Desthiobiotin-streptavidine-affinité médiée par la Purification des protéines interagissant avec l’ARN dans les cellules de mésothéliome

L’expression des gènes et le niveau final du produit du gène peuvent être étroitement contrôlées en affectant la stabilité de l’ARNm et l’ARNm traduction taux¹. Ces mécanismes de régulation post-transcriptionnelle sont exercent à travers les interactions des protéines de RNA et/ou de liaison à l’ARN non codants (pratiques commerciales restrictives) avec l’ARNm ciblés. C’est généralement la région non traduite en 3' de l’ARNm (3' UTR - appartenant à la partie non codantes du génome²) qui contient des cis-éléments de régulation (CRE), qui sont reconnus par trans-agissant de facteurs tels que miRNA ou de pratiques commerciales restrictives ³. les mieux étudiés cis-élément au sein de la région 3' UTR, est le motif de l’élément riches adénine (ARE), qui est reconnu par les protéines de liaison AU spécifiques (AUBP) et, à son tour, induit un ARNm dégradation/désadénylation (sont-mediated decay) ou sur la stabilisation de l’ARNm⁴.

La taille de la région 3' UTR de calretinin (CALB2) d’ARNm est 573 bp long et contient un pentamère AUUUA putatif, tel que prédit par AREsite2, un outil de bioinformatic⁵. Compatibles avec la présence d’un motif sont présumé, le dosage de vecteur-journaliste de pmirGLO ont démontré un rôle dans la stabilisation de cet élément au sein de l’ARNm de CALB2⁶. Enfin, l' in vitro RNA-menu déroulant servait à identifier le AUBP qui stabilise calretinin ARNm à travers le motif sont.

Étant donné que toutes les ARN non codants interagissent avec les protéines⁷, l' in vitro RNA-menu déroulant est un bon moyen et des tests de première de choix pour identifier les RNA-Interactiens afin d’aider à décrypter les mécanismes moléculaires. Dans cette méthode de RNA-menu déroulant, des sondes d’ARN synthétisés dans le commerce, qui ont été marquées avec une forme modifiée de biotine (desthiobiotin) à l’extrémité 3' du brin d’ARN, ont été utilisés. Le RNA-desthiobiotin est immobilisée par une interaction avec la Streptavidine sur billes magnétiques, qui servent à tirer vers le bas qui interagir spécifiquement avec l’ARN d’intérêt lié aux protéines. Protéines non dénaturé et actives depuis le cytosol des cellules de mésothéliome sont utilisés comme source de protéines. Ces protéines liées à RNA sont éluées de billes magnétiques, courir à travers un gel SDS-PAGE de 12 %, transféré sur une membrane et sondés avec anticorps différents.

Dans la procédure de purification d’affinité standard streptavidine-biotine, dénaturation rude conditions sont requises pour perturber la liaison streptavidine-biotine forte irréversible pour éluer les protéines liées⁸, qui pourrait conduire à la dissociation de complexes protéiques. Contrairement à la biotine, desthiobiotin réversible se lie à la Streptavidine et est déplacé de façon compétitive avec une solution tampon de biotine, permettant l’élution douce des protéines et d’éviter l’isolement des naturellement biotinylé molécules⁹, ce qui suggère que la technique est idéale pour isoler les complexes de protéine native sous conditions natives.

In vitro les conditions de la liaison et rigueur, qui sont déterminés par la concentration en sel, agents réducteurs et pourcentage de détergent, devraient être proches de celles présentes dans le contexte cellulaire afin d’identifier les véritables in vivo des interactions. Les conditions de liaison mis en place dans les présentes ont été démontrées précédemment en fonction de l’identification de la HuR comme une protéine de liaison AU¹⁰. Cette approche pourrait gagner du temps, étant donné que l’optimisation des conditions de liaison approprié peut être long et difficile. En outre, cette méthode pourrait être utilisée comme un protocole de départ pour toute expérience de RNA-menu déroulant et optimiser progressivement en changeant la concentration des sels et des détergents, en modifiant le pourcentage de glycérol et en ajoutant autres sels. En outre, nous avons démontré que même une courte 25 nucléotides RNA-sonde contenant un pentamère sont-motif pourrait servir à démontrer l’interaction avec un AUBP spécifique.

