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Article de méthode

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

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DOI :

10.3791/57526

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20 avril 2018

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1Centre de recherche du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neuroscience, Université de Montréal, 3Department of pathology and cellular biology, Université de Montréal, 4Department of Pediatrics, Université de Montréal

Dans cet article

Résumé

Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

Résumé

Interneurones GABAergiques (INs) sont des composantes essentielles des réseaux neurones qui animent la cognition et le comportement. INs destiné à alimenter le cortex migrent tangentiellement depuis leur lieu d’origine dans le télencéphale ventral (y compris des éminences ganglionnaires médiales et caudales (MGE, CGE)) à la plaque corticale dorsale en réponse à une variété d’intrinsèques et extrinsèques indices. Différentes méthodes ont été développées au cours des années à manipuler des voies spécifiques et étudier comment ils règlent les changements cytosquelettiques dynamiques requis pour la bonne génétiquement en migration. In utero électroporation a été largement utilisée pour étudier l’effet de la répression génique ou des sous-types de surexpression à IN spécifique tout en évaluant l’impact sur la morphologie et position finale. Cependant, alors que cette approche est facilement permettant de modifier les cellules pyramidales radialement migration, il est techniquement plus difficile lorsque Assur In utero électroporation de ciblage génère un rendement faible, étant donné les taux de diminution de la survie des petits lorsque électroporation a lieu avant la e14.5, comme d’habitude lorsque l'on étudie les INs dérivé de MGE. Dans une approche alternative, MGE explants permettent d’accéder facilement à la MGE et facilitent l’imagerie des INs génétiquement modifiés. Toutefois, dans ces explants, INs migrer dans une matrice artificielle, dépourvu de repères d’orientation endogène et thalamiques entrées. Cela nous a amenés à optimiser une méthode où les INs peuvent migrer dans un environnement plus naturaliste, tout en contournant les défis techniques de in utero des approches. Dans cet article, nous décrivons la combinaison de l’ex utero électroporation de cerveaux de souris embryonnaire suivie organotypiques facilement la voie ferrée, image et reconstruire génétiquement modifiés INs migrant le long de leur parcours naturels en réponse à signaux endogènes. Cette approche permet pour les deux la quantification des aspects dynamiques de migration avec l’imagerie confocale Time-lapse, ainsi que l’analyse détaillée des différents paramètres morphologiques à l’aide de reconstitutions neuronales sur les tissus immunomarquées fixe.

Introduction

Corticales interneurones GABAergiques (INs) sont diverses en ce qui concerne leurs propriétés biochimiques, connectivité et les propriétés physiologiques et ils véhiculent des fonctions différentes dans des réseaux matures1,2,3 ,4,5. La spécification de différents sous-types des INs corticale est étroitement contrôlée par le biais de cascades génétiques qui ont été étudiés1,2. La majorité (70 %) des corticales GABAergic INs proviennent de géniteurs dans l’éminence ganglionnaire médial (MGE), une structure embryonnaire située sur le ventre et doit migrer sur des distances relativement longues pour atteindre la plaque corticale1, 2 , 6. tandis que les cellules pyramidales corticales migrent radialement de la zone ventriculaire (VZ) à la plaque corticale le long de l’échafaudage de la glie radiale, la migration tangentielle de l’INs, qui ne sont pas attachés à un tel échafaudage, exige une variété d’intrinsèque et signaux extrinsèques pour attirer la migration des neurones vers la plaque corticale, tout en guidant des structures corticales non2,7,8. Après la sortie du cycle cellulaire, INs sont repoussés de la MGE par chimio-répulsive repères exprimées au sein de la VZ de la MGE, qui déclenche la migration tangentielle vers la plaque corticale9,10. La migration INs éviter le striatum avec l’aide de différents indices répulsive11 et, après avoir atteint la plaque corticale, ils passer d’une tangente à un mode de migration radial et atteint leur position finale laminaire, en partie en réponse aux signaux du pyramidal les cellules12 et autres populations cellulaires13. La migration de l’INs, en ce qui concerne les autres populations neuronales, implique divers changements morphologiques dynamiques afin de permettre le mouvement réel du neurone. Ce que l'on appelle locomotion neuronale est caractérisée par des cycles répétitifs de trois étapes successives : l’allongement d’un processus de premier plan, un mouvement actif antérograde du noyau (nucleokinesis) et la rétraction de la fin du processus14. EN migration est réglementée par les nombreux signaux intrinsèques et extrinsèques qui alimentent la ramification et remodelage actif du processus de premier plan pour guider l’INs dans le bon sens, déterminer l’orientation et vitesse de migration14,15 ,,16.

