur vaisselle exempt d’engraissement enduit de gélatine. Le passage des cellules ES avant qu’ils deviennent confluentes. Colonies de cellules ES maintiennent l’auto-renouvellement meilleur si les colonies sont également espacés et non confluentes. La présence de nombreuses colonies de cellules d’ES qui entrent en contact avec indique que la densité cellulaire est trop élevée.
    1. Enduire un plat de 6 puits de culture avec de la gélatine comme décrit ci-dessus. Incuber à 0,25 % de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant environ 10-15 min à la trypsine Préchauffez.
    2. Ensuite, le passage des cellules ES en premier lavage avec 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et en ajoutant 1 mL de solution de trypsine-EDTA de 0,25 %. Attendre 1-2 min pour les colonies à détacher. Dissocier les colonies à une suspension de cellules individuelles en pipettant également, avec une pointe de 1 mL pour environ 5 fois.
    3. Utiliser un microscope pour vérifier la dissociation cellulaire unique des cellules ES. Pour étancher la réaction, ou de « neutraliser » la trypsine, ajouter des éléments multimédias FBS MEF de 10 %. Centrifuger les cellules à 300 g à température ambiante pendant 3-5 min et aspirer les médias.
    4. Resuspendre le culot cellulaire dans 2 mL de médias (cellules ES) additionné de la glycogène synthase kinase-3 (GSK3) inhibiteur (CHIR99021 ; GSK3i), ou 2i conditions (MEKi/GSK3i) (2-3 µM GSK3i : CHIR99021, 1 µM MEKi : PD0325901).
    5. Aspirer la gélatine de la capsule de culture cellulaire, ajouter 2 mL de support contenant des ESCs au plat et placer le plat dans un incubateur à 37 ° C (Figure 1 a-D). Double inhibition de GSK3i et de MEKi favorise l’état fondamental naïf pluripotence des cellules ES en l’absence de cellules nourricières (iMEFs) et sans sérum20. Les cellules ES doivent être repiquées deux à trois fois pour enlever les MEFs avant de procéder à la réticulation.

2. la réticulation des ES cellules pour puce et CAIRP

  1. Récolter les cellules ES en les lavant avec du PBS, puis ajouter 0,25 % de trypsine préchauffée à 37 ° C. Incuber les cellules pendant plusieurs minutes à la température ambiante. Éviter la trypsinisation de cellules d’ES, qui conduira à la mort cellulaire. Utiliser un microscope pour évaluer la dissociation cellulaire unique.
  2. Étancher la digestion trypsique comme décrit ci-dessus pour le passage des cellules ES et centrifuger les cellules à 300 g à température ambiante pendant 3 à 5 min.
  3. Remettre en suspension les cellules dans les médias MEF préchauffé (37 ° C) (10 % FBS/DMEM) à 2 × 106 cellules/mL.
  4. Pour relier les cellules, ajouter la solution de formaldéhyde de 37 % à une concentration finale de 1 % et incuber les cellules dans un tube à fond conique (15 mL ou 50 mL) à 37 ° C pendant 8 min. inverser le tube plusieurs fois au cours de la période 8 min pour atteindre la fixation homogène.
    NOTE : Le temps de fixation peut être empiriquement optimisé pour CAIRP. Si le temps de fixation est modifié, le nombre de cycles de sonication doit également être ajusté. En outre, la température de 37 ° C augmente l’efficacité de réticulation par rapport à réticulant à température ambiante. La température de fixation peut être empiriquement optimisée.
  5. Pour arrêter la réaction de fixation, ajouter 1,25 M glycine (pré réfrigéré à 4 ° C) à une concentration de 0,125 M. inverser le tube à 8 t/mn à l’aide d’un agitateur pendant 5 min à température ambiante. Centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer les médias.
  6. Laver le culot cellulaire avec PBS préalablement réfrigérées (4 ° C), centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer PBS. Laver les cellules avec du PBS à nouveau. Ensuite, aliquote 15 × 106 cellules par tube de 15 mL.
  7. Congeler le culot cellulaire en le plaçant dans l’azote liquide pendant 1 min, sur la glace sèche pendant 5 min, ou placer immédiatement à-80 ° C.
    Remarque : Boulettes de cell ES fixe peuvent être stockés pendant 6 mois sans qualité diminuée lors d’expériences en aval.