1. préparation de la Fraction des protéines cytosoliques et nucléaires

1. Plaque 4 x 10⁶ ACC-méso-4 cellules dans un flacon de culture cellulaire T150 cultivées en milieu RPMI - 1640 milieu additionné de 10 % FBS, 1 x pénicilline/streptomycine (x 100) et 2 mM de L-Glutamine (200 mM). Quand les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 % (~5-5.5 x 10⁶ cellules), procéder à l’extraction de la protéine de fraction nucléaire et cytosolique.
   NOTE : Lignée cellulaire ACC-méso-4 a été obtenue du RIKEN BioResource Centre¹¹.
2. Aspirer le moyen, laver les cellules en ajoutant 15 mL de PBS 1 x, inclinez la plaque doucement plusieurs fois et aspirer la solution de PBS 1 x. Ajouter 3 mL de 0,25 % trypsine-EDTA et incuber le flacon de culture à 37 ° C pendant 3 min.
   NOTE : Regardez les cellules au microscope pour le détachement ; Si encore attaché robinet le ballon contre la paume de la main 3 fois.
3. Ajouter 7 mL du milieu RPMI 1640 additionné de 10 % FBS, 1 x pénicilline/streptomycine (x 100) et 2 mM de L-Glutamine (200 mM), recueillir les cellules dans un tube de 15 mL et tournez en bas à 200 x g pendant 5 min.
4. Aspirez le milieu Resuspendre le culot cellulaire avec 1,5 mL de la solution 1 PBS x, puis transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Tournez en bas à x 500 g et 4 ° C pendant 5 min. jeter le surnageant.
   Remarque : A partir de cette étape, exécutez toutes les étapes de centrifugation à 4 ° C et conserver tous les réactifs sur la glace.
5. Resuspendre le culot cellulaire avec glacé 1,5 mL de la solution 1 PBS x et centrifuger les cellules à 500 x g et 4 ° C pendant 3 min. éliminer le surnageant.
   Remarque : Les montants requis de CER I, CER II et réactifs de TNS sont 10, 0,55 et 5 volumes de culot estimé emballé volume, respectivement ; le protocole suivant suppose un volume de 20 µL. Nous vous recommandons de préparer uniquement la quantité nécessaire de réactif CER j’ai.
6. Ajouter 200 µL de réactif d’extraction cytoplasmique glacee (CER j’ai) additionné de 2 µL de 1 x inhibiteur de protéinase, par exemple, diluer 1 comprimé d’inhibiteur de la protéase (exempt d’EDTA) dans 500 µL d’eau pour obtenir 100 actions de x. Cette quantité de réactif CER j’ai suffit à lyser 20 µL d’un culot cellulaire volume emballé.
   1. Pour estimer le volume de granulés conditionnés cellulaire, comparer le tube contenant le culot cellulaire avec un tube de 1,5 mL rempli de 10, 20, 50 ou 100 µL de PBS 1 x.
7. Resuspendre le culot cellulaire vigoureusement Vortexer le tube pendant 15 s et incuber le tube sur la glace pour 10 min. Ajouter 11 µL de réactif d’extraction cytoplasmique glacee II (CER II) sur le tube, vigoureusement Vortexer pendant 5 s et incuber pendant 1 min sur la glace.
8. Vortex vigoureusement pendant 5 s et centrifuger le tube à 16 000 x g et 4 ° C pendant 5 min. transférer le liquide surnageant dans le tube propre préalablement réfrigéré sur la glace. Le surnageant est la fraction cytoplasmique qui est encore utilisé dans l’expérience de RNA-menu déroulant.
9. Resuspendre le culot restant dans 100 µL de réactif d’extraction nucléaire glacee (TNS) additionné de 1 µL d’inhibiteur de protéinase (x 100) et vigoureusement Vortexer pendant 15 s. Nous vous recommandons de préparer uniquement la quantité nécessaire de réactif NER additionné d’inhibiteurs de la protéase.
10. Incuber l’échantillon sur la glace pendant 40 min avec agitation occasionnelle pendant 15 s (toutes les 10 min).
11. Centrifuger le tube à 16 000 x g pendant 10 min. transfert le surnageant (c’est la fraction des protéines nucléaires) dans un tube propre préalablement réfrigéré.
12. Procéder immédiatement en mesurant la concentration de protéines à l’aide de la méthode bicinchoninic (BCA) (voir la Table des matières). Pour contrôler la pureté de la protéine de chaque fraction, effectuer l’immunotransfert (Figure 1) contre le α-tubuline (détection positive uniquement dans le cytosol) et Poly ADP-ribose polymérase - PARP (détection positive seulement dans la fraction nucléaire). Pour visualisation de protéines, reportez-vous à la section 4.
13. Afin de maintenir l’activité de la protéine et leur état natif, préparer 25 µL des aliquotes d’extraits cytosoliques et nucléaires. Clin d’oeil-gel ces portions en les plaçant dans l’azote liquide pendant 5 s et stocker directement à-80 ° C.