Les déterminants de la régulation corticale en migration ont été largement étudiées ces dernières années1,2,7,17,18,19,20, et perturbation dans certains de ces acteurs moléculaires a été postulée à conduire à des troubles du développement neurologique, comme pédiatrique réfractaires épilepsie ou l’autisme du spectre des troubles1,2,21, 22 , 23 , 24. par conséquent, le développement de diverses approches in vitro et in vivo a été poursuivi pour faire avancer notre capacité à étudier ce processus dynamique, comme précédemment examiné25. Méthodes in vitro , y compris le test de chambre de Boyden et le test de choix Stripe, fournissent le moyen le plus rapide et plus reproductible d’évaluer le besoin et l’impact cellules autonomes de certains gènes ou de protéines au cours de la migration neuronale, sans l’influence d’autres facteurs25. Ces analyses sont particulièrement utiles lorsqu’il est combiné avec l’imagerie live8,26,27. Avec ces techniques, INs sont facilement Récupérée de e13.5 MGE et isolé par une dissociation enzymatique et mécanique, après quoi les différentes voies de signalisation et signaux de guidage peuvent être étudiées, tel qu’illustré précédemment8,28 . Cependant, ces essais ont lieu dans une matrice extracellulaire artificielle en l’absence d’architecture tissulaire en trois dimensions, qui peut modifier les propriétés neuronales de comportement et de la cellule, susceptibles d’influer sur cell migration et/ou survie25. Pour contourner ces limitations, les explants MGE ex vivo ont été développés comme outil de rechange pour quantifier les modifications morphologiques dynamiques survenant au cours de la migration ainsi que des paramètres tels que la vitesse et l’orientation14, 29. Génération d’explants de MGE est relativement simple et a été abondamment décrit ailleurs30. Elle implique le bordé d’un petit extrait de la MGE sur une monocouche de cellules corticales mixtes ou dans un mélange de matrigel et collagène en présence de signaux attractives ou répulsives25, même si ces derniers sont optionnels31. Des explants MGE permettant de haute résolution d’imagerie de cellules peu marquées, de simplifier l’étude des processus intracellulaires, comme le remodelage du cytosquelette durant les principaux processus de ramification, comme indiqué précédemment32,33 ,34 et dans la présente étude. MGE explants ont été utilisés avec succès pour évaluer les changements cytosquelettiques dynamiques lors de migration dans un environnement 2D, par exemple après des manipulations pharmacologiques ou chimiotactiques spécifiques (voir, par exemple, Tielens al 201633) . Cependant, avec cette approche, INs migrent au sein d’une matrice artificielle, et cela pourrait changer dans le comportement et la reproductibilité et la signification des résultats expérimentaux.

En revanche, dans l’utérus électroporation permet la manipulation génétique des INs dans leur milieu d’origine et est une méthode largement utilisée d’évaluer rapidement et efficacement l’impact du gain et la perte de la fonction du gène tout en contournant les limitations de knockout coûteuse et chronophage et knock-in stratégies25,35. In utero électroporation peut être biaisée vers en cellules souches à l’aide de promoteurs spécifiques de type cellulaire et en positionnant les électrodes vers des structures ventromédian, y compris le MGE36. En outre, dans l’utérus électroporation permet l’expression opportune de constructions expérimentales dans les 1-2 jours, comparativement aux 7-10 jours requis pour construire l’expression utilisant virale vecteurs25. Toutefois, dans l’utérus électroporation d’en progéniteurs tend à être de faible rendement. En effet, bien que les progéniteurs de cellule pyramidale situées dans la zone ventriculaire dorsale peuvent être efficacement transfectées utilisant in utero électroporation, ciblage des structures plus ventralement situés, comme le MGE, est techniquement plus difficile, surtout dans les petites e13.5 embryons et le taux de létalité embryonnaire plus élevé réduit le rendement expérimental25.

