Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure

La génétique vers l’avant est une méthode classique dans lequel chercheurs cherchent des mutants naturels qui présentent un phénotype particulier et effectuent des analyses génétiques. Dans la génétique inverse, les mutations sont introduites dans un gène d’intérêt et le phénotype est examiné. Dans ce dernier cas, la mutagénèse aléatoire d’un gène cible est souvent utilisé pour générer un groupe de mutants qui sont ensuite sélectionnés pour les phénotypes désirés, comme la sensibilité à la température ou modifié l’activité enzymatique. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour réaliser la mutagénèse aléatoire, y compris les erreurs PCR¹; D’irradiation UV²; mutagènes chimiques, tels que le méthanesulfonate d’éthyle (EMS) ou l’acide nitreux³; l’utilisation de souches mutantes temporaire, telles que celles surexprimant mutD5 ⁴; et ADN brassage⁵.

Nous décrivons ici une stratégie inverse-génétique dans laquelle nous utilisons Erreurs PCR pour générer des piscines mutantes d’un gène cible dans la levure de fission. Comme on pourrait le deviner de son nom, cette méthode génère des mutations en introduisant délibérément des erreurs pendant l’ACP. Contrairement aux autres méthodes de mutagenèse, erreurs PCR permet à l’utilisateur de définir la région à être mutagénisées tant. Ceci est particulièrement utile dans les efforts déployés pour étudier la fonction d’une protéine/domaine d’intérêt.

Pour illustrer cette procédure de mutagénèse aléatoire, dans les présentes utilisons-nous rpt4 +, qui code pour la sous-unité de protéasome 19 s, par exemple. Rpt4 a démontré avoir protéolyse indépendante des fonctions dans les organismes autres que fission levure^6,7,8,9, et un défaut de protéolyse pourrait causer des effets indirects en altérant les protéines niveaux. Nous avons, par conséquent, projeté pour les mutants qui a déclenché les changements indépendants de protéolyse, dans le but d’étudier la fonction du protéasome sur hétérochromatine.

PCR erreurs peut être appliqué à n’importe quelle région du gène par le réglage de l’emplacement auquel lient les amorces. Mutants qui montrent le changement phénotypique souhaité peuvent être identifiés avec des journalistes appropriés. Ici, nous avons utilisé un journaliste ade6 + inséré au centromère 1 externe "répétition" (otr) région¹⁰. L’hétérochromatine constitutive est formé à cette région¹¹, alors que le journaliste ade6 + est réduit au silence à l’état sauvage ; Ceci est indiqué par colonies rouges¹⁰. Une mutation qui déstabilise l’hétérochromatine constitutive au centromère donneront lieu à l’expression du reporter ade6 + qui est visualisée comme colonies blanches.

1. préparation des médias

1. Préparer extrait de levure avec suppléments (oui), oui sans adénine (Oui faible Ade), Pombe Glutamate moyen (PMG¹²) et PMG sans adénine (PMG-Ade) en mélangeant les composants tel que décrit dans le tableau 1. Oui-Ade (faible Ade) et plaques de PMG-Ade ont tous les mêmes composants, mais l’adénine est absent de ce dernier.
   1. Utiliser le stock de sel (50 x) suivants : 52,5 g/L MgCl₂·6H₂O, 2 g/L CaCl₂·2H₂O, 50 g/L de KCl, 2 g/L Na₂donc₄ dans de l’eau distillée. Filtre à stériliser à l’aide d’un filtre de pores de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.
   2. Utiliser la vitamine suivante (1, 000 x) stock : pantothénate de 1 g/L, 10 g/L d’acide nicotinique, inositol de 10 g/L, biotine de 10 mg/L dans l’eau distillée. Filtre à stériliser à l’aide d’un filtre de pores de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.
   3. Utiliser le minéraux suivant (10, 000 x) stock : 5 g/L d’acide borique, 4 g/L MnSO₄, 4 g/L ZnSO₄·7H₂O, 2 g/L FeCl₂·4H₂O, 0,4 g/L MoO₃, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO₄·5H₂O , 10 g/L d’acide citrique dans l’eau distillée. Filtre à stériliser à l’aide d’un filtre de pores de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.
      NOTE : Milieu Oui liquide est possible en omettant l’agar.
2. Stériliser le milieu et refroidir en dessous de 60 ° C en remuant avec une barre de remuer, à raison de 200 tr/min.
3. Pour plaques Oui + G418 (G418), ajouter 1 mL/L G418 solution stock au milieu Oui.
   1. Utilisez le G418 suivants (1, 000 x) stock : 100 mg/mL G418 dans l’eau distillée. Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm pores, aliquot à tubes à centrifuger 1,5 mL et magasin à-20 ° C.
4. Remuez pendant un autre 5-10 min et partie aliquote les médias en Pétri de 90 mm (1 L de moyennes aliquotes à peu près 40 boîtes de Pétri. Stocker les plaques à 4 ° C.