2. marquage de l’ARN avec Desthiobiotin

1. Sondes d’ARN synthétisé commercialement et HPLC purifiée. Remettre en suspension avec une eau exempte de nucléase à 10 µM.
   Remarque : La sonde séquences sont répertoriés dans le tableau 1.
2. Utilisez 50 pmol d’ARN par réaction de RNA-menu déroulant. Décongeler et garder tous les réactifs sur glace sauf pour PEG 30 %, utilisé à l’extrémité 3' étiquette de RNA oligo.
3. Transférer 5 µL de 10 sondes d’ARN µM, étiqueté comme CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) et non relié-RNA (IRE), dans 0,5 mL mince-mur microcentrifugeuse les tubes et les incuber dans une machine PCR à 85 ° C pendant 5 min. Placer les tubes immédiatement sur la glace.
   Remarque : Cette étape est importante, car elle favorise la relaxation et l’accessibilité de la sonde d’ARN pour l’étiquetage.
4. Pour une seule réaction 30 µL, ajouter dans le tube contenant du RNA Lange 10µl suivant : 3 µL d’eau libre nucléase, 3 µL de 10 x RNA Ligase tampon de réaction, 1 µL d’inhibiteur de RNase (40 U/µL), 1 µL Desthiobiotinylated Cytidine diphosphate (1 mM) et 2 µL de ligase d’ARN T4 (20 U/µL).
   Remarque : Pour préparer master mix A 3 échantillons en excès (3.2), mélanger 9,6 µL de nucléase eau libre, 9,6 µL de 10 x RNA Ligase tampon de réaction, 3,2 µL d’inhibiteur de RNase (40 U/µL), 3,2 µL Desthiobiotinylated Cytidine diphosphate (1 mM) et 6,4 µL de ligase d’ARN T4 (20 U/µL).
5. Ajouter avec précaution 15 µL de PEG 30 % à la réaction. Utilisez une autre astuce pour mélanger la réaction. Incubez la réaction du jour au lendemain à 16 ° C.
6. Le lendemain, préparer ce qui suit : 5 M de NaCl (frais/exempte de nucléase), chloroforme : alcool isoamylique 24:1 ratio (p. ex., par réaction - 96 µL chloroforme et 4 µL d’alcool isoamylique), glacé 100 % éthanol et glacée éthanol à 70 %.
7. Ajouter 70 µL d’eau exempte de nucléase aux tubes de réaction RNA-étiquetage. Ajouter 100 µL de chloroforme : isoamylique alcool et vortex brièvement. Spin down à 13 000 x g pour 3 min. Retirer avec précaution seulement la phase supérieure et le transfert dans un nouveau tube sans nucléase 1,5 mL ; Évitez de toucher la phase inférieure.
8. Ajouter 10 µL de 5 M NaCl, 1 µL de glycogène et 300 µL d’éthanol glacé de 100 %. Placer le tube à-20 ° C pendant 2 h.
   NOTE : À cette étape, l’expérience peut se poursuivre le lendemain.
9. Centrifuger à 13 000 x g et 4 ° C pendant 15 min. soigneusement éliminer le liquide surnageant sans déranger le culot. Ajouter 300 µL d’éthanol à 70 % glacée et centrifuger à nouveau à 13 000 x g et 4 ° C pendant 5 min.
10. Jeter le surnageant complètement et sécher le culot (15 min). Resuspendre le culot dans 20 µL d’eau exempte de nucléase.
    Remarque : Passez avec RNA-menu déroulant sur le même jour.
11. Incuber l’ARN à 90 ° C pendant 2 min et le placer sur la glace. Placez l’ARN marqué sur la glace lors de l’étape suivante du prélavage des streptavidine des billes magnétiques.
    NOTE : Un temps d’incubation plus longs peut endommager la sonde d’ARN.