3. la sonication pour puce et CAIRP chromatine

  1. Décongeler le culot ES fixe sur la glace. Resuspendre le culot dans le tampon de sonication (2,5 mL). Resuspendre le culot dans 1 x TE, PMSF, 1 mM 1 x inhibiteur de protéinase cocktail de facteurs de transcription ou régulateurs épigénétiques (facteurs protéiques). Pour les modifications d’histone, resuspendre le culot dans 1 x TE, SDS 0,1 %, PMSF, inhibiteur de protéinase 1 x 1 mM.
    NOTE : Bien que l’ajout de SDS améliore l’efficacité de la sonication, il peut-être pas bénéfique pour l’évaluation de certains constituants de la chromatine ou les facteurs de transcription.
  2. Pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), laisser agir la chromatine avec des cycles de 14-18 (30 s sur, 30 repos s) à amplitude de 40 %. Pour les associés à la chromatine RNA immunoprécipitation (CAIRP), réduire le nombre de cycles de sonication (8-10 cycles). En raison de cellulaire, la fixation et la variabilité sonifier, conditions de sonication doivent être déterminées empiriquement.
  3. Supplément la mémoire tampon de sonication 28 µL du SDS de 10 % pour les protéines-facteurs, 28 µL de désoxycholate de sodium et 0,28 mL 10 % Triton-X100, et bien mélanger.
    Remarque : L’ajout de ces composants dans la mémoire tampon de sonication génère tampon RIPA.
  4. Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 10 min à 4 ° C à l’avance de la chromatine. Déplacer le surnageant dans un tube frais et passez à l’immunoprécipitation de la chromatine.
  5. Par ailleurs, la chromatine aux ultrasons peut être stockée à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Toutefois, le stockage de la chromatine aux ultrasons à-80 ° C peut conduire à qualité diminuée pour puce de protéine-facteur.

