Évaluation préclinique de la bioactivité de la OT48 de coumarine anticancéreux par sphéroïdes, colonie Formation essais et xénogreffes de poisson-zèbre

Le cancer est causé par des mutations cellulaires et par conséquent les voies biochimiques de signalisation sont perturbées déclenchant la division cellulaire incontrôlée et la résistance à la mort cellulaire. Les tumeurs interfèrent avec les fonctions physiologiques de l’appareil digestif, nerveux, circulatoire et par la suite voisine tissus¹. Malgré les efforts de recherches approfondies, le cancer reste la maladie mortelle la plus répandue dans le monde². Médecine de précision a été reconnue comme la Fondation de l’avenir thérapeutique anticancéreuse. Nouvelles entités moléculaires sont systématiquement testées en association avec les médicaments existants pour améliorer les résultats cliniques.

Cependant, une des limitations importantes associées au développement de nouvelles thérapies ciblées efficaces est l’échec des tests couramment utilisés pour simuler les résultats biologiques exacte de drogue exposition³. Découverte de drogue de cancer repose encore principalement sur l’évaluation de l’efficacité des agents thérapeutiques dans des lignées de cellules cancéreuses cultivées dans des cultures monocouches 2D, qui sont difficiles à valider dans les essais cliniques⁴. Par conséquent, il y a un intérêt croissant pour développer des modèles de cancer mieux que mieux imitent les fonctionnalités natives de tumeurs in vivo⁵. Ces dernières années, un intérêt croissant pour les modèles 3D de la culture a mené à l’élaboration de méthodologies améliorées pour produire la tumeur 3D modèles⁵.

Ici, nous présentons une méthode avec trois techniques de culture cellulaire 3D différents permettant d’améliorer la compréhension de la puissance de l’hydroxycoumarine OT48⁶ en combinaison avec BH3 mimétiques avant plus en profondeur des essais in vivo sur. Notre méthode se compose de la combinaison de la colonie et SFAs avec un in vivo tumeur formation test basé sur un modèle de poisson zèbre pour valider l’efficacité de la combinaison de OT48 et BH3 mimétiques dans les cellules cancéreuses du poumon et surveiller la progression du cancer dans sa vie organisme.

Tests de formation de colonie sont couramment utilisés pour évaluer l’efficacité des agents anticancéreux cancers solides tant que hématopoïétiques. Le test détermine la capacité d’une cellule à proliférer indéfiniment et forment des colonies⁷. L’effet d’un agent anticancéreux sur la colonie formant la capacité des cellules est déterminée par la diminution du nombre ou de la taille des colonies.

Sphéroïdes représentent des modèles in vitro de tumeur et servent de plateforme de dépistage peu coûteux pour les agents anticancéreux. Sphéroïdes sont des agrégats de cellules cultivées en suspension ou noyées dans une matrice 3D. Cette approche est largement utilisée pour le dépistage des drogues et des études de tumeur immunitaire, la prolifération et la croissance interaction⁸.

Pour bien comprendre les propriétés d’un nouveau médicament, il est essentiel de mener des expériences in vivo sur des rongeurs. Toutefois, cette méthode traditionnelle est coûteux et prend du temps. Ces dernières années, poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme de laboratoire étudiés qui est moins cher et plus rapide d’élever. Tumeurs développées dans l’approche de la culture cellulaire zebrafish représentent un 3D mais dans le cadre de in vivo d’un vertébré⁹.

Au total, on utilise ici trois approches différentes culture 3D y compris SCFA, SFAs et poisson-zèbre in vivo la formation de tumeurs pour démontrer la capacité anticancéreuse de hydroxycoumarine OT48 dans un modèle de cellules A549 le cancer pulmonaire en combinaison avec BH3 mimétiques.