3. ARN-protéine Pulldown

1. Prélavage streptavidine – magnétiques et incubation avec desthiobiotin-ARN
   1. Utilisez 50 µL de streptavidine billes magnétiques par 50 pmol RNA. Toutefois, cela doit être optimisée en fonction de l’expérience.
   2. Vortex le tube avec billes streptavidine-magnétiques pour 15 s et rapidement retirer 200 µL (mélange maître ; assez pour des réactions de 3 + 1) dans un coffre fort-serrure tube propre de 1,5 mL à l’aide coupe les pointes de pipette. Placer le tube sur un support magnétique, afin que les perles s’accumulent sur le côté du tube et attendent 1 min. Retirer le liquide de la remise en suspension.
   3. Laver les perles, retirer le tube du support magnétique, ajouter 400 µL de 0,1 M NaOH 0,05 M NaCl solution et doucement pipette monter et descendre plusieurs fois. Placer le tube sur le support magnétique. Attendre 1 min et recueillir le surnageant. Répéter cette étape.
   4. Laver les billes avec 200 µL de 100 mM NaCl. Retirez le surnageant.
   5. Ajouter 200 µL de 20 mM Tris (pH 7.5), remettre les billes en suspension en pipettant également, placer le tube sur le support magnétique, attendre 1 min et retirer le surnageant. Répétez l’étape.
   6. Enlever le tube du support magnétique, ajouter 200 µL de 1 x tampon de Capture de l’ARN et resuspendre streptavidine billes magnétiques au vortex brièvement. Enlever 50 µL de billes magnétiques de streptavidine et ajouter dans chaque tube d’ARN étiquetés à l’aide d’un coupe de pipette. Incuber les tubes pendant 30 min à température ambiante sur un rouleau.
2. Liaison de la protéine à l’ARN
   1. Placer les tubes dans un support magnétique, attendre 1 min et retirer le surnageant.
   2. Ajouter 50 µL de 20 mM Tris (pH 7.5) aux talons et remettre en suspension par pipetage. Placer les tubes dans un support magnétique, attendre 1 min et éliminer le surnageant. Répétez cette étape.
   3. Ajouter 100 µL de 1 x tampon de liaison protéine-ARN aux talons et remettre en suspension par pipetage.
   4. Pendant ce temps, préparer le mélange suivant : 10 µL de 10 x tampon de liaison protéine-ARN, 30 µL de glycérol à 50 %, 50 µg de protéines cytoplasmiques et exempte de nucléase jusqu'à 100 µL d’eau.
      NOTE : Préparer le mélange maître B 3 échantillons en excès (3.3) comme suit : 33 µL de 10 x tampon de liaison protéine-ARN, 99 µL de 50 % de glycérol, 165 µg de protéines cytoplasmiques et eau exempte de nucléase jusqu'à 330 µL. maintenir le tube de mélange maître B en glace.
   5. Placer les tubes dans le support magnétique, attendre 1 min et recueillir le surnageant. Ajouter 100 µL du mélange maître B, remettre en suspension par pipetage doucement verticalement et éviter de créer des bulles. Incuber les tubes de réaction pendant 60 min à 4 ° C sur un rouleau.
3. Lavage et élution
   1. Placer les tubes dans un support magnétique, recueillir le surnageant (qui ne circule dans - FT) et transférer dans un nouveau tube.
      Remarque : Gardez ce FT sur la glace pour une analyse ultérieure.
   2. Distribuer 100 µL de 1 x tampon de lavage sur les perles, resuspendre doucement, remettre dans le support magnétique, attendre 1 min et éliminer le surnageant. Répétez cette étape 2 fois.
   3. Ajouter 40 µL de tampon d’élution à billes magnétiques, mixer par pipetage de haut en bas et incuber à 37 ° C dans un agitateur de tube (950 tr/min) pendant 30 min.
   4. Placer les tubes dans un support magnétique, attendre 1 min et recueillir des échantillons éluées (c'est-à-dire l’éluat - E). Posez sur la glace et pour l’analyse en aval.
      NOTE : À cette étape, chaque sonde ARN testé se compose d’un intermédiaire (pi) et échantillon de l’éluat (E).