Pour contourner certaines limitations techniques associées en vitro MGE explantation des expériences et en vivo in utero électroporation, ex vivo organotypiques ont été développés8,37, 38,39. Cerveau organotypique tranche cultures offre l’avantage d’imiter en vivo les conditions, tout en étant moins long et coûteux que les modèles de production animaux25. En effet, ces préparations permettent un accès facile à la MGE, ainsi que la visualisation spécifique de l’INs et peuvent être combinées avec focale électroporation pour étudier les voies moléculaires spécifiques dans INs migration dans un plus physiologique environnement8 , 39 , 40 , 41. nous avons donc optimisé une approche pour organotypique cultures38, dont nous avons combiné avec l’ex utero électroporation et Time-lapse imagerie confocale, afin d’évaluer les processus morphologiques et dynamiques survenant au cours de la migration tangentielle de MGE-INs. Le présent protocole a été adapté et optimisé d’autres personnes qui ont utilisé des ex utero ou in utero cerveau électroporation organotypique tranche cultures et d’étudier la migration des cellules pyramidales42,43 et corticale INs36,39,44. Plus précisément, des embryons de souris sont décapités et la MGE est électroporation ex vivo après l’injection intraventriculaire des plasmides expérimentales, permettant aux plus précis et efficace ciblant des progéniteurs MGE que ce qui peut être réalisé avec dans l’utérus électroporation. Les cerveaux sont ensuite extraites et sectionnées en tranches coronale de cerveau entier qui peuvent être mis en culture pendant quelques jours, permettant ainsi continu de suivi et d’imagerie ins transfectées. Cette approche étiquettes généralement 5 à 20 tangentiellement migration INs par tranche de cerveau, réduisant au minimum le nombre d’itérations expérimentales nécessaires pour atteindre la signification statistique, tandis que l’étiquetage d’une population neuronale suffisamment rares pour assurer une séparation facile des neurones individuels pour la reconstruction et l’évaluation morphologique fine. En outre, par rapport à des explants MGE, culture organotypique assurer cette migration INs sont exposés à un environnement plus naturel, y compris les chimiokines sécrétée localement et contributions des afférences thalamiques. Cette approche est donc bien adaptée pour quantifier la directivité et la voie de migration adopté par INs transfectées, tout en offrant des détails anatomiques suffisantes pour permettre la caractérisation des processus dynamiques plus fines comme les principaux processus de branchement, nucleokinesis et rétraction fin de processus.

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Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) au centre de recherche CHU Sainte-Justine et ont été menées selon le Conseil canadien sur le guide de protection des animaux à le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation (2e édition).

Le protocole décrit ici a été optimisé pour l’électroporation des embryons à jour embryonnaire (e) 13,5, à la fois lorsque INs dérivé de MGE sont activement généré, avant le pic de CGE-dérivé INs production45,46. En outre, pour biaiser l’électroporation vers GABAergic INs, nous utilisons un promoteur sélectivement exprimé en INs (par exemple le promoteur Dlx5/6 avec ses enhancer minime)47.

1. préparation des Solutions d’électroporation et culture organotypique tranche

  1. Préparer 125 mL de milieu de culture stérile.
    1. Mesurer les 125 mL de milieu de culture de neurone-spécifique régulière (voir Table des matières pour la formulation) dans une bouteille stérilisée dans un biosafety préalablement stérilisés UV armoire pulvérisé avec l’éthanol à 70 %. Ajouter 2,25 mL de 50 x Supplément de neurone-spécifique au milieu sans sérum, 1,75 mL de 200mM de glutamine (concentration finale de 0,5 mM) et 6,25 mL de sérum de cheval inactivés par la chaleur déjà aliquoté dans des conditions stériles. Mélanger soigneusement, partie aliquote dans 15 mL tubes coniques stériles et conserver à 4 ° C.
      Remarque : Milieu de culture préparé peuvent être stocké pendant 3 semaines à 4 ° C.
    2. Diviser un 100 X solution de N-2 formulation48 de Botteinstein 150 µL d’extraits dans des conditions stériles et congeler à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
  2. Préparer 1 L de stérile artificiel liquide céphalo-rachidien (ACSF).
    1. Mesure 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 L. Ajouter 25,67 g de saccharose, de 5,08 g de chlorure de sodium (NaCl), de 2,18 g de bicarbonate de sodium (NaHCO3), 1,80 g de glucose, 0,19 g de chlorure de potassium (KCl), 0,15 g de phosphate monobasique de sodium anhydre (NaH2PO4), 1 mL de 1 M stock ACIC2 .2H2O et 2 mL de 1 M en stock MgSO4.7H2O. remuer pour dissoudre à température ambiante. Ajouter de l’eau distillée pour atteindre un volume total de 1 L.
    2. À l’aide d’un filtre de 0,22 µm, filtrer la solution dans un flacon stérile dans une armoire de biosécurité stérilisé et conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.
  3. Préparer une nouvelle solution de 4 % d’agarose dans FSCA avant chaque expérience.
    1. 25 ml de FSCA préalablement préparée dans un tube conique stérile de 50 mL et ajouter 1 g d’agarose de point bas point de fusion.
    2. Chauffer pendant 45 s dans un four à micro-ondes. Pour éviter tout déversement, interrompre toutes les 3-4 s de chauffage lorsque l’ébullition commence, ouvrez le tube pour laisser la pression sortir, refermer le flacon et agiter manuellement pour mélanger le gel d’agarose. Répétez jusqu'à ce que la solution de gel d’agarose est homogène. Conserver la solution de gel d’agarose à 42 ° C pendant le reste de l’expérience afin d’éviter la solidification.
      Remarque : Des températures plus élevées endommageront les tissus du cerveau.