2. clonage de rpt4 + et ses 5' / 3' UTR

1. Effectuer des PCR avec des amorces p1 et p2 (Figure 1 a) à l’aide de fission yeast ADN génomique (ADNg) comme le modèle dans un volume total de 50 µL (~ 1 µg ADN, enzymes de U 20, 1 x tampon de réaction), et appliquant les cycles de réaction décrites dans le tableau 2 pour amplifier une base de 3 315 fragment de paires (bp) comprenant rpt4 + et ses 5' / 3' UTR. Purifier le produit de la PCR à l’aide d’un kit de purification¹³ comme indiqué par le fabricant (Figure 1 a).
2. Digérer les pBlueScript KS(-) vector¹⁴ et le fragment d’ADN amplifié contenant rpt4 + avec ses 5' / 3' UTR avec BamH1 et Xho1 dans un volume total de 20 µL (~ 1 µg d’ADN, 20 U enzyme, 1 tampon de digestion x) à 37 ° C dans un bain d’eau pour les 16-18 h (Figure 1 b).
3. Gel de purifier le vecteur digéré (gel d’agarose de 1,2 %) et l’ADN insérer par électrophorèse sur gel d’agarose TAE-basé (100 V, 1 h), exciser les bandes d’ADN de la taille désirée et isoler l’ADN avec un gel extraction kit¹⁵.
4. Ligaturer le vecteur et l’insert d’ADN à l’aide de T4 DNA ligase en effectuant une réaction de ligature de 20 µL contenant de 50 à 100 ng du vecteur ADN, un ~ 3 fois excès molaire de l’ADN de l’insert, 400 U T4 DNA ligase et 1 x tampon de ligature. Incuber le mélange à 18 ° C pendant 16-18 h.
5. Transformer l’ADN ligaturé dans 100 µL d’e. coli DH5α en appliquant un choc thermique pour 70 s à 42 ° C. Ajouter 1 mL de LB et incuber pendant 1 heure à 37 ° C pendant la récupération. Effectuer la centrifugation (13 800 x g), jeter la surnageante, plaque tous les transformé e. coli cellules sur plaques LB-ampicilline (LA) et incuber à 37 ° C pendant 16 h.
6. Prélever des colonies de 4-8 avec des cure-dents et cultiver une nuit à 37 ° C dans un milieu 3 mL LA.
7. Isoler les plasmides avec un plasmide purification kit¹⁶ utilisés selon le protocole du fabricant et effectuez les digestions 5 µl analytique des enzymes de restriction du plasmide isolé, 5 U de chaque enzyme de restriction (BamH1 et Xho1) et 1 x tampon de restriction. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C au bain-marie pendant 3 h. confirmer le clonage en séquençant les plasmides de candidat.

3. introduction de la Mutation silencieuse (Site de Restriction deXho1 )

1. Concevoir une paire d’amorces 33-bp (p3 et p4) qui contiennent la mutation souhaitée dans la séquence complémentaire dans le cas contraire.
2. Effectuer des PCR avec haute fidélité polymérase¹⁷ (Figure 1) dans un volume total de 25 µL (10 ng de plasmide cloné, 2 µL de 10 mix amorce pmol, enzyme de U 2, 1 x tampon de réaction) en utilisant les paramètres répertoriés dans le tableau 3.
3. Digérer le plasmide de modèle avec Dpnj’ai dans un volume total de 20 µL (20 enzyme U, 1 x tampon de digestion) à 37 ° C dans une eau de bain pour 1 h.
4. Transformer, propager, isoler et séquencer le plasmide contenant la mutation silencieuse, tel que décrit dans les étapes 2,5-2,7.
   Remarque : La mutation silencieuse peut également être introduite à l’aide d’une méthode de clonage qui permet d’assemblage des fragments d’ADN multiples en une seule réaction¹⁸.