4. chIP et processus de l’ACPIR

  1. Ajouter 40 µL de protéine A ou billes magnétiques G à un 1,5 mL, tube de liaison faible. Ajouter 600 µL de PBS pour laver les perles. Placer le tube sur un support contenant un aimant, incuber le tube pendant 1 min à température ambiante, PBS de retirer et remettre en suspension les billes magnétiques dans 100 µL de PBS.
  2. Ajouter 2 à 4 µg d’anticorps dans le tube avec des billes magnétiques. Incuber et tourner le tube à température ambiante pendant 40 min à 8 t/mn à l’aide d’un agitateur pour faciliter la liaison des anticorps aux billes magnétiques. Insérer le tube sur le support magnétique, il incuber pendant 1 min à température ambiante, puis retirez les PBS.
  3. Ajouter 200 µL de PBS pour laver les billes magnétiques. Laver avec du PBS est exécutée pour supprimer les IgG gratuit. Incuber et tourner le tube à température ambiante pendant 5 min entre les lavages. Fixer le tube à l’aimant et enlever le PBS.
  4. Protéines liées à la chromatine immunoprécipitation en incubant la chromatine aux ultrasons (4 × 106 cellules par puce), un extrait avec les billes magnétiques et faire tourner l’échantillon à 4 ° C (la nuit).
  5. Laver les billes magnétiques. Incuber les échantillons à température ambiante avec les tampons suivants et tourner l’échantillon pendant 10 min avec chaque tampon : deux fois avec 1 mL de tampon RIPA (pH de TE (10 mM Tric-HCl, EDTA 1 mM) 8,0, 1 % X-100 Triton, 0,1 % sodium deocycholate, SDS 0,1 %), deux fois avec 1 mL de c tampon RIPA ontenant 0,3 M NaCl, deux fois avec 1 mL de tampon de LiCl (0,5 % sodium deocycholate, 0,5 % NP40, 0,25 M LiCl), une fois avec 1 mL de TE mettre en mémoire tampon avec 0,2 % X-100 Triton et une fois avec 1 mL de TE.
  6. De-réticulation de puce. Remettre en suspension les billes magnétiques dans 100 µL de TE. Ajouter 3 µL du SDS de 10 % et 5 µL de protéinase K (20 mg/mL). Incuber les échantillons à 65 ° C (la nuit).
    Remarque : Il est important de couvrir les tubes au cours de cette étape avec parafilm ou une pellicule plastique pour éviter l’évaporation.
    1. Le lendemain, il faut inverser le tube plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, utilisez le support de l’aimant pour transférer le surnageant dans un nouveau tube. Pour laver les billes magnétiques, ajouter 100 µL de TE contenant 0,5 M de NaCl et ensuite combiner les deux surnageants.
  7. De-réticulation pour CAIRP. Remettre en suspension les billes magnétiques dans 100 µL de TE. Ajouter 3 µL du SDS de 10 % et 5 µL de protéinase K (20 mg/mL). Incuber les échantillons à 65 ° C pendant 4 à 12 h d’Incubation à 65 ° C doit être déterminée empiriquement en raison de la variabilité entre les types de cellules, sonication et fixation des conditions, etc..
    1. Inverser le tube 3 - 5 fois pour mélanger, appliquer le tube à la grille magnétique et déménage par la suite le surnageant dans un tube frais.
    2. Pour laver les billes magnétiques, ajouter 100 µL de TE contenant 0,5 M de NaCl et ensuite combiner les deux surnageants.
      Remarque : Il est important d’utiliser des réactifs exempte de nucléase (e.g., tampon TE, SDS, etc..) pour prévenir la perte d’ADN ou d’ARN au cours de l’étape de-réticulation.
  8. Extraire l’ADN/ARN, avec 200 µL de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (PCI) (25:24:1, v/v).
    NOTE : L’ARN peut également être extrait à l’aide de trousses commerciales en utilisant les instructions du fabricant. Agiter pendant 30 s, tournent à 10 000 x g à température ambiante pendant 10 min et déplacer le surnageant dans un nouveau tube.
    1. Pour précipiter l’ADN/ARN, ajouter 2 µL de GlycoBlue et 20 µL d’acétate de sodium 3M 600 µL d’éthanol. Mélanger en retournant le ~ 5-8 fois et placer l’échantillon sur la glace sèche ou à-80 ° C pendant au moins 1-2 h.
    2. Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 30 min à l’aide d’une centrifugeuse de table-top réfrigérateur (4 ° C). Sécher à l’air le culot pour < 1 min et remettre en suspension dans 40 µL de EB tampon (10 mM Tris-HCl). Pour la préparation de ChIP-Seq de bibliothèque, passez à l’étape 6.
  9. Retirez l’ADN associées à la chromatine des échantillons d’ARN IP à l’aide de DNase. Ajouter 10 x DNase tampon 1 concentration de x dans l’échantillon de l’ACPIR. Ajouter 1 µL de DNase pour jusqu'à 10 µg d’ARN (réaction de 50 µL). Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 30 min. extrait de l’échantillon de RNA avec PCI. Remettre en suspension les en exempte de nucléase H2O.

