Un modèle ligaturé anse intestinale chez les poulets gratuit anesthésiés pathogène spécifique pour étudier la Virulence de Clostridium Perfringens

Summary

Nous présentons ici un protocole pour créer chirurgicalement « anses intestinales ligaturées » dans l’intestin grêle de poulet. Cette procédure permet la comparaison de virulence in situ dans un seul hôte plusieurs des souches de Clostridium perfringens . Cette méthode diminue considérablement le nombre de poulets habituellement nécessaires pour in vivo des expériences similaires.

Abstract

Entérite nécrotique a été étudiée chez des poulets à l’aide de divers modèles d’infection in vivo . La plupart d'entre eux utilise une combinaison de facteurs prédisposants, comme la coccidiose et l’alimentation, avec gavage ou administration via le flux à l’aide de Clostridium perfringens. Dans ces modèles, la comparaison de plusieurs souches de c. perfringens pour études de virulence requiert un grand nombre d’hôtes à obtenir des résultats significatifs. Au cours de l’étude, la mortalité peut être élevée selon le modèle expérimental, donc soulevant des préoccupations éthiques concernant le bien-être des animaux dans la recherche. Le développement de nouveaux modèles d’infection nécessitant moins d’animaux pour étudier la pathogenèse, offrant encore des résultats statistiquement significatifs et valides, est important pour réduire l’utilisation des animaux en recherche. Anse intestinale de ligaturé modèles ont servi à étudier les infections clostridiales dans diverses espèces comme la souris, des lapins et des veaux. Suite à des interventions chirurgicales pour créer des segments de boucle ligaturés, les souches de c. perfringens sont injectés directement dans les boucles pour établir un contact étroit entre les bactéries et la muqueuse intestinale. Des échantillons de l’intestin grêle et le contenu luminal sont prises à la fin des procédures après quelques heures. Plusieurs souches bactériennes peuvent être inoculés dans chaque animal, ce qui réduira le nombre de matières obligatoires dans les expériences. En outre, les procédures sont effectuées sous anesthésie générale pour réduire la douleur animale. Chez les poulets, ce modèle serait plus approprié que l’administration orale de comparer la pathogénicité de la souche de c. perfringens car moins d’animaux sont nécessaires, aucun des facteurs prédisposants ne sont nécessaire pour provoquer la maladie et la douleur est contrôlée par des analgésiques . Le modèle de l’anse intestinale de ligaturé est mal décrit chez les poulets et normalisation est essentielle pour son utilisation optimale. Ce manuscrit fournit toutes les mesures nécessaires pour créer de nombreuses anses ligaturés intestinales chez les poulets et apporte des informations sur les points critiques pour obtenir des résultats similaires.

Introduction

L’utilisation de modèles animaux pour l’étude des maladies infectieuses affectant les humains et les animaux est un outil central dans l’évaluation des facteurs de virulence régulant la pathogenèse d’une condition spécifique, aussi bien quant à élaborer des stratégies pour prévenir ou guérir des maladies¹. Malgré les nombreux avantages de l’utilisation de modèles animaux pour étudier diverses maladies, les préoccupations éthiques concernant cette pratique sont présentent. Les chercheurs doivent minimiser l’utilisation des animaux tout en obtenant des résultats importants et valides. Le concept des 3 principes Rs (Replace, Reduce et affiner) a été élaboré pour s’assurer que les questions de bien-être ont été abordées dans ces essais. Dans les études de poulet d’entérite nécrotique, modèles in vivo de poulet sont utilisées pour enquêter sur l’étiologie, prévention et traitements de cette condition^2,3,4,5. Les souches pathogènes de c. perfringens porteurs de facteurs de virulence spécifique, tel que la toxine de NetB⁶, sont administrés pour provoquer l’entérite nécrotique en poulets⁷. Le principe de remplacement est donc difficile à réaliser dans ce cas, que ces facteurs de virulence n’est peut-être pas aussi critiques chez d’autres espèces animales. La plupart des modèles d’entérite nécrotique chez les poulets utilisent une combinaison de facteurs de risque comme la coccidiose et modifié le régime pour provoquer l’entérite nécrotique suivie par gavage du bouillon de culture contenant un grand nombre de c. perfringens². Ces modèles induira la maladie chez un grand nombre de poulets, et la mortalité peut être importante dans ces essais⁸, soulevant ainsi des préoccupations sur les principes de réduction et de raffinement dans la recherche sur les animaux.

