La Lambda sélectionnez cII système de détection de Mutation

Summary

Les auteurs décrivent un protocole détaillé pour le test de la mutation de la cII Lambda sélectionnez en cellules de rongeurs transgéniques ou les animaux correspondants traités avec un agent chimique/physique d’intérêt. Cette approche a été largement utilisée pour les tests de mutagénicité des cancérogènes dans les cellules de mammifères.

Abstract

Un certain nombre de modèles animaux transgéniques et les systèmes de détection de mutation ont été développé pour les tests de mutagénicité des cancérogènes dans les cellules de mammifères. Parmi ceux-ci, les souris transgéniques et le Lambda (λ) Select cII système de détection de Mutation ont été employés pour des expériences de mutagénicité par de nombreux groupes de recherche dans le monde entier. Ici, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour le test de mutation cII sélectionnez Lambda, qui peut être appliqué à des cellules de souris/rats transgéniques ou les animaux correspondants traitement avec un agent chimique/physique d’intérêt. Le protocole se compose des étapes suivantes : (1) isolement de l’ADN génomique des cellules ou des organes/tissus d’animaux transgéniques traitent in vitro ou in vivo, respectivement, avec un composé ; (2) récupération du vecteur navette lambda portant un gène de journaliste mutationnelle (c.-à-d., cII transgène) de l’ADN génomique ; (3) emballage des vecteurs sauvés dans les bactériophages infectieuses ; (4) infectant une bactérie hôte et mise en culture dans des conditions sélectives pour permettre la propagation des mutations induites cII ; et (5) marquant la cII-mutants et ADN de séquence analyse afin de déterminer la fréquence des mutants cII et spectre de mutation, respectivement.

Introduction

Un large éventail de modèles animaux transgéniques et les systèmes de détection de mutation ont été développés pour les tests de mutagénicité des cancérogènes dans les cellules de mammifères. Parmi ceux-ci, des souris transgéniques de Big Blue (dénommé ci-après BB) et le λ Select cII système de détection de Mutation ont été employées pour des expériences de mutagénicité par ce groupe et de nombreuses autres recherches groupes dans le monde^{1,2, 3,4,5,6,}....

Protocol

1. génomiques isolement des fibroblastes embryonnaires de souris

Remarque : Les fibroblastes embryonnaires de souris primaire sont isolés des embryons provenant de souris transgéniques BB avec le bagage génétique de C57BL/6, selon le protocole publié⁵³. Le produit de départ pour ce protocole se compose de 1 x 10⁶ à 1 x 10⁷ cellules de fibroblastes embryonnaires traitées avec un contrôle composé par rapport de test. La récolte et le comptage de ces cellules à l’aide de méthodes standard sont décrits dans les références^10,,du^54....

Results

Fonction de distribution de données, tests paramétriques ou non paramétriques sont utilisés pour déterminer l’importance de la différence dans la fréquence des mutants cII entre les groupes de traitement et de contrôle (c'est-à-direinduite par rapport aux fréquences mutants spontanés) . Comparaison des fréquences mutant induit cII inter-groupe de différence de traitement faite par divers (par paire) les tests statistiques, selon le cas. Le hypergéométriques test.......

Discussion

Le test de sélection cII λ est utilisé pour la détection des mutations dans le transgène cII récupéré de l’ADN génomique de cellules provenant d’organes/tissus de BB rongeurs³. Le génome de ces animaux transgéniques contient plusieurs copies en tandem du vecteur navette λLIZ chromosomiquement intégrées, qui transporte la cII (294 bp) et lacI (1 080 bp) transgènes, comme le Rapporteur mutationnel gènes^{1, 2}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	MO Bio Laboratories, Inc.	12112-05	Qualité bactériologique
BigDye Terminator v3.1 Kit de séquençage de cycle	Thermo Fisher Scientific	4337455	Aucun
Caséine Peptone	Alfa Aesar	H26557	Aucun
Gélatine	J. T. Baker	2124-01	Poudre
Glycérol	Fisher Scientific	BP 229-1 / M-13750	Aucun
LB Agar	Fisher Scientific	BP 9724-500	Aucun
QIAkit de purification PCR rapide	Qiagen	8104	50 réactions de purification PCR
Acétate de sodium trihydraté	Fisher Scientific	M-15756	Aucun
Taq5000 ADN Polymérase  ;	Qiagen	201207	Aucun Chlorhydrate
thiamine	Macron Fine Chemicals	2722-57	Aucun
Transpack Packaging Extract	Stratagene Corp., acquis par BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.	200223	50 réactions d’emballage
Tris Base Fisher	Scientific	BP 152-1 / EC 201-064-4	Aucun
Trypton	Biosciences	RC-110	Aucun