Une Administration simple et efficace et la visualisation de microparticules dans l’appareil circulatoire des petits poissons à l’aide d’Injection de rein

Summary

Cet article illustre les principes d’une injection rapide et mini-invasive de microparticules fluorescentes dans le circulatory system de petits poissons et de la visualisation en vivo des microparticules dans le sang du poisson.

Abstract

L’administration systémique de taille micro particules dans un organisme vivant peut être appliquée pour la visualisation du système vasculaire, drogue et administration de vaccins, implantation de cellules transgéniques et de minuscules capteurs optiques. Toutefois, des microinjections intraveineuse en petits animaux, qui sont principalement utilisés dans les laboratoires biologiques et vétérinaires, sont très difficiles et nécessitent un personnel formé. Ici, nous démontrons une méthode robuste et efficace pour l’introduction de microparticules dans le système circulatoire du adult poisson zèbre (Danio rerio) par injection dans le rein de poissons. Pour visualiser les microparticules introduites dans le système vasculaire, nous proposons une technique d’imagerie intravitale simple dans les branchies des poissons. Surveillance in vivo du poisson-zèbre pH sanguin a été accompli à l’aide d’une injection fluorescentes microencapsulés probe, SNARF-1, afin de démontrer une des applications possibles de la technique décrite. Cet article fournit une description détaillée de l’encapsulation de colorant sensibles au pH et illustre les principes de l’injection rapide et visualisation des microcapsules obtenues pour in vivo d’enregistrement du signal fluorescent. La méthode proposée d’injection se caractérise par un taux de mortalité faible (0-20 %) et un rendement élevé (70-90 % de réussite) et il est facile d’instituer à l’aide de matériel couramment disponible. Toutes les procédures décrites peuvent être exécutées sur d’autres espèces de petits poissons, comme les guppys et chez les sujets exposés.

Introduction

L’administration de taille micro particules dans l’organisme animal est une tâche importante dans des domaines tels que la drogue et vaccin livraison¹, système vasculaire visualisation², implantation de cellules transgéniques³et implantation de minuscules capteurs optiques ^{4 , 5}. Toutefois, la procédure d’implantation pour les particules de micro-échelle dans le système vasculaire des petits animaux de laboratoire est difficile, surtout pour les organismes aquatiques sensibles. Pour les échantillons de recherche populaires comme le poisson....

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément à la Directive européenne 2010/63/UE pour l’expérimentation animale et ont été approuvés par l’Animal sujets recherche Comité d’Institut de biologie à l’Université d’état d’Irkoutsk.

1. fabrication de Microcapsules

Remarque : Les Microcapsules transportant un colorant fluorescent sont préparés à l’aide d’une couche par couche de charge opposée polyélectrolytes^7,8. Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante.

1. Pour synthétiser poreux CaCO₃ microcores enf....

Results

Les résultats obtenus proviennent d’un des trois principales catégories du protocole présenté : la formation de microparticules fluorescentes par encapsulation d’un colorant fluorescent (Figure 1), l’injection de rein de microcapsules avec davantage de visualisation dans branchies capillaires (Figure 2 et 3) et, enfin, l’in vivo spectrale enregistrement de fluorescence SNARF-1 pour surve.......