Modèles de boucles ligaturé intestinaux sont une alternative souhaitable pour l’étude des maladies causées par des pathogènes intestinaux en ce qui concerne le principe de réduction et raffinement. Dans ces modèles, les segments intestinaux appelés « boucles » sont créés en plaçant des ligatures le long du tractus intestinal pour former des compartiments indépendants et hermétiques où les agents pathogènes peuvent être injectés seuls⁹ ou avec d’autres molécules, telles que des vaccins candidats ^{10 , 11}. les agents pathogènes d’intérêt sont placés en contact étroit avec les cellules intestinales et après quelques heures de temps de l’infection, des échantillons intestinaux peuvent être récupérés pour une analyse ultérieure. Ceci permet l’utilisation de multiples traitements et groupes témoins chez le même animal. Analyse statistique peut être effectuée avec des modèles de mesures répétées, qui augmente la capacité de discrimination entre les groupes et réduit le nombre de poulets nécessaires par rapport aux essais de gavage oral. Aussi, interventions chirurgicales et des fois une infection ultérieure sont effectuées sous anesthésie générale continue et l’analgésie, minimisant ainsi la douleur animale. Boucle fermée des trompes sont un modèle idéal pour réduire le nombre d’hôte et de créer un système plus humain dans la recherche sur les animaux.

Anses intestinales de ligaturé modèles sont bien décrites chez diverses espèces, comme les veaux, les lapins et les souris^2,9, mais mal décrit dans poulets⁷. Pour une utilisation optimale de ce modèle chirurgical, l’exécution et la technique appropriée sont essentielles pour la création des anses intestinales ligaturées à éviter tout dommage à l’intégrité intestinale. L’objectif de ce manuscrit est de décrire une méthode étape par étape dans la création de multiples anses intestinales dans un modèle de poulet. Cette technique est limitée par la compétence et l’expérience du chirurgien comme procédures précises sont essentielles pour la réussite du projet.

Protocol

Toutes les procédures avec l’utilisation des animaux vivant ont été autorisés par le Comité d’éthique de la faculté de médecine vétérinaire, Université de Montréal (CÉUA, « Comité d » éthique de l’utilisation des Animaux »).

1. considérations avant la chirurgie

1. Sélectionnez 10 semaines agent pathogène spécifique gratuit (SPF) poulets leghorn pour la chirurgie.
   Remarque : Leur poids doit être de 1,0 à 1,2 kg.
2. Retirer l’aliment 12 h avant les procédures pour vider l’intestin.
3. Avant la chirurgie, placer les poulets sous anesthésie générale selon un protocole vérifié par un anesthésiste. Premedicate chaque poulet 15 min avant la chirurgie avec une injection intramusculaire (IM) de midazolam 1 mg/kg et butorphanol 4 mg/kg. Répète, toutes les 4 h, l’injection de butorphanol 4 mg/kg IM ou quand les changements de modèle de respiration et la fréquence augmente pendant l’anesthésie. Pour l’anesthésie générale, au cours de toutes les procédures, administrer isoflurane à une concentration comprise entre 1,5 et 2,5 % avec un tube par voie intratrachéale.
   Remarque : L’utilisation de prémédication pour la sédation et l’analgésie est recommandée car ils seront significativement améliorer la profondeur de l’anesthésie, réduire les quantités d’anesthésiques nécessaires au cours de toutes les procédures, ainsi que permettre aux chercheurs de contrôler les niveaux de douleur.
4. Surveiller l’anesthésie en enregistrant la température corporelle, rythme cardiaque et électrocardiogramme (ECG), respiratoire et du rythme, saturation en oxygène, expirée le dioxyde de carbone (CO₂) et les réflexes neurologiques.
   Remarque : Une personne doit être assignée à surveiller ces paramètres tout au long de toutes les procédures.
5. Suivre les principes de la stérilité dans les interventions chirurgicales. Veiller à ce que le chirurgien et le chirurgien adjoint habillent avec des robes de chambre stériles, gants, un masque et des lunettes de protection conformément aux protocoles préopératoires institutionnels. Veiller à ce que le chirurgien frotte les mains avec une brosse stérile imprégnée de gluconate de chlorhexidine jusqu’au coude en mettant l’accent sur les ongles et la surface de chaque doigt.
6. Stériliser les instruments chirurgicaux avec un stérilisateur.

2. champ opératoire préparation

1. Tout d’abord, supprimez manuellement les plumes de l’abdomen avec une traction douce.
2. Frotter le site chirurgical avec chlorhexidine gluconate détergent imprégnés stérile pinceau. Frottez doucement la peau du centre vers l’extérieur pour un temps de contact total de 5 min sans revenir vers le centre.
3. Effectuer 3 passages alternatifs sur le site de la chirurgie avec une solution de gluconate de chlorhexidine et d’alcool isopropylique à l’aide de gaze stérile.
   Remarque : Le passage doit commencer à partir du milieu du site chirurgical aux frontières pour éviter la contamination des zones non désinfectés au site chirurgical.
4. Placez le drapé chirurgical stérile sur le poulet.