2. préparation des plasmides pour Injection

  1. Tirez une pipette de micro-injection de verre
    1. Définir les micropipettes avec les paramètres appropriés, d’assurer le capillaire de verre dans l’espace fourni et assurez-vous qu’il soit centré avec le filament.
    2. Appuyez sur le bouton de la traction.
    3. Retirer délicatement les pipettes de micro-injection nouvellement formées de l’extracteur de chaleur et les place dans une zone ou une boîte de Petri propre jusqu'à l’utilisation supplémentaire pour éviter d’endommager l’extrémité.
  2. Set-up de la biosécurité en coffret avec tous les instruments nécessaires pour cela expérimenter (voir Figure 1 a), vaporiser généreusement tous les instruments dans la prévention des risques biotechnologiques armoire avec 70 % d’éthanol et stériliser les instruments et l’environnement avec la lumière UV pendant 15-20 min.
  3. Au cours de l’étape de stérilisation, décongelez les plasmides sur glace (4 ° C).
  4. Mesurer 10 µL du plasmide d’une solution mère (4 µg/µL) dans un tube à centrifuger propre de 1,5 mL. Ajouter 0,01 % de vert rapide FCF. Mélanger doucement, tourner brièvement et rester sur la glace jusqu'à utilisation.
    NOTE : Maxi-prep ADN doit être préparé selon le protocole du fabricant à l’aide d’un kit maxi-prep exempte d’endotoxine. L’ADN peut être solubilisée dans un tampon TE ou sans nucléase H2O et la préparation du plasmide avec la solution de colorant peut, mais ne doivent ne pas être exécutées dans des conditions stériles. Plasmides de Maxi-prep doivent être aliquotés afin d’éviter de multiples cycles de gel-dégel. Les plasmides aliquotés ne doivent être mélangés avec le colorant, aucun plus que 2 h avant utilisation et ne devraient pas être recongelés pour une utilisation ultérieure.
  5. Après stérilisation, préparer le nano-injecteur comme suit.
    1. Choisissez l’une de la pipette de micro-injection verre préalablement stockée dans une boîte propre ou la boîte de Pétri et l’utilisation de petites pinces pour couper l’embout de la pipette d’une manière biseautée pour atteindre un diamètre extérieur d’environ 15 µm.
      NOTE : Le diamètre extérieur donné ici est une mesure approximative à donner à l’utilisateur une idée de ce que nous utilisons dans nos expériences et a été optimisé afin de faciliter la perforation du crâne pour injection de plasmide sans endommager le cerveau, tout en tenant compte du fluide chargement et la libération de l’ADN. Le diamètre extérieur peut être mesuré en regardant le bout coupé de la pipette de micro-injection de verre apposée à une barre d’échelle micrométrique sous un microscope à champ lumineux.
    2. Utiliser une seringue pour remplir la micropipette avec huile minérale de son extrémité unpulled (pour expulser tout l’air).
    3. Insérer une micropipette de fibre de verre chargé dans le nano-injecteur en suivant les instructions du fabricant.
    4. Vide les 2/3 de la micropipette de verre (en gardant suffisamment d’huile pour empêcher l’entrée d’air).
  6. Soigneusement insérer une micropipette préparée dans le tube contenant la solution de plasmide/colorant et remplir la verre de micropipette avec la solution de plasmide/colorant.

