Nous présentons une méthode qui peut donner un aperçu de l’événements précoces qui sous-tendent la neurodégénérescence davantage et basée sur la technique de cerveau établies ex vivo , combinant les avantages des expériences in vivo et in vitro . En outre, il représente une occasion unique pour une comparaison directe du groupe traité et non traité dans le même plan anatomique.
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Article de méthode
Une autre approche pour étudier les événements primaires dans la neurodégénérescence utilisant des coupes de cerveau de Rat Ex Vivo
Dans cet article
Résumé
Résumé
Malgré les nombreuses études qui visent à développer des modèles animaux fiables qui soit le principal processus neurodégénérescence sous-jacent, très peu ont été largement acceptées. Ici, nous vous proposons une nouvelle procédure adaptée de la célèbre ex vivo cerveau tranche technique, qui offre une plus étroite en vivo-comme scénario que les préparations in vitro , pour étudier les premiers événements déclenchant la dégénérescence des cellules, comme observés dans la maladie d’Alzheimer (ma). Cette variation se compose des étapes simples et facilement reproductibles, qui permettent la préservation de la cytoarchitecture anatomique de la région du cerveau sélectionné et ses fonctionnalités locales dans un milieu physiologique. On trouvera différentes zones anatomiques du cerveau même, qui donne la possibilité d’effectuer des expériences multiples avec les traitements en question dans un site, dose et fonction du temps. Les limites potentielles qui pourraient affecter les résultats associés à cette méthodologie sont liées à la conservation du tissu, c'est-à-dire le maintien de son intégrité anatomique pendant les opérations de tranchage et d’incubation et de l’épaisseur de coupe, qui peut influencer l’analyse biochimique et immunohistochimiques. Cette approche peut être utilisée à différentes fins, p. ex., examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans des conditions physiologiques ou pathologiques, dépistage des drogues ou des essais de dose-réponse. Enfin, ce protocole pourrait également réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études comportementales. L’application rapportée ici a été récemment décrite et testée pour la première fois sur ex vivo rat tranches de cerveau contenant le prosencéphale basal (BF), qui est l’une des régions cérébrales touchées principalement dans AD. Plus précisément, il a été démontré que l’administration d’un peptide toxique provenant de l’extrémité C-terminale de l’acétylcholinestérase (AChE) pourrait inciter un profil AD, déclenchant, le long de l’axe antéro-postérieur de la BF, une expression différentielle de altérée dans AD, tels que le récepteur nicotinique alpha7 (α7-CNCDH), les protéines phosphorylées Tau (p-Tau) et la protéine bêta-amyloïde (Aß).
Introduction
AD est qu'une pathologie chronique caractérisée par l’atteinte neurodégénérative progressive affectant les zones du cerveau différentes, comme le cortex entorhinal (EC), BF, hippocampe (HC) et bulbe olfactif (OB)1,2,3, 4,5. Les derniers stades de développement AD mener à un déclin cognitif progressif, faisant de cette maladie la forme la plus courante de démence, représentant environ 70 % de tous les cas6. Malgré les tentatives étendues pour comprendre les étapes initiales causant des AD, il n’est pas actuellement une indication expérimentale définie élucider leur. En outre, la théorie la plus populaire - le « hypothèse amyloïde » - est plus en plus contestée car elle ne fournit pas un profil complet pour expliquer la pathobiologie de l’AD, ni une cible pharmaceutique qui s’est avéré efficace7,8 ,,9.
Une autre théorie qui reçoit une attention croissante suggère que les mécanismes initiaux au cours de la neurodégénérescence sont associés à un cluster neuronal principalement sensible aux AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. ce hub cellulaire hétérogène compris dans les projets BF, mésencéphale et le tronc cérébral, à plusieurs régions, tels que les EC et SC OB15,16. Malgré sa diversité dans la morphologie neuronale et la synthèse des neurotransmetteurs, ce noyau de cellules partage une caractéristique commune pour exprimer la douleur, qui peut également avoir une fonction non enzymatique17,18. Ce rôle non classiques comme un roman de signalisation molécule intervient dans le flux de calcium (Ca2 +) dans les neurones qui peuvent subir des événements trophiques ou toxiques en ce qui concerne le Ca2 + dose, disponibilité et neuronale âge17,18 , 19.