4. aléatoire Mutagenesis of rpt4 + par PCR Erreurs

1. Effectuer des erreurs PCR, utilisant le plasmide avec la mutation silencieuse (siteXho1 ) comme le modèle, amorces p5 et p6, un volume total de 50 µL (la quantité de modèle défini à l’étape 4.1.1, 2 µL du mélange de primer 10 pmol, 2,5 enzyme U, 1 tampon de réaction de x) , et une polymérase spéciale qui est conçue pour générer une erreur haute débit¹⁹ (Figure 1). Apportez PCR comme indiqué dans le tableau 2.
   1. 4-5 µg de plasmide modèle permettent de contrôler la fréquence de mutation de 1 bp/Ko (kilobases).
      Remarque : Une concentration élevée (> 500 ng/µL) de plasmide, qui peut être obtenu à l’aide d’un kit de mini prep²⁰, est nécessaire.
2. Électrophorèse sur gel permet de confirmer un produit PCR de 2670 bp (1,2 % gel d’agarose). Gel de purifier ce produit de la PCR comme indiqué au point 2.5.

5. préparation de la Fusion des Fragments PCR (KAN, 3' UTR)

1. Effectuer la PCR à l’aide de pFA6a-KANMX6²¹ comme modèle, amorces p7 et p8, et les conditions énumérées dans le tableau 4 pour obtenir le fragment de marqueur (KAN). Gel de purifier le fragment 1 480-bp qui en résulte comme indiqué au point 2.5 (Figure 1E).
   1. Vérifiez si le codon du gène ciblé pour la mutation et de la région codante de ses gènes adjacents sont séparés par plus de 500 bp. Le terminateur endogène ne peut servir alors que cette région est inférieur à 500 bp ; plutôt, le terminateur d’ADH doit être utilisé au lieu de la terminaison endogène. Les modifications de protocole requises pour utiliser le terminateur ADH sont présentées au tableau 5.
      Remarque : Ces modifications ne s’appliquent que lorsque le terminateur de l’ADH , qui est disponible dans le plasmide pFA6a-3 ha-KANMX6, est utilisé à la place le terminateur endogène.
2. Effectuer des PCR avec le cloné rpt4 +-contenant le vecteur comme le modèle et amorces p9 et p10 dans un volume total de 50 µL (20 ng de plasmide cloné, 2 µL de 10 mix amorce pmol, enzyme de U 2, 1 x tampon de réaction), en utilisant les conditions présentées dans le tableau 6. Gel de purifier le fragment d’UTR obtenu 506-bp 3' (Figure 1E).

6. la génération de la construction de la Transformation de Fusion PCR (Figure 1E)

1. Préparer les 3 fragments (mutagénisé rpt4 +KAN et la région 3' UTR) à 50 ng/µL.
2. Effectuer la fusion que PCR des trois fragments à l’aide d’amorces p11 et p12, tel que décrit dans le tableau 7. (Le protocole de fusion PCR est une modification du protocole original²².) Purifier le principal produit PCR 4 398-bp.
   1. Utilisez rpt4 +: KAN:3'UTR des fragments à un ratio de 1:3:1 pour des résultats optimaux.
      Remarque : Le montant total de l’ADN de l’insert ne doit pas dépasser 500 ng. La quantité recommandée de rpt4 +: KAN:3'UTR est 50 ng:150 ng:50 ng. La région de mutagénisé est d’environ 1,6 Ko, donc le nombre de colonies de levures qui rendrait compte de toutes les combinaisons possibles de chaque base étant muté à trois autres minimum est de 1 600 x 3 = 4 800 colonies. Parce qu’une des réactions de transformation entraîne généralement des colonies de 400-500, au moins 10 réactions d’une valeur de fusion PCR construire est nécessaire. Ce besoin peut être vérifiée en augmentant tout simplement la quantité de réaction (c'est-à-dire, le nombre de tubes PCR) par un facteur de dix.

