Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’ablation d’une sous-population génétiquement marquée de neurones par un laser à deux photons de larves de poisson zèbre.

Résumé

Pour identifier le rôle d’une sous-population de neurones dans le comportement, il est essentiel de tester les conséquences du blocage de son activité dans les animaux vivants. Ablation par laser de neurones est une méthode efficace à cet effet lorsque les neurones sont sélectivement marquées avec des sondes fluorescentes. Dans la présente étude, les protocoles pour laser ablation une sous-population de neurones à l’aide d’un microscope biphotonique et l’essai de ses conséquences fonctionnelles et comportementales sont décrits. Dans cette étude, le comportement de capture des proies chez les larves de poisson zèbre est utilisé comme un modèle d’étude. Le circuit pretecto-hypothalamique est connu pour sous-tendre cette proie pilotée par visuellement capture le comportement. Poisson zèbre prétectum étaient ablation au laser, et l’activité neuronale dans le lobe inférieur de l’hypothalamus (ILH ; la cible de la projection pretectal) a été examinée. Comportement de capture des proies après ablation pretectal a également été testé.

Introduction

Pour comprendre comment le comportement résulte de l’activité neuronale dans le cerveau, il est nécessaire d’identifier les circuits neurones qui sont impliqués dans la génération de ce comportement. Au stade larvaire, le poisson-zèbre fournit un modèle animal idéal pour étudier le fonctionnement du cerveau associées le comportement parce que leur cerveau petit, transparent permettre d’enquêter sur l’activité neuronale à une résolution cellulaire dans un vaste domaine de la cerveau tout en observant le comportement¹. Imagerie de l’activité neuronale dans les neurones spécifiques est devenue possible grâce à l’invention des indicateurs génétique....

Protocole

1. l’ablation d’une sous-population de neurones à l’aide d’un Microscope biphotonique Laser

Remarque : Si utilisateurs comptez sur l’exécution d’ablation suivante d’imagerie Ca, utilisez la ligne de UAShspzGCaMP6s²¹. Si les utilisateurs plan sur l’exécution d’enregistrement comportemental après ablation, utilisez la ligne de UAS:EGFP, comme l’ablation des cellules positives EGFP est plus facile à réaliser que des cellules exprimant le GCaMP6s.

1. Commencer par la mise en place de l’accouplement d’une ligne de Gal4 que les labels des neurones spécifiques à étudier et UAS:EGFP ou UAShspzGCaMP6s.....

Résultats

Neurones spécifiques ont été génétiquement marquées avec EGFP ou GCaMP6s, dont l’expression furent chassés dans les lignées Gal4. Un gSAIzGFFM119B de ligne de Gal4 a été utilisé pour étiqueter un noyau dans la zone pretectal (magnocellulaire superficiel pretectal noyau) et une sous-population de neurones du bulbe olfactif. Une autre ligne de Gal4, hspGFFDMC76A, a été utilisée pour marquer la ILH. Nous laser-ablation des neurones pretectal sur le plan bilatéral (panneau de gauche de

Discussion

Bien que le deux photons laser a une excellente résolution spatiale pour spécifiquement l’ablation des neurones individuels, grande prudence convient pour éviter tout dommage non désiré sur le tissu cérébral en raison de la chaleur. L’étape la plus importante dans l’expérience d’ablation est de déterminer la quantité optimale d’irradiation laser. Irradiation insuffisante ne parvient pas à tuer les neurones. Trop d’irradiation sera endommagé par la chaleur le tissu environnant, ce qui donnera lieu à des effets indésirable.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NuSieve GTG Agarose	Lonza	Cat.#50080	agarose à basse température de
fusion 6 cm boîte de Pétri	FALCON	Produit# :351007
aiguille de dissection	AS ONE Corporation	Cat. N° 2-013-01	https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP	Microscope à balayage laser à deux photons	Carl Zeiss
W Plan-Apochromat 63x/1.0	Objectif Carl Zeiss		63X
Imager.Z1	Carl Zeiss		un microscope à épifluorescence
ZEN	Logiciel d’acquisition d’images Carl Zeiss		pour microscopes confocaux
de chambre d’hybridation Secure-Seal, 8 chambres, 9 mm de diamètre x 0,8 mm de profondeur	Sondes moléculaires	Catalogue # S-24732	Utilisé comme chambre d’enregistrement en imagerie Ca
Chambres d’imagerie	Grace Bio-Labs	CoverWell Chambres d’imagerie PCI-A-2.5	Utilisé comme chambre d’enregistrement comportemental
couteau chirurgical	MANI	Couteau ophtalmique MST15
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	modèle :C11440-22CU	une caméra CMOS scientifique
HCImage	Hamamatsu Photonics Logiciel d’acuisition		d’image
Hard Disk Module Recording	Hamamatsu Photonics	Un module logiciel qui permet d’enregistrer les fichiers vidéo sur un disque dur en peu de temps
			objectif pour SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	N° de produit GS3-U3-41C6NIR-C	Caméra CMOS
XIMEA Caméra XIQ,	XIMEA	N° de produit.	Caméra CMOS
un anneau LED lumière	CCS	Modèle : LDR2-100SW2-LA	Blanc LED
Nylon mesh 32µ ; m	Tokyo Screen	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Maille nylon 13µ ; m	Écran Tokyo	N° 508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Écran en métal 150 microns Écran			http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
en métal avec ouverture 75 microns	Écran		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Alimentation & Soins de santé, Co. Ltd.		levure de bière sèche
LabVIEW	National Instruments		un environnement de développement intégré pour la programmation
Mai-Tai, HP	Spectra Physics  ;		Laser à deux photons  ;