5. double-brin cDNA synthèse pour CAIRP-Seq

  1. Synthèse de cDNA de premier-brin. Pour la réaction de transcription inverse, mis en place la réaction suivante dans un tube conçu pour une machine PCR : 10,5 µL d’ARN et de 1 µL aléatoire d’amorces hexamère (3 µg/µL).
  2. Incuber les tubes à 65 ° C pendant 5 min dénaturer la structure secondaire et stockez-le sur glace pendant 2 min. mélanger les composants suivants : 4 µL de tampon de premier-brin, 2 µL de 0,1 M TNT, 1 µL de dNTP et 0,5 RNase OUT. Ajoutez ensuite le tube PCR, 7,5 µL du mélange maître. Incuber le tube pendant 2 min à 25 ° C. Ajouter 1 µL d’exposant II (200 U/µL) et incuber comme suit : 25 ° C pendant 10 min, 42 ° C pendant 50 minutes, 70 ° C pendant 15 min et maintenez à 4 ° C.
  3. Synthèse de cDNA de deuxième brin. Placer le tube sur la glace. Ensuite, ajoutez les éléments suivants dans l’ordre : 91 µL de diéthyl pyrocarbonate (DEPC) traités eau, 30 µL de 5 x tampon de réaction du deuxième brin, 3 µL du mélange dNTP (10 mM), 1 µL d’e. Coli DNA ligase (10 U/µL), 4 µL de polymérase d’ADN (10U/µL) de Escherichia Coli . et 1 µL d’e. Coli RNase H (2U/µL). Mélanger délicatement mélangé au vortex et incuber à 16 ° C pendant 2 h.
    Remarque : Mélange en effleurant ou en renversant le tube peut être pas suffisant pour bien mélanger les réactifs.
  4. Ajouter 2 µL de T4 ADN polymérase et incuber à 16 ° C pendant 5 min. Purify cDNA (double-brin, dscDNA) à l’aide du kit de purification de PCR. Éluer la dscDNA en 40 µL de tampon de EB.
  5. Fragment d’ADNc double brin. Cisaillement de cDNA (dscDNA) à l’aide d’un sonifier de bain de l’eau et un tube de 1,5 mL pour une taille de 250-500 BP. Sonication de dscDNA est essentiel pour réduire la taille de fragment pour faciliter le séquençage de l’ARN de transcription complète.
  6. Lorsque vous utilisez un modèle standard d’un sonifier bain-marie, laisser agir l’échantillon pour 3 × 10 min ou 4 × 10 min.
    NOTE : Trois cycles doivent être utilisés pour jusqu'à 1 µg d’ARN total, tandis que quatre cycles sont recommandés pour 1 à 5 µg d’ARN total. Centrifuger le tube brièvement après chaque cycle de sonication et maintenir un bain d’eau froide en ajoutant glace fraîche.
  7. Lorsque vous utilisez un sonifier Pico, il est recommandé d’utiliser six cycles de 1 à 5 µg d’ARN total et les conditions suivantes de cyclisme (30 s, 90 s éteint). Centrifuger le tube brièvement après 2-3 cycles de sonication. L’efficacité de la sonication peut être déterminée en chargeant une fraction de la dscDNA cisaillé (3-4 µL) sur gel d’agarose (2 %). Il est important de tester empiriquement conditions de sonication en raison de la variabilité entre les sonifiers.
  8. Exécuter bibliothèque préparation tel que décrit à l’étape 6 pour le séquençage de prochaine génération.