3. extraction de l’intestin grêle de la cavité abdominale

1. Inciser le drapé chirurgical avec des ciseaux à exposer seulement la peau du site chirurgical.
2. Inciser la peau en effectuant une incision de basse-médiane forme '' L'' avec une lame de bistouri #3.
   1. Commencez la première incision 1 cm caudale au sternum et à 1 cm crânienne pour le cloaque.
   2. Inciser la deuxième perpendiculaire à la première incision. Démarrez à partir de l’extrémité caudale de la première incision et continuez 5 cm sur le côté gauche de l’abdomen en suivant la ligne de bassin.
      Remarque : Cette ouverture va créer un rabat qui permettra une extraction plus facile des intestins.
3. Avec la chirurgie, ciseaux, couper le péritoine et des muscles abdominaux avec le même motif de forme '' L'' pour ouvrir la cavité abdominale.
   Remarque : Ceci exposera les sacs aériens. Intestins sont situées sous ces structures. Sacs aériens doit être humidifiés avec gazes imprégnées de stérile saline 0,85 % pour éviter la dessiccation et une rupture possible tout au long de la procédure.
4. Insérer un pied de nez spay accrocher dans la cavité abdominale en suivant la paroi abdominale gauche et travailler le moyen de contourner les sacs aériens abdominaux.
5. Doucement, extérioriser les intestins et ces étalée sur le champ opératoire.
   Remarque : Conservez les intestins humidifiés par pulvérisation souvent stérile saline 0,9 % dans l’ensemble de la procédure. En outre, gazes humidifiés avec du sérum physiologique stérile peuvent être placés sur les intestins pour éviter la dessiccation.
6. Prenez les intestins à l’aide d’une gaze stérile sèche et retirez doucement l’intestin grêle par traction manuelle pour exposer le jéjunum.
   NOTE : Les vaisseaux mésentériques est fragiles et une tension excessive peut entraîner une rupture qui peut entraîner des lésions ischémiques intestinales et grandement compromettre l’issue de la procédure.

4. fabrication des anses intestinales

1. Création de boucle n ° 1.
   1. Placer une ligature simple avec un matériau résorbable synthétique multifilament de polyglactin dans le jéjunum proximal en évitant la ligature des principaux vaisseaux mésentériques.
   2. Placer une ligature distale 2 cm de la ligature proximale.
      NOTE : Ligatures Simple faits avec le matériel de suture multifilament sont placés le long du tractus intestinal pour créer des segments hermétiques. Un schéma (Figure 1) décrit l’emplacement de toutes les ligatures. Les boucles se composent d’une ligature proximale et distale, séparée par 2 cm.
2. Création d’interloop n ° 1.
   1. Placer une ligature simple 0,5 cm aborally à la ligature distale de boucle n ° 1.
      Remarque : Entre les boucles successives, il y a interloops de 1 cm, c'est-à-dire des segments qui une séparation physique entre les boucles. Pour probablement diminuer le risque de contamination croisée d’une boucle à l’autre, une ligature simple est placée au milieu de l’interloop (0,5 cm de la ligature distale et proximale de 2 boucles adjacentes). Cela réduit le risque d’un contaminant de fuite éventuelle d’une boucle de rejoindre la ligature d’une boucle adjacente. Ces segments ne sont pas obligatoires, mais diminueront le risque de contamination croisée.
3. Création de boucles ultérieures et interloops.
   1. Répétez les étapes 4.1 et 4.2 pour obtenir le nombre de lignes souhaités.
      Remarque : Dans cette expérience, 9 boucles et 8 interloops ont été créés. Longueur totale s’élevait à 26 cm. Le nombre de lignes peut être ajusté selon l’étude.

5. injection de souches de Clostridium perfringens dans the Loops

1. Injecter avec une seringue stérile et une aiguille 26 G l’agent pathogène en boucle n ° 1. Insérer délicatement l’aiguille sur le côté antimesenteric de l’intestin à un angle de 45°.
   Remarque : Dans cette expérience, 0,2 mL de coeur-cervelle (BHI) contenant 1 x 10⁶ UFC (unités formant colonies) de c. perfringens dans la phase de croissance logarithmique a été injecté dans chaque boucle. 5 différentes souches ont été injectés dans les 5 boucles différentes et les 4 autres boucles ont été injectés avec un contrôle négatif ne contenant aucune bactérie (BHI stérile), alternant des pathogènes et des boucles BHI stériles.
2. Répétez l’étape 5.1 à injecter toutes les boucles.
3. Doucement, remplacer le tractus intestinal dans la région dorsale de la cavité abdominale, sous les sacs aériens.