Discussion

Pour illustrer l’injection de microparticules dans les reins de poisson-zèbre, nous avons utilisé semi-perméable microcapsules chargées avec un colorant indicateur. Ainsi, le protocole contient des instructions pour la fabrication de microcapsules à l’aide de l’Assemblée de couche par couche de charge opposée polyélectrolytes^{7,8,15,16,17 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW	Sonde fluorescente Thermo Fisher Scientific	D3304	. Tout autre colorant fluorescent lié à un polymère approprié peut être utilisé comme charge de microcapsule
Conjugué albumine-fluorescéine isothiocyanate (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Sonde fluorescente
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)	SIGMA	R9379	Sonde fluorescente
Chlorure de calcium	SIGMA	C1016	CaCO3 formation de matrices
Carbonate de sodium	SIGMA	S7795	CaCO3 formation de matrices
Poly(chlorhydrate d’allylamine), MW 50000 (HAP)	SIGMA	283215	Polymère cationique
Poly(4-styrènesulfonate de sodium), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Polymère anionique
Poly-L-lysine [20 kDa] greffé avec du polyéthylène glycol [5 kDa], g = 3,0 à 4,5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)	Polymère final pour augmenter la biocompatibilité des microcapsules
Chlorure de sodium	SIGMA	S8776	Pour dissoudre les polymères appliqués
Système de purification de l’eau	Millipore	SIMSV0000	Pour préparer de l’eau désionisée
Agitateur magnétique	Stegler		Pour la formation
de modèles de CaCO3Eppendorf  ; Recherche  ; pipette Plus, 1000 & micro ; L	Eppendorf		Solutions de dosage
Eppendorf  ; Recherche  ; pipette plus, 10 & micro ; L	Eppendorf		Solutions de dosage Pointes de
pipette, plage de volume 200 à 1000 & micro ; L	F.L. Medical	28093	Solutions de dosage
Pointes de pipette, plage de volume 0,1-10  ; &mu ; L	Eppendorf	Z640069	Solutions de dosage
Mini-centrifugeuse Microspin 12, BioSan			Pour le procédé de centrifugation-lavage des microcapsules
Tubes à microcentrifugation, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Synthèse et stockage des microcapsules
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		Pour réduire l’agrégation de microcapsules
Nettoyeur			Pour réduire l’agrégation de microcapsules Casques
d’écoute  ;			Pour protéger les oreilles des ultrasons
Acide éthylènediaminetétraacétique	SIGMA	EDS	Pour dissoudre le CaCO3
modèles Phosphate monosodique	SIGMA	S9638	Préparation des tampons de pH
Phosphate disodique	SIGMA	S9390	Préparation des tampons de pH
Hydroxyde de sodium	SIGMA	S8045	Pour ajuster le pH de la solution EDTA et des tampons
Chambre			Pour sécher les microcapsules sur une lame de verre
		numération des cellules sanguines	Pour étudier la distribution de la taille et la concentration des microcapsules préparées
Microscope fluorescent Mikmed 2	LOMO		Visualisation in vivo des microcapsules dans le sang
de poissonJeu de filtres fluorescents pour SNARF-1 (à choisir en fonction du modèle de microscope ; un exemple est fourni)	Chroma	79010	Visualisation de microcapsules avec des sondes fluorescentes
Spectromètre à fibre QE Pro	Ocean Optics		Étalonnage de microcapsules au microscope
Fibre optique QP400-2-VIS NIR, 400 &mu ; m, 2 m	Ocean Optics		Pour connecter le spectromètre avec le port du microscope
Collimateur F280SMA-A	Thorlabs		spectromètre avec le port du microscope
Lame de microscope en verre	Fisherbrand	12-550-A3	Étalonnage des microcapsules au microscope
Lamelles, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Étalonnage des microcapsules au microscope
Microcapillaires en verre Intra MARK, 10 & micro ; L	Blaubrand	BR708709	Pour recueillir le sang de poisson
Huile de clou de girofle	SIGMA	C8392	Anesthésie de poisson
Lancet No 11	Apexmed international B.V.	P00588	Pour couper la queue du poisson et libérer l’aiguille en acier de l’extrémité de l’auto-injecteur d’insuline
Héparine, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	Pour traiter toutes les surfaces qui entrent en contact avec le sang de poisson lors de la collecte de sang de poisson
Sept 2 Go Pro pH-mètre avec une microélectrode	Mettler Toledo		Pour déterminer le pH du sang de poisson
Aiguilles du stylo à insuline Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		Pour la procédure d’injection. Toute aiguille fine (& Oslash ; 0,33 mm ou moins) est appropriée
Capillaires en verre, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgerä ; te GmbH & Co	9201075	Pour le procédé d’injection
Chalumeau			à gaz Pour souder l’aiguille d’acier au capillaire en verre
Micro-injecteur IM-9B	NARISHIGE		Pour le dosage précis de microcapsules en suspension Boîtes de
Pétri, 60 mm x 15 mm, polystyrène	SIGMA	P5481	Pour les manipulations avec des poissons sous anesthésie
Cuillère			en plastiquePour les manipulations avec des poissons sous anesthésie
Éponge			Pour les manipulations avec des poissons sous anesthésie
Ciseaux de dissection	Thermo Scientific	31212	Pour retirer le couvercle branchial de la tête du poisson
Pipette Pasteur, 3,5 mL	MARQUE	Z331767	Pour humidifier les branchies des poissons