4. analyse de tache occidentale et sur polyacrylamide

NOTE : Voir le tableau 2 pour les recettes pour les tampons utilisés dans cette section. Effectuer un Western blot selon la méthode de Laemmli¹².

1. Handcast 12 % gel SDS-PAGE (10-puits, entretoise de 1,5 mm, 66 µL). Préparer un mélange de gel en cours d’exécution : 4 mL de solution mère de 30 % d’acrylamide-bisacrylamide, 2,4 mL de Tris inférieur buffer, 3,2 mL de dH₂O, 9,6 µL de TEMED, 96 µL de solution de persulfate d’ammonium 10 % (APS). Préparer le mélange de gel d’empilement : 3,25 mL de dH₂O, 0,5 mL de 30 % d’acrylamide - solution-mère de bisacrylamide, 1,3 mL de tampon Tris supérieure, 10 µL de TEMED, 20 µL de 10 % APS.
2. Ajouter 16,6 µL de tampon de x Laemmli 6 (par exemple, 14 mL de Tris/HCl/SDS pH 6,8 (tampon Tris supérieure), 2 g de SDS, 1,86 g de TNT, 6 mL de glycérol et 0,012 % bromophénol bleu ; conservé à-20 ° C) dans l’échantillon FT et 6,6 µL de tampon de x Laemmli 6 dans l’échantillon E. Incuber les échantillons pendant 5 min à 95 ° C.
3. Charger les échantillons (20 µL de FT et son ensemble éluer ~ 40 µL) et de les exécuter pendant 30 min à 60 V, continuant avec 20 V du jour au lendemain.
4. En utilisant un système d’electroblotting demi-sec, transfert de protéines sur une membrane en PVDF pour 80 min à 15 V.
   Remarque : La membrane PVDF doit être activée avant d’effectuer le transfert de protéines. Incuber la membrane dans le méthanol 100 % pendant 1 min, suivie d’une incubation de 2 min dans l’eau ultrapure.
5. Après le transfert des protéines, incuber le gel SDS-PAGE avec la solution de bleu de Coomassie pendant 3 h, suivie de trois étapes de lavage avec de l’eau ultrapure, chaque 30 min.
6. À la fin du transfert de protéines, sécher la membrane PVDF pour 1 h. réactiver la membrane comme indiqué dans l’étape 4.5. Bloquer la membrane 1 h avec 5 % de BSA à 1 x TTBS.
7. Incuber la membrane avec le premier anticorps : HuR ou mésothéline, tous deux dilué 1/1000 à 5 % de BSA à 1 x TTBS pendant 4 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.
8. Laver la membrane trois fois pendant 7 min dans 1 x TTBS et incuber à la peroxydase de lapin antisouris raifort (HRP)-conjugués anticorps secondaire dilué 1/10 000 à 5 % de BSA, 1 x TTBS.
9. Visualiser les protéines à l’aide de chimiluminescence améliorée et un imageur numérique.