Au cours de la neurodégénérescence, la perte cellulaire observée serait donc associée à cette fonction non enzymatique17,18,20, qui est imputable à un peptide 30mer (T30) clivé de l’extrémité C AChE 20. en accord avec les résultats précédents, bord de culture cellulaire et préparations des21 de18,d’imagerie optique, nous avons démontré, à travers une approche originale basée sur ex vivo rat tranches de cerveau contenant des structures BF, qui provoquaient T30 un profil AD22. Plus précisément, cette nouvelle méthode offre un scénario plus physiologique que culture cellulaire puisqu’il conserve bon nombre des caractéristiques d’un tissu intact, allant d’anatomiques à la préservation des circuits, quoique pour une fenêtre de temps d’heures. Nous avons appliqué ce protocole pour examiner les événements qui se déroulent durant les premières phases de la neurodégénérescence, suivi de la réponse aiguë T30 sur demande.
Malgré le vaste corpus de littérature sur l’utilisation de cerveau, tranches d’enquêter sur les voies moléculaires implicitement dans les dommages neuronaux ou neurogenèse23,24, ce protocole prévoit pour la première fois un plus immédiat et sensible à la lecture par rapport à l’usage commun des tranches organotypique. Toutefois, comme c’est le cas pour organotypique sections du cerveau, cette procédure tranche aiguë peut également être adoptée à diverses fins, telles que l’évaluation des neuroprotecteurs ou molécules neurotoxiques, découverte des principaux changements moléculaires qui se produisent dans un processus spécifique, l’analyse immunohistochimique et essais pharmacologiques pour le système nerveux central les pathologies liées.
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Protocole
Toutes les études animales ont été effectuées en vertu de protocoles approuvés.
Remarque : Dans cette section, la séquence des principales phases effectuée au cours de la procédure expérimentale et l’intervalle de temps suggéré est fourni (Figure 1). Par ailleurs, une description étape par étape du protocole est complétée par un panneau indicatif, montrant des actions critiques allant de l’enlèvement de cerveau d’homogénéisation des tissus après la période d’incubation (Figure 2). Les détails concernant les matériaux et les instructions pour construire l’appareil et la phase suivante de l’analyse de WB sont décrites précédemment22.
1. surgical Tools, Vibratome paramètres et préparation de traitement
Remarque : Exécutez les étapes suivantes avant de commencer la procédure expérimentale :
- Préparer deux différents artificiel de liquide céphalorachidien (aCSFs), celle utilisée pour le découpage de cerveau et l’autre pour l’étape d’incubation décrite précédemment29. En bref, les concentrations de travail (en mmol) des deux aCSFs sont pour le FSCA de « découpage » : NaCl 120, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2,4 CaCl2, 2 MgSO4, 1,2 KH2PO4et 10 de glucose ; 6,7 chlorure de HEPES et 3,3 HEPES ; pH : 7.1. Certain temps pour le FSCA « enregistrement » : 124 NaCl, 3,7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 KH2PO4et 10 de glucose ; pH : 7.1.
- Bien mélanger les solutions puis mettre sur la glace et oxygéner le FSCA tranchage afin d’avoir froid tout en retirant le cerveau et les coupes ultérieures. Conserver à température ambiante (RT) et l’approvisionnement en oxygène à l’aCSF enregistrement.
- Placer les instruments sous le capot de dissection pour l’enlèvement de décapitation et le cerveau, c'est-à-dire, guillotine, trousse de dissection chirurgicale (ciseaux, pinces, lames) et spatule.
- Définir les paramètres vibratome en choisissant l’épaisseur de la tranche (300 µm dans cette préparation) et la fréquence à 7 et la vitesse à 6. Insérez la chambre vibratome dans son espace approprié et entourez-le avec de la glace.
- Ouvrir la valve de carbogen (95 % O2, 5 % CO2) pour oxygéner le « tranchage » (FSCA) lors de la coupe de cerveau. Sélectionnez le débit minimum, environ 2 mL/mn.
- Prenez deux tubes de 15 mL pour préparer les conditions pour tester. Ajouter dans un tube de 10 mL de l’aCSF « enregistrement » seul (groupe témoin) et dans l’autre, 10 mL de l’aCSF « enregistrement » enrichie en T30 à une concentration de 2 µM (groupe traité). Vortex les deux tubes et garder sur la glace jusqu'à leur utilisation dans la phase de préparation de l’installation (article 3).