3. la collecte d’embryons de souris femelles enceintes

  1. Surveiller les femelles reproductrices quotidiennement à évaluer pour brancher vaginale, préférablement en même temps tous les jours (début d’après-midi). Journée e0.5 correspond au premier jour quand on observe un plug vaginal.
    Remarque : Les expériences décrites ici peuvent être menées chez les souris de type sauvage. Toutefois, pour faciliter l’identification de la MGE et de les étiqueter tous les GABAergic INs (ou sous-ensembles spécifiques tels que les dérivés de MGE INs), les animaux transgéniques peuvent être utilisés (p. ex. : GAD67EGFP; Dlx5/6Cre avec un allèle de Cre-journaliste, etc.47,49). Dans cette situation, le plasmide expérimental injecté doit exprimer une autre fluorophore (par exemple mCherry ou TdTomato) pour permettre la visualisation de l’INs transfectées (jaune) qui peut être comparé avec les INs non transfectées (vert).
  2. Sacrifier la femelle à jour embryonnaire e13.5, de la dislocation du cou.
    Remarque : Les agents anesthésiques données au moment du sacrifice peuvent avoir un impact dans la migration et la survie de50,51 et devraient être évitées.
  3. Recueillir des embryons par césarienne comme suit.
    1. Pulvérisez généreusement l’abdomen femelle avec l’éthanol à 70 %. Tirez la peau abdominale avec une paire de pinces stérilisées et, avec l’autre main, utiliser des ciseaux chirurgicaux stérilisés pour couper la peau de l’abdomen.
    2. Avec une deuxième paire de ciseaux et pinces stérilisées, tirer l’aponévrose abdominale et coupez-le en évitant soigneusement l’utérus.
    3. À l’aide d’une troisième paire de ciseaux et pinces stérilisées, tirez les cornes utérines et coupez-les dans la cavité pelvienne. Placer les cornes utérines disséqués dans un 60 mm boîte de petri stérile, rempli de milieu de culture axée sur les neurones additionné d’acides aminés, de vitamines et de sels inorganiques (voir Table des matières pour les produits disponibles dans le commerce).
  4. Dans une armoire de biosécurité stérile, utiliser deux paires de pinces fines (un dans chaque main) de disséquer les embryons dans le placenta et isoler les têtes par décapitation.
  5. Coupe en biseau l’extrémité de la pipette de transfert en plastique stérile de 3 mL, aspirer les têtes et transfert dans un nouveau 60 mm boîte de petri stérile en couches avec de la cire noire solidifiée et rempli de la même base neurale complétée de milieu de culture comme ci-dessus.
    Remarque : Cette étape minimise le transfert de contaminants (souris cheveux, sang). La cire noire sert à stabiliser la tête au cours de la dissection. Milieux de culture n’avez pas besoin d’être oxygénée au cours de ces procédures.

4. intraventriculaire plasmide Injections et électroporation Ex Vivo de la MGE

Remarque : Les étapes suivantes doivent être exécutés dans des conditions stériles dans l’armoire de biosécurité préalablement préparée.

  1. Place le plat de Pétri de 60 mm en couches avec de la cire noire et contenant les têtes décapitées dans axée sur les neurones complétée milieu de culture sous les jumelles dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
  2. Stabiliser la tête, la partie rostrale orienté vers la droite, avec des pinces fines avec la main gauche et utilisez le nano-dans la main droite pour injecter 1-2 µL de la solution de plasmide/colorant dans le ventricule latéral droit.
    Remarque : Les expériences de co-expression peuvent être dispensés par un co-electroporating un plasmide de sauvetage et un plasmide exprimant le shARN en mélangeant les deux plasmides à concentration équimolaire.
  3. Electroporate le cerveau injecté.
    1. Placez la tête entre les électrodes avec l’électrode négative placée sur le dos et parallèle à la tête et l’électrode positive vers la face ventrale de la tête pour cibler la MGE.
    2. Une fois que les électrodes sont bien placés, livrer 4 impulsions carrées de 40 V pour 50 ms à 500 ms intervalles inter impulsions.
    3. Supprimer n’importe quel tissu résiduel des électrodes à l’aide de pincettes déjà placé dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
      Remarque : Ces paramètres ont été optimisées spécialement pour l’électroporateur utilisé dans nos expériences. Nous recommandons que les utilisateurs exécuter optimisation des tests au préalable si vous utilisez un autre type d’électroporateur.
    4. Répétez les étapes 4.1 à 4.3 pour tous les autres cerveaux.
      Remarque : Bien que ce protocole décrit les manipulations requises pour un cerveau, il est possible d’injecter jusqu'à 4 cerveaux séquentiellement avant electroporating chaque cerveau, augmentant ainsi le rendement. Cette stratégie est particulièrement avantageuse lorsque 2 ou plusieurs différents plasmides sont injectées dans l’ordre (p. ex. contrôle ou plasmide expérimental) au cours de la même expérience (permettant une comparaison entre autres). En outre, il est possible d’injecter et d’oligonucléotides simultanément les deux côtés du cerveau pour augmenter le rendement, en positionnant les électrodes complètement parallèle à la surface du cerveau.