7. transformation de levure par électroporation (Figure 1F)

1. Inoculer levure à 10 mL de milieu Oui à saturation en incubant il pendant plus de 16 h.
2. Diluer les cellules à une densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) de 0,2 dans 200 mL de milieu Oui et incuber à 30 ° C sous agitation pendant 5-6 h, à OD₆₀₀ = 0,6 - 0,8.
3. Concentrer les cellules à OD₆₀₀ = 30, renoncer à quatre tubes coniques de 50 mL et refroidir sur glace pendant 10 min.
4. Récolter les cellules en effectuant la centrifugation à 1 050 x g pendant 3 min à 4 ° C. Placer les tubes et 10 electro-cuves sur la glace. Effectuez les étapes 7.3 à 7,8 sur glace.
5. Jeter le surnageant et ajouter 15 mL de 1,2 M sorbitol. Secouer doucement les tubes pour remettre en suspension les cellules.
6. Centrifuger les cellules à 1050 x g pendant 3 min à 4 ° C.
7. Répétez les étapes 7.4 et 7.5. Jeter le surnageant. Ajouter 500 µL de 1,2 M sorbitol dans chaque tube, remettre les cellules en suspension et recueillir toutes les cellules dans un tube conique de 15 ml.
8. Ajouter 1,2 M sorbitol à 2,4 mL (OD₆₀₀ = 10 / 0,2 mL). Maintenir le tube sur la glace.
9. Ajouter 200 µL de cellules sorbitol-suspendu (Assurez-vous qu’ils sont totalement suspendus) dans un tube de EP contenant la fusion PCR construire, bien mélanger et transférer l’échantillon dans une cuvette-electro.
10. Electroporate les cellules avec les options suivantes : champignons, ShS (2.00kV, 1 impulsion).
11. Ajouter 600 µL de 1,2 M sorbitol à chaque electro-cuvette pour un volume total de 800 µL et s’étend ensuite les cellules sur quatre assiettes Oui (200 µL/plaque). Dix electro-cuvettes distribuera à 40 Oui plaques.
12. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 24 h.
13. Exécuter l’électrodéposition de réplique pour YES + G418 et incuber les boîtes à 30 ° C pendant 3 jours.

8. sélection des Mutants hétérochromatine-déstabilisant et en recherchant les faux positifs

1. Pour chaque plaque Oui + G418, effectuer le placage réplique à Oui-Ade (faible Ade) et plaques de PMG-Ade (N° Ade). Incuber les boîtes de répliques pendant 1 à 2 jours à 30 ° C, jusqu'à ce que certaines des colonies sur les plaques Oui-Ade montrent une coloration rouge (Figure 1).
2. Comparer les plaques Oui-Ade et PMG-Ade et sélectionner des cellules qui montrent les rose ou gris sur la plaque de YES-Ade et poussent également sur la plaque de la PMG-Ade. Ne sélectionnez pas de colonies sans croissance sur PMG-Ade, car ils sont des faux positifs (par exemple, ce qui reflète que la cassette KAN a été intégrée à un site non visés ailleurs dans le génome).
3. Prendre environ 1 x 10⁵ cellules de chaque colonie et incuber à 10 µL de solution SPZ contenant 2,5 mg/mL zymolyase 100 T à 37 ° C pendant au moins 30 min. utilisation 1 µL de cette solution pour réaliser que le modèle de départ pour colony PCR (Figure 1 H).
   1. Faire SPZ (50 mL) en mélangeant 30 mL 2 M sorbitol, 4,05 mL 1 M Na₂HPO₄, 0,95 mL NaH₂PO₄ et 15 mL d’eau distillée (pH final, 7,5). Échantillons (5 mL) peuvent être complétées avec zymolyase et conservées en aliquotes de 500 µL à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
4. Effectuer l’électrophorèse sur gel (gel d’agarose à 1.2 %, 180V, 20 min) pour visualiser les résultats de + la PCR sur colonie. Sélectionnez les réactions qui présentent des bandes PCR de taille correcte et digèrent 5 µL de chaque produit de la réaction avec XhoI (4 enzyme U, 1 tampon de digestion x, bain-marie à 37 ° C, 1 h) pour écarter les faux positifs (Figure 1 H).
5. Effectuer l’électrophorèse sur gel pour visualiser les XhoI condensés (1,2 % gel d’Agarose, 180 V, 20 min). Marquer les colonies dont les produits PCR sont recoupées par XhoIet leur patch Oui + G418 plaques (Figure 1I).
6. Isoler ADNg provenant des cellules de levure de fission et de réaliser le séquençage des produits PCR²³. Comparer la séquence obtenue avec la séquence de type sauvage à identifier les mutations (Figure 1I).
7. Directement ré-introduire le mutation(s) à cellules de type sauvage en les transformant avec fusion des constructions amplifiées par PCR à partir de cellules mutantes²³. Utilisez le spotting pour confirmer le phénotype dans les cellules mutantes nouvellement formées (Figure 1J).
   1. Construction de transformation de fusion peut facilement être amplifiée par PCR avec des amorces p1 et p10 utilisant l’ADN génomique de mutants comme modèle dans un volume total de 50 µL (~ 1 µg ADN, enzymes de U 20, 1 x tampon de réaction) et en appliquant les cycles de réaction décrites dans tableau 2 . Transformation de la construction peut être faite en suivant les étapes 7.1-7.13.