1. colonie Formation essais

1. Cellulaire de cellules A549 culture à une concentration de 20 000 cellules/cm² dans 15 mL de RPMI1640 milieu de culture enrichi avec 10 % SVF (sérum de veau fœtal) et 1 % antibiotiques dans une fiole de² 75 cm dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C et 5 % de CO₂.
2. Le jour de l’expérience, déterminer la concentration cellulaire en utilisant un hémocytomètre. Recueillir 50 000 cellules par centrifugation à 400 g pendant 7 min dans un tube de microtubes de 1,5 mL et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de 1 x solution PBS stérile (Phosphate Buffered Saline) dans des tubes de 1,5 mL.
3. Pipeter 1,1 mL de milieu semi-solide à base de methylcellulose (MCBM) dans des tubes de 15 mL avec un échantillon. Préparer un tube pour chaque condition.
4. Ajouter 110 µL de FBS à 1,1 mL de MCBM à l’aide d’une micropipette P200.
5. Cellules de graines à 1 000 cellules/mL. Prélever 2,4 µL de suspension cellulaire de la solution mère (50 000 cellules dans 100 µL de PBS 1 x) à l’aide d’une micropipette P2 et ajouter à 1,1 mL de MCBM additionné de 10 % FBS.
6. Après avoir ajouté les cellules, vortex les tubes pendant 1 min, en les tenant verticalement à la vitesse maximale à bien mélanger MCBM et cellules.
7. Ajouter des composés d’essai (OT48 seul ou en combinaison avec A1210477). Préparer une éprouvette sous forme de contrôle pour le solvant utilisé (ici le diméthylsulfoxyde (DMSO)). Selon la concentration des composés et le volume ajouté pour chaque condition, le solvant contrôle inclura la plus forte concentration de solvant utilisé pour les dilutions de la substance, à tester pour évaluer les effets néfastes causés par le solvant.
8. Tubes vortex pendant 1 minute.
9. Pour chaque essai, ajouter 1 mL du mélange avec une micropipette P1000 au centre d’une plaque de culture de cellules de 12 puits.
10. Remplir les puits vides avec 1 mL d’eau stérile ou 1 x PBS pour stabiliser l’humidité.
11. Incuber les boîtes de culture pendant 10 jours dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂.
12. Après 10 jours d’incubation, ajouter 200 µL d’une solution mère de MTT (bromure de methylthiazolyldiphenyl-tétrazolium) (5 mg/mL) dans chaque puits pour atteindre une concentration finale de 1 mg/mL.
13. Incuber 10 min dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂. Colonies viables tournera violet.
14. Capturer l’image à l’aide d’un appareil photo numérique à l’aide de la plaque de fond blanc (plateau blanc dia de LAS). Utilisez les paramètres suivants : méthode, numériser ; Type d’exposition, précision ; Temps d’exposition, manuel, 1 seconde ; Résolution/sensibilité, haute résolution. Enregistrer l’image au format tiff.
15. Quantifier les colonies viables à l’aide de logiciels ImageJ. Sélectionnez le menu « Image | Type | 8 bit ». Sélectionnez le menu « réglage | Seuil ». La valeur seuil contrôle et maintenir constant pour toutes les conditions ; Sélectionnez le menu « Analyze | Analyser les particules ». Enregistrer les données et les analyser avec un logiciel de statistiques pour la représentation graphique.

2. test de Formation sphéroïde

1. Cellules A549 de culture à une concentration de 20 000 cellules/cm² dans des flacons de² 75 cm avec 15 mL de milieu RPMI 1640 additionné d’antibiotiques de SVF et 1 % 10 %.
2. Le jour de l’expérience, préparer un 96 bien U-plaque.
3. Plaque de 10 000 cellules dans un puits qui contient déjà le composé d’intérêt (ici 50 µM de OT48) ou 20 µM de A1210477. Ajuster le volume final à 100 µL de milieu de culture cellulaire. Le nombre de cellules qui forment les sphéroïdes uniformes avec une bordure extérieure intact est considérée comme suffisant pour sphéroïdes de forme.
4. Incuber pendant 3 jours dans un incubateur à 37 ° C et à 5 % de CO₂.
5. Après 3 jours d’incubation, capturer des images des sphéroïdes à l’aide d’un microscope optique avec un grossissement de 4 x.