2. anesthésie, Extraction de cerveau et tranchage
Remarque : Dans cette étude, 9 wild type P14 rats Wistar mâles ont été utilisés. Extraction du cerveau et tranchage suivantes constituent un élément essentiel du protocole puisqu’ils doivent être effectuées rapidement (moins de 10 min) afin d’éviter ou au moins ralentir les processus de dégénérescence des tissus.
- Ajouter 1,5 mL de 100 % p/p d’isoflurane sur une couche de coton dans la chambre de l’induction, placer l’animal à l’intérieur et fermez le couvercle. Attendez que l’animal est profondément anesthésié, confirmant l’absence de réflexe de la pédale et puis décapiter l’animal à l’aide de la guillotine.
- Garder la tête de l’animal dans un pot contenant glacee tranchage FSCA pendant l’étape de suppression du cerveau (Figure 2 a -C).
- Inciser la peau sur le crâne avec une lame chirurgicale, puis couper le crâne à l’aide de ciseaux en suivant la ligne médiane de la partie postérieure et aller de l’avant vers l’avant jusqu'à l’os au-dessus de l’OBs (Figure 2 a).
- Tirez latéralement les deux côtés du crâne à l’aide d’une paire de pinces pour avoir accès au cerveau (Figure 2 b). Insérer une spatule sur le ventre pour le cerveau, évider délicatement dehors et le conserver qu'il hydraté dans glacee FSCA « découpage » pendant environ 5 min (Figure 2).
- Disposer le cerveau sur un papier filtre et découper le cervelet à l’aide d’une lame (Figure 2D). Coller le cerveau verticalement sur le disque vibratome et l’insérer à l’intérieur de la chambre de sectionnement, remplissez-le avec glacee FSCA « découpage » et fournir de l’oxygène (Figure 2E).
- Ajuster l’intervalle de coupe et poursuivez le sectionnement de cerveau (Figure 2F). Recueillir les sections contenant la région d’intérêt, tels que le septum médial (MS), une bande diagonale de Broca (DBB) et de substantia innominata (SI), comme décrit précédemment22. De haut en bas, les trois tranches contiennent la rostrale (R), intermédiaire (I) et caudales (C) partie de la BF (Figure 2).
- Diviser le long de la ligne médiane de chaque section avec des petits ciseaux, obtenant deux hemislices spéculaires (Figure 2 H), utilisés individuellement sous le contrôle et l’état traité sur le même plan anatomique.
- Garder les hémisections dans la chambre de vibratome pendant 5-10 min, puis les transférer avec une pipette de verre dans une marmite bouillonnante contenant l’enregistrement fsca. Garder à la droite pendant environ 30 min pour récupérer.
- Remplir, dans l’intervalle, trois flacons en verre avec 3 mL de FSCA enregistrement seul (préalablement préparé à l’étape 1.6 pour le groupe témoin) et trois flacons de 3 mL de FSCA enrichie T30 (préalablement préparé à l’étape 1.6) dans le groupe traité.
3. préparation de la configuration
- Transférer les hémisections dans leurs flacons de verre correspondant (Figure 2I) afin d’avoir trois hemislices consécutifs (y compris la région BF rostrale, intermédiaire et caudale) pour le groupe témoin (cadre vert, Figure 2J) et leur correspondant à leurs homologues dans le groupe traité (cadre rouge, Figure 2J).
- Transférer le tissu cérébral avec deux différents types de pinceaux, un pour le hemislices de contrôle et un autre pour les homologues traitées, afin d’éviter toute contamination entre les conditions.
- Sceller chaque flacon en verre avec couvercle correspondant, présentant l’aiguille oxygénant (21G) (Figure 2J). Raccordez le tube principal de l’appareil à la source de carbogen (Figure 2 K). Livrer l’oxygène à la hemislices tout au long de la période d’incubation avec un débit minimal de 2 mL/min afin d’éviter tout mouvement du tissu cérébral et éventuels dommages mécaniques au cours de l’expérience. Commencer le 5 h d’incubation. Exécutez les étapes 3.1 à 3.3, moins de 5 min.
Remarque : Vérifiez fréquemment (toutes les 15-20 min) si l’oxygène est fourni dans tous les flacons et que son débit ne bouge pas le tissu du bas.