6. chIP-Seq et Construction de bibliothèque de CAIRP-Seq

  1. Réparer les extrémités de l’ADN à l’aide d’un kit de fin-réparation de l’ADN. Ce kit est utilisé pour générer l’ADN émoussé-terminée. Pour cette réaction, mises en place ce qui suit dans un 1,5 mL, à faible liaison tube : 34 µL d’ADN, 5 µL de dNPTs 2,5 mM, 5 µL de l’ATP, 5 µL de fin-réparation mémoire tampon (5 mM DTT, acétate de magnésium 100 mM, l’acétate de potassium 660 mM 10 x 10 mM 300 mM Tris-acétate, pH 7,8) et 1 µL de réparation fin mélange enzymatique (T4 polynucléotide kinase, T4 ADN polymérase).
  2. Incuber l’échantillon pendant 45 min à température ambiante.
  3. Purifier l’ADN à l’aide d’un kit de nettoyage de réaction. Éluer réparé à la fin de l’ADN en 32 µL de tampon EB préchauffé (65 ° C). Tandis que nous doser pas généralement la concentration de l’ADN suite à puce ou l’ARN après CAIRP, avant la préparation de la bibliothèque, il est recommandé de commencer au moins 5-10 ng de puce ADN ou d’ARN de l’ACPIR.
  4. Ajout d’un surplomb de 3' « A » à l’ADN réparé à la fin. Ajouter des composants à un 1,5 mL, tube de liaison faible : 30 µL d’ADN par dessus, 5 µL de NEB mémoire tampon 2, 1 µL de dATP de stock de 10 mM et 11 µL d’H2O 3 µL de 5 U 10 x / fragment de Klenow µL (3' - 5' Exo-) et mélanger doucement en pipettant également.
  5. Incuber l’échantillon pendant 30 min à 37 ° C.
  6. Utiliser un kit de nettoyage de réaction pour purifier l’ADN. Éluer ADN dans 25 µL de tampon EB préchauffé (65 ° C).
  7. Ligaturer adaptateur. Ajoutez les composants suivants sur la glace : 23 µL d’ADN par le haut, 3 µL de 10 x T4 DNA ligase tampon, 1 µL de recuit PE ou multiplexage adaptateur (4 µM) et 3 µL de T4 DNA ligase (400 U/µL) et mélanger doucement en pipettant également.
    NOTE : Séquences adaptateur peuvent également être obtenues auprès une source commerciale.
    Séquences oligonucléotidiques :
    Adaptateurs de PE
    5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
    5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Multiplexage des adaptateurs
    5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
    5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
  8. Incuber l’échantillon pendant 30 min à température ambiante.
  9. Effectuez la sélection de la taille de l’ADN à l’aide d’un gel d’agarose (2 %) préfabriqué. Exécutez le gel pendant 10 min.
  10. La région correspondant à 250-450 bp de l’accise.
    Remarque : en coupant le gel au-dessus de plus de 200 bp, il est possible une diminution de la contamination de dimères d’adaptateur unligated. Il est important d’enlever toute unligated adaptateurs avant l’étape de l’ACP.
  11. Utiliser un kit d’extraction de gel pour purifier l’ADN. Éluer dans 20 µL de tampon de EB.
  12. Bibliothèque et PCR purification ADN ligaturé échantillons contenant les adaptateurs jumelé-fin (PE). Ajouter les composants dans un tube PCR : 12 µL de 50 % de l’ADN par le haut, 12 µL d’eau, 25 µL du mélange principal (Phusion HF), 1 µL d’amorces PCR PE 1.0 et 1 µL d’amorces PCR PE 2.0.
    NOTE : Séquences oligonucléotidiques peuvent également être obtenus d’une source commerciale.
    Séquences oligonucléotidiques :
    Amorce PCR PE 1.0
    5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Amorce PCR PE 2.0
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
  13. Bibliothèque et PCR purification ligaturé échantillons contenant des cartes Index PE. Ajouter les composants : 12 µL de 50 % de l’ADN par le haut, 12 µL d’eau, 1 µL d’amorce PCR InPE 1.0 (dilué 1:2), 1 µL d’amorce PCR InPE 2.0 (dilué 1:2) et 1 µL d’amorce PCR Index (dilué 1:2).
    NOTE : séquences oligonucléotidiques peuvent également être obtenus d’une source commerciale.
    Séquences oligonucléotidiques :
    Amorce PCR multiplex 1.0
    5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Amorce PCR multiplex 2.0
    5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
    Séquences de Index d’amorces PCR 1-12
    Amorce PCR, Index 1
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, Index 2
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, Index 3
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, indice 4
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, indice 5
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, indice 6
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, Index 7
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, Index 8
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, Index 9
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, indice 10
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, Index 11
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
    Amorce PCR, Index 12
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC
  14. Effectuer des PCR vélo en utilisant les conditions suivantes (dénaturer pendant 30 s à 98 ° C, 18 cycles de 10 s à 98 ° C, 30 s à 65° C, 30 s à 72 ° C, 5 min à 72 ° C, tenir à 4 ° C).
    Remarque : Le nombre de cycles PCR devrait être déterminé empiriquement.
  15. Sélection de la taille des produits PCR. Exécutez l’ADN sur un E-Gel préfabriqué EX (2 %) ou maison 2 % gel (agarose) et de l’accise de la région de bp 300-500.
  16. Utiliser un kit d’extraction de gel pour purifier l’ADN du gel. Éluer final produit de PCR dans 20 µL de tampon de EB.
  17. Utilisez un fluorimètre pour mesurer la concentration de la bibliothèque. Effectuer le séquençage de prochaine génération.

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Résultats

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Nous avons interrogé avec succès la liaison pangénomique du H3K4me3, H3K4me2 et KDM5B dans les cellules ES ce ChIP-Seq protocole6. ES cellules ont été cultivées dans des conditions sans chargeur (Figure 1) et réticulé comme décrit ci-dessus. Sonication a été effectuée tel que décrit à l’étape 3.2 du protocole ChIP-Seq et évalués par l’ADN en cours d’exécution sur un gel d’agarose à 2 % (Figure 2). Ensuite,...

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Discussion

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ChIP-Seq est une méthode utile pour évaluer l’emplacement des interactions protéine-ADN global (e.g., facteurs de transcription/histone modifiant les modifications d’enzymes/histone et l’ADN) dans les cellules ES, tandis que le protocole de CAIRP-Seq nouvellement développé est utile dans interroger l’association génome d’ARN avec des constituants de la chromatine. ChIP-Seq est un outil fondamental qui sert à évaluer les paysages épigénétiques des cellules ES et autres types de cellules. La qualité de ChIP-Seq et...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, une bourse du National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01 a 1) attribué à B.L.K. Ce travail a utilisé la Wayne State University Haute Performance Computing Grid pour des ressources informatiques (< https://www.grid.wayne.edu/>). Nous remercions Jiji Kurup d’assistance avec l’analyse des données CAIRP-Seq.

