Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure

Résumé

Cet article décrit une méthodologie détaillée pour la mutagénèse aléatoire d’un gène cible chez la levure. À titre d’exemple, nous ciblons rpt4 +, qui code une sous-unité du protéasome 19 s et écran pour les mutations qui déstabilisent l’hétérochromatine.

Résumé

Mutagenèse aléatoire d’un gène cible est couramment utilisée pour identifier les mutations qui donnent le phénotype souhaité. Des méthodes qui peuvent être utilisés pour réaliser la mutagénèse aléatoire, erreurs PCR est une stratégie pratique et efficace pour générer un bassin diversifié des mutants (i.e., une bibliothèque mutante). Erreurs PCR est la méthode de choix quand un chercheur veut muter une région prédéfinie, comme la région codante d’un gène tout en laissant les autres régions génomiques pas affectée. Après que la bibliothèque mutante est amplifiée par PCR sujette aux erreurs, il doit être cloné dans un plasmide approprié. La taille de la bibliothèque générée par PCR erreurs est limitée par l’efficacité de l’étape de clonage. Toutefois, dans la levure de fission, Schizosaccharomyces pombe, l’étape de clonage peut être remplacée par l’utilisation d’une fusion très efficace en une seule étape PCR pour générer des constructions pour la transformation. Mutants de phénotypes désirées peuvent sélectionner à l’aide de reporters appropriés. Nous décrivons ici cette stratégie en détail, par exemple, un journaliste inséré à l’hétérochromatine centromérique.

Introduction

La génétique vers l’avant est une méthode classique dans lequel chercheurs cherchent des mutants naturels qui présentent un phénotype particulier et effectuent des analyses génétiques. Dans la génétique inverse, les mutations sont introduites dans un gène d’intérêt et le phénotype est examiné. Dans ce dernier cas, la mutagénèse aléatoire d’un gène cible est souvent utilisé pour générer un groupe de mutants qui sont ensuite sélectionnés pour les phénotypes désirés, comme la sensibilité à la température ou modifié l’activité enzymatique. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour réaliser la mutagénèse aléatoire, y compris les erreurs PCR¹; D’....

Protocole

1. préparation des médias

1. Préparer extrait de levure avec suppléments (oui), oui sans adénine (Oui faible Ade), Pombe Glutamate moyen (PMG¹²) et PMG sans adénine (PMG-Ade) en mélangeant les composants tel que décrit dans le tableau 1. Oui-Ade (faible Ade) et plaques de PMG-Ade ont tous les mêmes composants, mais l’adénine est absent de ce dernier.
   1. Utiliser le stock de sel (50 x) suivants : 52,5 g/L MgCl₂·6H₂O, 2 g/L CaCl₂·2H₂O, 50 g/L de KCl, 2 g/L Na₂donc₄ dans de l’eau distillée. Filtre à stériliser à l’aide d’un filtre de pores de 0,22 µm et ....

Résultats

Les mutants Rpt4 acquises en suivant les procédures décrites dans la Figure 1 peuvent être analysés en évaluant les couleurs des colonies. Les couleurs des colonies sont repérées sur les plaques pertinentes en diminuant le nombre de cellules dans la Figure 2. Le journaliste ade6 + inséré dans la région de l’hétérochromatine est réduit au silence dans le type sauvage et montre des colonies rouges en plaque Oui-Ade. Une fo.......

Discussion

Mutagenèse aléatoire via Erreurs PCR est un puissant outil pour générer un bassin diversifié de mutants dans une région donnée. Cette technique est particulièrement utile pour les études visant à évaluer la fonction d’une protéine dans une circonstance particulière. Par exemple, nous avons utilisé ici Erreurs PCR afin d’évaluer la fonction de la sous-unité de protéasome 19 s, Rpt4, dans l’entretien de l’hétérochromatine. En faisant varier la région ciblée par la PCR erreurs et ajuster les conditions de projection, nous a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1. Média
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
Extrait de levure	BD Biosciences	212720
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310
	ACR	16363-0250
Uracile  ;	Sigma-Aldrich	U0750
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8125
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	JUNSEI	19015-0350
MgSO4&bull ; 7H2O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
Phtalate de potassium	Sigma-Aldrich	P6758-500g
Inositol	Sigma-Aldrich	I7508-50G
Biotine	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Acide borique	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	Sigma-Aldrich	M7634-500G
ZnSO4&bull ; 7H2O  ;	JUNSEI	83060-031
FeCl2&bull ; 4H2O	KANTO	CB8943686
Molybdate de sodium dihydraté	YAKURI	31621
KI	JUNSEI	80090-0301
CuSO4&bull ; 5H2O	YAKURI	09605
D-myo-inositol	MP biomedicals	102052
Pantothenate	YAKURI	26003
Acide nicotinique	Sigma-Aldrich	N4126-500G
(NH4)2SO4  ;	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Agarose	Biobasique	D0012
G418, généticine	LPS	G41805
2. Réactions enzymatiques
PfuUltra II Fusion HS ADN polymérase	Aglient	600380	Pour la mutagénèse dirigée
GeneMorphII Kit de mutagenèse aléatoire	Aglient	200500	Pour la PCR sujette aux erreurs
Phusion ADN polymérase haute fidélité	Thermo Fisher	F-530L	Pour la PCR de fusion
Ex Taq  ; ADN polymérase	Takara	RR001b	Pour la PCR générale
BamH1	New England BioLabs	R0136S
Xho1	New England BioLabs	R0146S
Dpn1	New England BioLabs	R0176S
3. Equipement
Velveteen carré, noir	VWR	89033-116	Pour
réplique Outil de placage	réplique VWR	25395-380	Pour réplique
Électroporateur MicroPulser	Biorad	1652100  ;	Pour la transformation de la levure à fission
Cuvettes d’électroporation, espace de 0,2 cm	Biorad	1652086  ;	Pour la transformation de la levure à fission
Thermocycleur	Bioer	BYQ6078	pour la réaction de rampe de PCR de fusion  ;

Sulfate d’adénine