6. fermeture de la cavité abdominale

1. La suture du péritoine et des muscles abdominaux.
   1. Avec un motif simple suture continu à l’aide d’un matériau résorbable synthétique multifilament de polyglactin de suture du péritoine et des muscles abdominaux le long du bassin (effectuée à l’étape 3.3).
   2. Suture du péritoine et des muscles abdominaux du sternum pour le cloaque (effectuée à l’étape 3.3. avec un motif simple suture continu à l’aide d’un matériau résorbable synthétique multifilament de polyglactin.
2. La suture de la peau.
   1. À l’aide d’un matériau synthétique multifilament polyglactin et un motif simple suture continue, refermer l’incision de la peau le long du bassin effectuée à l’étape 3.2.
   2. En utilisant le même matériau de ligature multifilament et un motif simple suture continue, refermer l’incision de la peau du sternum à la fait à l’étape 3.2 du cloaque.

7. conclusion

1. Après les interventions chirurgicales, garder le poulet sous anesthésie générale avec l’utilisation adéquate des analgésiques pour minimiser la douleur animale pendant la durée de l’infection. Poursuivre la surveillance anesthésique pour assurer un niveau adéquat de l’anesthésie.
2. Après l’heure souhaitée de l’infection, humainement euthanasier le poulet par dislocation cervicale sous anesthésie générale.
   Remarque : Pour ces procédures, le temps nécessaire pour induire des lésions microscopiques avec des souches pathogènes de c. perfringens a 7 h.
3. Avec une lame de bistouri #3, couper un 0,5 cm section longue boucle de 1 cm et le placer dans 10 % de formol pour analyse pendant la nuit et encore histopathologiques de fixation.
4. Avec la même lame de bistouri Swann-Morton, couper la partie restante de la boucle et le placer dans un tube de microcentrifuge stérile pour l’isolement des souches de c. perfringens dans chaque analyse bactériologique plus de boucle pour leur caractérisation génétique.
5. Répétez les étapes 7.2 et 7.3 pour toutes les boucles en changeant la lame de bistouri entre chaque boucle.

Results

Un schéma de l’anses intestinales 9 et 8 interloops est illustré à la Figure 1. Dans ce modèle, un total de 9 boucles et 8 interloops sont créés avec des ligatures simples. Une boucle se compose de proximales et distales des ligatures espacées de 2 cm à partir de la ligature proximale. Deux boucles adjacents sont séparés par un interloop de 1 cm. Pour diminuer le risque de contamination croisée entre les boucles par la fuite d’une ligature, une ligature inter...

Discussion

Modèles d’anses intestinales ont été décrites chez de nombreuses espèces d’étudier l’interaction hôte-pathogène et la pathogenèse des maladies causées par différents agents pathogènes intestinaux, comme les Clostridium perfringens, Clostridium difficile et Salmonella enterica^7,9,13,14,15. Il a également été utilisé pour analyser la r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Scrub 747	Becton Dickinson and Company		Brosse stérile imprégnée de détergent au gluconate de chlorhexidine. Aucun numéro de catalogue disponible. Adresse Web : https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes  ;
Alcool isopropylique 70 % USP 4 L	Alcool isopropylique commercial	P016IP70	Adresse Web : http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine	Sigma-Aldrich	282227-1G	Solution de gluconate de chlorhexidine, doit être diluée à 4 %. Adresse Web : http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Champ chirurgical petit (27 po x 24 po) avec fenestration de 3 x 6 po	Produits vétérinaires spécialisés	32724	Adresse Web : http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog. detail&productgroup_id=15
Lames de scalpel #3	Swann-Morton	301	Adresse Web : https://www.swann-morton.com/product/16.php
Saline stérile NaCl 0.9 %	Sigma-Aldrich	S8776-100ML	Adresse Web : http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0	Ethicon	D9003	Matériau de suture résorbable multifilament Polyglactin. Adresse Web :
http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture Seringue 1 ml avec aiguille 26G	Becton Dickinson and Company	329652	Adresse Web :
https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes Brain Heart Infusion	Sigma-Aldrich	1104930500	Adresse Web : http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
tube Eppendorf	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	Tube de microcentrifugation. Adresse web : http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Solution de formol, neutre tamponnée, 10 %	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	Rapport tissu : formol de 1:10 pour une fixation adéquate. Adresse web : http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
Clostridium perfringens souches	Universit ; de Montré ; al, Chaire en recherche avicole	N/A	Spécifique à chaque laboratoire, disponible sur demande auprès de l’auteur correspondant