3. dosage de xénogreffe de poisson-zèbre

Remarque : Cette approche technique est visualisée comme un schéma (Figure 1).

1. Préparation des réactifs stocks
   1. Préparer 1 L de 30 x solution de Danieau : 1740 mM NaCl, KCl 21 mM, 12 mM MgSO₄∙7H₂O, 18 mM Ca (NO₃)₂et 150 mM HEPES. Ajuster le pH de la mémoire tampon à 7,6 à l’aide d’un pH-mètre.
   2. Préparer la solution à 1 % (50 x) tricaïne : dissoudre 20 mg de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate (tricaïne) dans 2 mL d’eau distillée.
   3. Préparer la solution de rouge de phénol-PBS 1 % : ajouter 2 µL de solution de sel de sodium rouge de phénol à 198 µL de solution de PBS stérile dans un tube de 1,5 µL.
   4. Préparer 3 % de méthylcellulose : ajouter 3 g de méthylcellulose à 100 mL de solution de Danieau 1 x.
2. L’incubation et la production d’oeufs de poisson-zèbre
   1. Séparer une femelle et un mâle poisson zèbre dans un réservoir de partition rempli avec l’eau du robinet filtrée et stérilisée par UV à 28,5 ° C dans l’obscurité. Après 24h de séparation, mélanger le poisson des deux sexes pour initier l’accouplement. Transfert des oeufs fécondés du réservoir d’accouplement à une boîte de Pétri contenant 5 mL de solution de frais Danieau.
   2. Laver les œufs trois fois avec 5 mL de solution de Danieau. Pour le lavage, soigneusement aspirer les oeufs avec une pipette et transfert à 5 mL de la solution fraîche. Incuber pendant 8 h à 28,5 ° C.
      1. Après 8 h d’incubation dans une solution de Danieau, changer de solution de Danieau contenant 0,03 % 1-phényl-2-thiourée (PTU) pour inhiber la pigmentation. Trier les oeufs opaques (non fécondés ou contenant des embryons sous-développés) pour empêcher la contamination.
3. Embryon dechorionation
   1. 24h après la fécondation (hpf), embryons de poisson zèbre de dechorionate avec une pincette forte. Incuber les embryons d’incubation dans une solution de Danieau avec 0,03 % PTU à 28,5 ° C jusqu'à 48 hpf.
4. Préparation de cellules traitées composé
   1. Cellules A549 de semences à 20 000 cellules/cm² dans des flacons de culture 25 cm² . Après 24 h d’ensemencement, ajouter des composés (ici OT48 à 50 µM et et/ou A1210477 à 20 µM) pendant 24 h dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂. Paramétrer la durée de traitement pour chaque composé à maintenir la viabilité des cellules, mais de les commettre vers la mort cellulaire. Cette fois point doit être configuré individuellement issu des marqueurs moléculaires, la morphologie et la viabilité des cellules.
   2. 2 h avant la fin du traitement, cellules de tache avec 4 µM de traqueur de cellule fluorescente teignent CM-Dil à 37 ° C et 5 % de CO₂. Après 2 h d’incubation, trypsinize cellules avec 0.05 % trypsine-EDTA et diluer 10⁶ cellules dans 50 µL de solution de rouge de phénol-PBS avant l’injection.
5. Micro injection de cellules cancéreuses pour formation de xénogreffe
   1. Anesthésier les poissons zèbres dans une solution de tricaïne 0,02 % pendant 5 min jusqu'à ce qu’ils s’installent sur une gélose.
   2. Tirez un 1,0 mm (hors verre diamètre capillaire) par un de micropipettes (paramètres du programme : P: 300, chaleur : 260, tirer : 60, VEL : 50 et l’heure : 200). Couper le microcapillaire avec une seringue pour produire une arête vive. Charger microcapillaries avec 20 µL de cellules/phénol rouge-solution de PBS. Régler la pression d’injection et le temps de distribuer 2 nL par injection.
   3. Injecter 100 – 200 cellules dans le sac vitellin par injection 6 à 10 nL par l’intermédiaire de 3 à 5 injections. Après l’injection, permettre aux poissons de récupérer pendant 10 à 30 min dans 5 mL de solution de frais Danieau contenant une solution PTU. Expédition de poissons en plaques 24 puits avec 1 mL de solution de Danieau contenant PTU solution sont et incuber pendant 72 h à 28,5 ° C.
   4. Après 72 h d’incubation, anesthésier les poissons dans une solution de tricaïne 0,02 % et immobiliser sur une lame de verre, avec une baisse de 3 % de méthylcellulose. Prendre 5 x images en microscopie à fluorescence à une longueur d’onde de 620 à 750 nm.
   5. Quantifier la taille des tumeurs fluorescentes de logiciels ImageJ. Sélectionnez le menu « Analyze | Mesure ». Enregistrer les valeurs correspondant au signal fluorescent et d’analyser avec un logiciel de statistiques pour la représentation graphique.