5. Dissection et culture organotypique tranche de cerveau

  1. Tout en manipulant encore dans l’environnement stérile de la biosécurité du cabinet, disséquer le cerveau dans le crâne.
    1. Stabiliser la tête sur la couche de cire noire en insérant une aiguille dans chaque œil, tout en évitant soigneusement le cerveau.
    2. Utilisez une paire de pinces fines pour contenir le côté gauche du cou et une deuxième paire de pinces fines à déchirer la peau sur le crâne de l’arrière vers l’avant.
    3. Tout en maintenant la tête latéralement avec la pince à épiler dans une main, utiliser une autre paire de pinces à épiler dans l’autre main pour couper soigneusement le crâne au niveau du tronc cérébral et tirez doucement le crâne. Avec chaque pince, coupez le crâne dans le plan sagittal (ligne médiane) vers l’avant et puis incise latéralement pour libérer les fragments de crâne.
    4. Soulever le tronc cérébral et découpez soigneusement les méninges et les nerfs crâniens, jusqu'à ce que le cerveau est complètement hors du crâne.
      Remarque : Toutes les étapes décrites au point 5.1 doivent être effectués sous strictes conditions stériles dans une armoire de sécurité biologique.
  2. Incorporez le cerveau dans 4 % bas point de fusion point d’agarose pour le sectionnement.
    1. Remplir un 35 mm boîte de Pétri avec la solution de gel d’agarose préparée ci-dessus (liquide maintenu à 42 ° C).
    2. Transférer rapidement un cerveau d’électroporation vers le récipient d’agarose à l’aide de la pipette de transfert précédemment coupé. Garder le plat à température ambiante.
    3. Remuer l’agarose avec un bâton de métal pour garder le cerveau au milieu du puits (pour éviter le naufrage) et positionner le cerveau dans un plan rostro-caudal parallèle au plat. Arrêter en remuant quand l’agarose commence à se solidifier, pour éviter des dommages de cerveau.
    4. Utiliser une lame de rasoir pour couper l’agarose entourant le cerveau afin de former un bloc rectangulaire, laissant une marge de 1-2 millimètres autour du cerveau. Veiller à ce que la partie rostrale du cerveau est perpendiculaire à la limite antérieure du bloc pour faciliter l’orientation pour les étapes ultérieures de sectionnement.
    5. Répétez pour chaque cerveau.
      Remarque : Il est possible de couper plus d’un cerveau à la fois (3 maximum) en formant des blocs distincts d’agarose lors de la définition de chaque cerveau à différentes hauteurs.
  3. Vibratome sections coronales et la culture de la tranche.
    1. Une aliquote de dégel de 100 X N-2 Supplément (150 µL) sur la glace et ajouter 15 mL aliquotés milieu de culture en conditions stériles.
    2. Transférer 750 µL de milieu de culture (avec 1 X N2 supplément) dans chaque puits d’une plaque de 6 puits culture.
    3. Avec la pincette courbée, placez un insert de culture cellulaire (30 mm de diamètre, 0,4 µm taille de pore, PTFE) dans chacun bien remplis de milieu.
    4. Remplir la baignoire vibratome avec FSCA continuellement oxygéné. Refroidir à 4 ° C avec de la glace autour de la baignoire, ou utiliser un vibratome réfrigéré.
    5. Régler la vitesse de vibratome à 0.150 mm/s et la fréquence de 80 Hertz.
    6. Coller le bloc d’agarose vibratome plate-forme, rostral pointe vers le bas et ventrale bord vers l’utilisateur.