4. homogénéisation de l’échantillon
- Arrêter le débit d’oxygène après l’incubation et retirez tous les couvercles des flacons. Transfert de l’hemislices, en utilisant les brosses appropriées, dans des tubes de 1,5 mL contenant 250 µL de tampon de lyse, maintenir les tubes sur la glace (Figure 2 L). Pour rendre le lysis buffer, mélanger PBS 1 x avec des cocktails d’inhibiteurs de la phosphatase et la protéase fois dilué au 1/100 et homogénéiser les tissus avec des pilons différentes pour éviter la contamination entre les échantillons. Toutes ces actions au sein de 10-15 min.
- Centrifuger le cerveau lysat à 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Transvaser le surnageant dans tubes neufs et de conserver les échantillons à-80 ° C.
5. lecture de la Concentration de protéines et l’analyse par Western Blot
- Déterminer la concentration de protéine de chaque échantillon et ensuite préparer les aliquotes pour analyse par Western blot comme décrit précédemment22.
- Effectuer une analyse statistique pour évaluer les effets du traitement sur l’expression de la protéine.
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Résultats
Le protocole présenté ici indique que l’administration d’un peptide toxique, T30, module, d’une manière liés au site, l’expression de α7-CNCDH, p-Tau et bêta-amyloïdes dans les parties contenant les BF (Figure 3 a). Le récepteur nicotinique montre une augmentation significative dans la hemislice rostral traités par rapport à son homologue de contrôle (tranche 1, p = 0,0310) (Figure 3 b), tandis que la tranche intermédiai...
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Discussion
Le principal aspect du présent protocole, basé sur la technique de cerveau bien établie ex vivo , permet de tester simultanément deux hemislices spéculaires, obtenus à partir d’un même plan anatomique, surveiller leur réponse après l’application d’une particulière condition (contrôler ou traités) ; Cela offre donc un paradigme expérimental contrôlé aussi étroitement que possible. La possibilité d’évaluer à un temps, dose et ponctuelle, de sorte différente neurochimiques liés à l’atteinte neuronale, comme on le v...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent des intérêts financiers divergents. Susan A. Greenfield est le fondateur et président de Neuro-Bio Limited, une société privée et détient des actions dans la société. Emanuele Brai et Antonella Cogoni sont des employés de Neuro-Bio Ltd.
Remerciements
Ce travail a été financé par Neuro-Bio Ltd. Nous tenons à remercier le Dr Giovanni Ferrati et Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) pour leurs commentaires et conseils sur le manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorure de sodium (NaCl) | Sigma-Aldrich, Allemagne | S7653 | Réactif pour préparation d’aCSF |
| Chlorure de potassium (KCl) | Sigma-Aldrich, Allemagne | P9333 | Réactif pour préparation d’aCSF |
| Bicarbonate de sodium (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Allemagne | S5761 | Réactif pour préparation d’aCSF |
| Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Allemagne | 63138 | Réactif pour préparation d’un LCR d’un cac |
| clair de potassium monobasique (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Allemagne | P5655 | Réactif pour la préparation d’un LCR d’un |
| Hepes | Sigma-Aldrich, Allemagne | H7006 | Réactif pour la préparation |
| d’un acide de Hepes | Sigma-Aldrich, Allemagne | H3375 | Réactif pour la préparation d’un CSF d’un |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Allemagne | G7528 | Réactif pour la préparation du LCR aChlorure |
| calcium déshydraté | Sigma-Aldrich, Allemagne | 223506 | Réactif pour la préparation |
| du peptide T30 | Genosphere Biotechnologies, France | Peptide dérivé de l’AChE testé | |
| Kit de dissection chirurgicale | World Precision Instruments, USA | Article # : MOUSEKIT | Étape d’ablation du cerveau |
| Lames chirurgicales | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Étape d’ablation du cerveau |
| Papier filtre | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Préparation du cerveau pour le tranchage |
| Colle | Préparation du cerveau pour le tranchage | ||
| Vibratome | Leica, Allemagne | VT1000 S | Brosses à trancher |
| Manipulation | tissus | ||
| Cartouche | d’oxygènePhase de sectionnement et d’incubation | ||
| 1x Tampon phosphate salin (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Étape d’homogénéisation |
| Inhibiteurs de phosphatase | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Étape d’homogénéisation |
| Inhibiteurs de protéase | Roche complete PIC, USA | Étape d’homogénéisation | |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Étape d’homogénéisation |
| Microcentrifugeuse | |||
| Pierce 660 nm Dosage des protéines | Thermo Scientific, USA | 22660 | Concentration en protéines |
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Réimpressions et autorisations