Les mutants Rpt4 acquises en suivant les procédures décrites dans la Figure 1 peuvent être analysés en évaluant les couleurs des colonies. Les couleurs des colonies sont repérées sur les plaques pertinentes en diminuant le nombre de cellules dans la Figure 2. Le journaliste ade6 + inséré dans la région de l’hétérochromatine est réduit au silence dans le type sauvage et montre des colonies rouges en plaque Oui-Ade. Une fois l’hétérochromatine est déstabilisé et le journaliste ade6 + s’exprime, colonies blanches peuvent être observés en plaque Oui-Ade comme clr4Δ mutant. Les mutants Rpt4 filtrés sont indiquées. mutant RPT4-1 montre la déstabilisation de l’hétérochromatine plus sévère.

Figure 1 : Représentation schématique du protocole. (A) représentation schématique du produit PCR obtenus par le premier tour de l’ACP, qui s’effectue avec des amorces 1 et 2. (B) Restriction clonage du fragment rpt4 + . (C) la mutagénèse dirigée du vecteur cloné est utilisée pour introduire une mutation silencieuse qui ajoute un site de restriction XhoI . (D) mutagenèse aléatoire du rpt4 + région codante est effectuée à l’aide de la PCR d’erreurs. (E) le fragment muté rpt4 + , le fragment de KAN et le fragment 3' UTR sont rejoints par fusion PCR pour générer une cassette de transformation orientée. (F) les cellules de levure de Fission sont transforment avec la fusion construct PCR, qui remplace la séquence endogène rpt4 + par recombinaison homologue. (G) colonies KAN sélectionnés sont réplique plaqué à Oui-Ade (faible Ade) et plaques de PMG-Ade (N° Ade) et colonies positives sont sélectionnés. (H) PCR et ultérieures XhoI restriction du produit PCR sont utilisés pour éviter les faux positifs. (I) la mutation qui cause le phénotype est identifiée par rapiéçage des colonies choisies, la propagation des cellules, extraction de l’ADN génomique (ADNg) et le séquençage de la part de rpt4 +. (J) les mutations causatifs sont confirmées (et faux positifs sont exclus) en introduisant directement la mutation de cellules de type sauvage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Des mutants de la répression de l’hétérochromatine de Rpt4. Diagramme schématique du reporter otr1::ade6 + (en haut). 5 fois des dilutions successives de sélection filtré Rpt4 mutants ont été repérées sur les plaques indiquées par ordre croissant de niveau de déstabilisation de l’hétérochromatine (en bas). Ce chiffre a été modifié de l’article « le protéasome 19 s est directement impliqué dans la régulation de l’hétérochromatine répand chez la levure » par Seo et coll., 201724. La figure non cultivées se trouvent dans l’article original. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Le tableau 1. Composants de YES et plaques PMG

Le tableau 2. Programme recommandé de PCR pour la mutagénèse dirigée

Tableau 3. Programme recommandé de PCR PCR Erreurs

Tableau 4. Recommandé programme PCR pour obtenir le fragment KAN

Tableau 5. Changements nécessaires lorsque le terminator ADH est utilisé au lieu de la terminaison endogène

Tableau 6. Recommandé programme PCR pour obtenir le fragment 3' UTR

Tableau 7. Programme recommandé de PCR pour fusion PCR

Tableau S1 : Souche utilisée dans cette étude

Tableau S2 : Liste des amorces utilisées dans cette étude

Les auteurs n’ont rien à divulguer.