    7. Couper le cerveau dans des sections coronales pour obtenir 250 µm d’épaisseur sections (à 4 ° C).
    8. Avec des spatules stérilisés, recueillir les sections 2-3 contenant la MGE et le lieu de toutes les sections du cerveau d’un animal sur une membrane unique de 30 mm insert, tout en évitant soigneusement les chevauchements entre les sections. Placer l’insertion dans un puits d’une plaque de 6 puits culture (contenant 750 µL de milieu de culture supplémenté, tel que décrit ci-dessus). Par ailleurs, chaque section peut être placée sur une membrane distincte 13 mm de diamètre dans une plaque de culture de 12 puits remplie de 500 µl complétée de milieu de culture. La quantité de milieu de culture recommandé pour chaque puits permet les sections du cerveau à être nourrie par les médias sans être submergés.
      Remarque : Les étapes décrites dans 5.3.6 et 5.3.7 ne sont pas effectués dans des conditions stériles complets, à moins que le vibratome peut être stérilisé et utilisé dans une armoire de sécurité biologique. Par conséquent, il est crucial d’effectuer ces étapes avec soin pour éviter toute contamination. Équipement de protection approprié (propre masque, gants et blouse de laboratoire) doit être porté en tout temps et parties du corps, même couverts, comme les cheveux, visage et les mains, ne doivent jamais passer au-dessus des plaques de culture (avec ou sans milieu de culture). Il est également recommandé de pulvériser 70 % éthanol fréquemment sur les gants et les spatules utilisés pour collecter les sections du cerveau.
    9. Placer la plaque de culture dans une étuve ventilée stérile à 37 ° C, avec 60 % d’humidité et 5 % de CO2 pour 48 ou 72 h.
      NOTE : Ces périodes d’incubation ont été optimisées pour l’imagerie Time-lapse de dérivés de MGE INs et imagerie confocale des tranches fixes, respectivement. Temps d’incubation optimale doivent être testés au préalable pour chaque protocole expérimental. En outre, si l’incubation choisie est de 72 heures et moins, il n’y a pas lieu de modifier le milieu de culture. Pour plus longues périodes d’incubation, le milieu de culture doit être changé tous les 2-3 jours.
    10. Après le temps d’incubation désiré, transférer les sections d’intérêt à une lamelle 8 cavités et ajouter 3-5 µL de milieu de culture. Place le couvre-objet dans une chambre (37 ° C, humidité de 60 %, 5 % de CO2) connecté à un inversé tourne disque confocal équipé d’un logiciel d’acquisition assistée par ordinateur de mettre en place la Time-lapse séance d’imagerie.
      NOTE : Alternativement, sections peuvent être fixées avec 4 % de paraformaldéhyde (une nuit à 4 ° C ou 2 h à température ambiante) et par la suite immunomarquage avec anticorps différents pour la visualisation des caractéristiques morphologiques d’électroporation INs sous un confocal microscope. Bien qu’eGFP et mCherry peuvent être visualisées par microscopie confocale sans aucune procédure Counter-coloration, nous recommandons de procéder immunohistochimie contre GFP et mCherry à améliorer le signal étant donné que le processus de fixation peut réduire de fluorescence, réduisant la détection de composants plus fines de neurones embryonnaires, comme les petites branches dans les processus de début ou de fin.