Dans la Figure 2, le cancer du poumon cellules ligne A549 a été ensemencé dans MCBM à former des colonies après le traitement avec OT48 seul ou en combinaison avec BH3 A1210477 mimétique aux concentrations indiquées. Les résultats ont montré que la combinaison significativement réduit nombre, la taille et la surface totale des colonies, après 10 jours d’incubation.

Dans la Figure 3, cellules A549 ont été traités avec OT48 seul ou en combinaison avec BH3 A1210477 mimétique et étaient autorisées à sphéroïdes de forme par la technique de plaque de fond U. Après 3 jours d’incubation, les images des sphéroïdes ont été prises. Quantification des sphéroïdes a été réalisée à l’aide d’Image J et 3D images ont été produites.

Dans la Figure 4, A459 cellules ont été traitées avec OT48 seul ou en combinaison avec A1210477 mimétique BH3 pendant 24 h et injectés dans le sac vitellin de poisson-zèbre. Après 72 h, quantification des tumeurs fluorescentes est corrélée au potentiel inhibiteur du composé.

Figure 1 : diagramme schématique du processus global de l’essai de xénogreffe zebrafish. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : formation de colonies d’Inhibition synergique de A549 hydroxycoumarine OT48 et BH-3 mimetic A1210477. (A) des Images d’un test de formation de colonie A549 traités avec 50 µM de OT48 et/ou de 20 µM de A1210477. (B-D) Quantification du nombre, taille moyenne et la surface totale des colonies. Des expériences ont été réalisées en trois exemplaires. Des analyses post hoc ont été effectuées. Significations statistiques ont été évaluées à la valeur de p inférieure à 0,05 et représentées par la légende suivante : * p ≤ 0,05, ** p ≤0.01, *** p 0,001, *** p ≤0.0001 ; post hoc analyse Dunnett ; Sidak). Tous les histogrammes représentent la moyenne ± SD d’au moins trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : effets des OT48 ou des A1210477 sur la capacité du A549 cellules à sphéroïdes forme. Images des sphéroïdes tumeur A549 après 3 jours.

Figure 4 : Inhibition de la formation massive de tumeurs A549 par un composé. (A) photos montrent l’effet inhibiteur des OT48 ou des A1210477 sur la tumeur formant la capacité des cellules A549 CM-Dil-colorées. (B) la Quantification de la formation de tumeurs. Des analyses post hoc ont été effectuées. Significations statistiques ont été évaluées à la valeur de p inférieure à 0,05 et représentées par la légende suivante : * p ≤ 0,05, ** p ≤0.01, *** p 0,001, *** p ≤0.0001 ; post hoc analyse Dunnett ; Sidak). Tous les histogrammes représentent la moyenne ± SD d’au moins dix expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.