DE CONTRIBUTIONS DES AUTEURS :

B.L.K. conçoit la méthode CAIRP-Seq, conçu et réalisé des expériences de la ChIP-Seq et CAIRP-Seq, ont analysé les données de séquençage et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Facteur inhibiteur de la leucémie de souris (ESGRO LIF)EMD Millipore106 or 107 units
GSK3&beta ; inhibiteur CHIR99021 (GSK3i)Stemgent: DMSO 10mM
inhibiteur de MEK PD0325901 (MEKi)Stemgent: DMSO 10mM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), glucose élevéInvitrogen11965092
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)Invitrogen10010031
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénolGibco25200056
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Gibco15140122
2-Mercaptoéthanol (50 mM)Solutiond’acides
MEM (100X)Gibco11140076
EmbryoMax ES Sérum de veau fœtal qualifié pour les cellules, 500 mlEMD MilliporeES-009-B
EmbryoMax 0,1 % Solution de gélatineEMD MilliporeES-006-B
GlycineSigmaG7126-500G1,25 M de stock de conentration dans l’eau
Solution de formaldéhydeSigmaF8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8,0 1XQualité Biologique351-011-131
Solution de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)Sigma93482-250ML-F
cOmplete Inhibitor CocktailRoche11697498001
Sodium dodecyl sulfate solution (20 %)Qualité BiologiqueA611-0837-10
Q125 sonifierQsonica4422
Triton X-100 solutionSigma93443-100ML
Désoxycholate de sodiumSigma30970
NaClSigmaS7653
Dynabeads Protéine G pour l’immunoprécipitationInvitrogen10004D
Dynabeads Protéine A pour l’immunoprécipitationInvitrogen10002D
Dynabeads Protéine A/Protéine G et Magnet Starter PackInvitrogen10015D
lithiumSigmaL4408
IGEPAL CA-630SigmaI8896
RNeasy Mini KitQiagen74104
Dynabeads Kit de purification de l’ARNm (pour la purification de l’ARNm à partir de préparations d’ARN totales)Invitrogen61006
SuperScript Synthèse d’ADNc double brin KitInvitrogen11917010
QIAquick Kit de Purification PCRQiagen28104
End-It DNA End-Repair KitLucigenER81050
Klenow Fragment (3'&rarr ; 5' exo-)NEBM0212L
dATP (10 mM)Invitrogen18252015
T4 DNA ligaseNEBM0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA LadderInvitrogen10488085
E-gel EX gels d’agarose, 2 %InvitrogenG402002
Phusion master-mix haute fidélité 2X avec tampon HFThermo Fisher
ChIPAb+ Triméthyl-Histone H3 (Lys4) - Anticorps validé ChIPAnticorps EMD Millipore17-614
Anticorps anti-histone H3 (di méthyl K4) [Y47] - Grade ChIP (ab32356)Abcamab32356
Plaques de culture cellulaire à fond plat Corning Costar (6 puits)
Falcon (10cm)Fisher08772E
Bioruptor picoDiagenodeB01010001
Qubit Flurometer 2.0Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851
MinElute Reaction Cleanup KitQiagen28204
MinElute Gel ExtractionQiagen28604
Anti-Histone H4 (tri méthyl K20) anticorps - ChIP Grade (ab9053)Abcamab9053
Rotateur LabquakeThermo Fisher400110Q
Plateforme Illumina HiSeq Illumina
TURBO DNaseInvitrogenAM2238
Solvant Solvant aminés non essentiels Gibco 31350010 Chlorure de F531LPMBoîtes de culture tissulaire standard Fisher 720083 Kit

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  3. Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
  4. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  5. Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
  6. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32(2014).
  7. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  10. Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
  11. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
  12. Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28(2016).
  13. Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
  14. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
  15. Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
  16. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  17. Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
  18. Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
  19. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
  20. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  21. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  22. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  23. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  24. Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
  25. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
  26. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
  27. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).

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Mots-clés

Immunopr cipitation de la chromatines quen age de nouvelle g n rationmodifications des histonesfacteurs de transcriptionr gulateurs pig n tiques

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