Dans cette expérience, un fragment long de 25-nt du calretinin 3' UTR hébergeant sont motif (CALB2) 3' UTR (ARE) 25-nt a été utilisé pour tester si elle se lie spécifiquement à la protéine R homme-antigène (HuR), un stabilisateur d’ARNm connus. Pour tester la spécificité de l’élément sont, un ARN 25-nt sonde CALB2 3' UTR (mtARE) contenant une mutation sont-motif, qui a été montrée précédemment de supprimer l’effet de stabilisation du motif sont, a été utilisé6. L’ARN troisième sonde représente le témoin négatif, qui est un 28-nt sans rapport avec les ARN qui contient l’élément fer réagissant bien défini (sans rapport avec l’ARN (IRE)), connue pour lier des protéines fer-réactifs cytosolique13,14. HuR étant principalement localisé dans le noyau, mais des fonctions comme un ARNm-stabilisateur dans le cytosol15, extraction cytosolique/nucléaire a été réalisée afin d’obtenir les protéines actives du cytosol.

Pour démontrer la pureté des fractions cytosoliques/nucléaire, les protéines ont été analysées par Western blot, qui a montré que la α-tubuline a été détectée uniquement dans le cytosol, alors que la protéine PARP a été détectée que dans la fraction nucléaire, comme prévu ( Figure 1). L’éluat de la CALB2 3' UTR sont-sonde démontré liaison Hur HuR était absent dans l’éluat du mutant sonde CALB 3' UTR (mtARE). HuR était également absente dans l’éluat de la sonde d’ARN non apparentée qui lie la fer-réactive protéine (Figure 2 a). Pour démontrer davantage la spécificité entre la CALB 3' UTR (ARE) et HuR, la membrane a été en outre hybridée avec anticorps anti-mésothéline (MSLN), que cette protéine n’interagit pas avec de l’ARN. Éluats de tous les trois échantillons ont montré aucune présence de mésothéline. Pris ensemble, ce qui indique que le motif de stabilisation sont dans CALB2 3' UTR pouvez lier spécifiquement HuR protéine.

Coloration de Coomassie du gel (Figure 2 b) montre que des quantités égales de protéines ont été utilisées pour l’incubation avec les trois différentes sondes d’ARN. En raison de la faible quantité d’extrait cytosolique utilisé et le transfert à la membrane, cette coloration ne permettait pas pour la détection des protéines dans l’éluat voies (E), qui ont été détectées par l’analyse par Western blot.

Figure 1 : analyse par Western blot de 5 µg de la fraction des protéines cytosoliques et nucléaires. La protéine PARP est présente dans la fraction nucléaire (N), mais absent depuis le cytosol (C). Α-tubuline est présente dans le cytosol (C), mais absent dans la fraction nucléaire (N). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : la tache occidentale montre que HuR est capturé par 25-nt CALB2 3' UTR (ARE). A) FT : traversent après incubation avec sonde d’ARN ; E: liaison à l’ARN sondes et protéines éluées lors de l’incubation. Sondes : CALB2 3' UTR (mtARE) - fragment de 25-nt de calretinin 3' UTR qui contient 3 nucléotides mutés dans le motif sont ; UR RNA (IRE) - sonde ARN 28-nt avec un élément fer réagissant bien défini qui lie les protéines fer-sensibles. La membrane a été encore sondée pour mésothéline (MSLN), une protéine qui n’interagit pas avec de l’ARN. B) sondes de coloration du gel de Coomassie après transfert de protéines, ce qui démontre que des quantités égales de protéines ont été incubées avec de l’ARN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Séquences d’ARN sondes

Tableau 2 : Recettes

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.