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Résultats

Dans cette section, nous fournissons des résultats représentatifs obtenus suite à l’électroporation ex utero d’un plasmide de contrôle, ou d’un plasmide expérimental ciblant un gène d’intérêt, dans la MGE e13.5 d’embryons de souris suivie organotypiques incubé à 37 ° C pendant 48 h (pour l’imagerie Time-lapse) ou 72 h (pour fixation et marquage immunohistochimique) (voir Figure 1 b pour protocole schématique). Exemples représentatifs des INs migratio...

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Discussion

Dans cet article, nous fournissons une méthode fiable pour effectuer ex utero électroporation de souris MGE à e13.5 et pour la génération de culture organotypique de tranches de cerveau embryonnaire. Bien que les méthodes in vitro , tels que l’essai de chambre de Boyden, sont relativement faciles à effectuer et peuvent être utilisés pour évaluer les rôles spécifiques des différents gènes et des protéines sans l’interférence d’autres facteurs, ils s’opposent à l’enquête de po dynamiques migratoires en ce...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer. Les opinions exprimées ici ne représentent pas nécessairement les opinions du ministre de la santé ou le gouvernement du Canada.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation de la Savoie et la Fondation de l’épilepsie CURE de fonctionnement et de matériel des subventions de la Fondation canadienne pour l’Innovation aux E.R (microscope confocal) et Hary (microscope confocal à disque tournant). E.R. reçoit une bourse de carrière de la Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S ; Clinician-Scientist prix) ainsi que des instituts de recherche en santé du Canada (IRSC ; Prix du jeune chercheur). G.H. est chercheur principal de la FRQ-S. L.E est le récipiendaire du prix Steriade-Savoie formation postdoctorale de la Fondation de la Savoie, la bourse de formation postdoctorale de la Fondation CHU Sainte-Justine et la bourse de formation postdoctorale FRQ-S, en partenariat avec la Fondation des étoiles. Ce projet a été rendu possible par cerveau Canada à travers le Fonds de recherche de cerveau de Canada, avec l’appui financier de Santé Canada, attribué à L.E.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu neurobasalThermoFisher Scientific21103049Milieu de culture spécifique aux neurones disponible dans le commerce. Formulation complète disponible sur ce site : https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
supplément sans sérum B-27ThermoFisher Scientific1750404450X Supplément spécifique aux neurones sans sérum
15 mL tubes à centrifuger stérilesSarstedt62.554.002
Leibovitz’s (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)ThermoFisher Scientific11415064Milieu de culture à base de neurones disponible dans le commerce, complété par des acides aminés, des vitamines et des sels inorganiques. Formulation complète disponible sur le site du distributeur  ;
L-GlutamineInvitrogen25030-081
Sérum de cheval, inactivé à la chaleurMillipore-SigmaH1138-500ML
Supplément Neurocell N-2 100XWisent305-016Botteinstein’s N-2 Formulation
VWR Carré PETG Média Flacons 125 mLVWR89132-062
Classe II Type A Enceinte de biosécuritéNuaireNU-540
SucroseBioShopSUC700.1
Chlorure de sodiumBioShopSOD001.1
Bicarbonate de sodiumThermoFisher ScientificS233-500
D+ glucoseMillipore-SigmaG7528-250G
Chlorure de potassiumThermoFisher ScientificP217-500
Phosphate de sodium monobasique anhydreBioShopSPM400.500
Chlorure de calcium dihydraté  ;ThermoFisher ScientificC79-500
Sulfate de magnésium heptahydratéBiosShopMAG522
AgaroseBioShopAGA002.500
50 mL tubes à centrifuger stérilesSarstedt62.547.004
1,5 mL Tubes à centrifugerSarstedt72.690.001
P-97 Flaming/Brown Extracteur de micropipettesSutter Instruments Co.Modèle P-97
0,4 mm D.I. x 75 mm Tube capillaireDrummond scientific1-000-800/12
EthanolVWRE193
Seringue de 5 mLBecton Dickinson & Co309646
Huile minérale (lourde)Rougier Pharma
WPI Pince à épiler suisse #5World Precision Instruments50451111 cm, droite, pointes 0,06 x 0,07 mm, antimagnétique. Vous aurez besoin de 2 d’entre eux.
WPI Pince à épiler suisse #7World Precision Instruments50450411,5 cm, 0,18 x 0,2 mm, pointes
incurvées Pince à épiler HTCWorld Precision Instruments50461711 cm, Droite,
plate Ciseaux de commandeWorld Precision Instruments50122516 cm, Tranchante/tranchante, droite. Vous aurez besoin de 3 d’entre eux.
Pince à pansementWorld Precision Instruments50121712,5 cm, droite, dentelée
Pince à irisWorld Precision Instruments50447810,2 cm, pleine courbe, dentelée
Pince à tissus DeBakeyWorld Precision Instruments50199615 cm, angle de 45 degrés, mâchoire délicate, 1,5 mm de large
Fisherbran Microspatule aux extrémités arrondiesFisherScientific21-401-5Vous aurez besoin de 2 d’entre eux.
Injecteur Nanoject II Auto-NanolitreDrummond scientific3-000-204
TC Dish 60, StandardSarstedt83.3901Plat de 60 mm
Plat de culture tissulaireSarstedt83.1800Plat de 35 mm
Black WaxFisherScientificS17432
Pipettes de transfert  ;Ultident170-CTB700-2123 mL, petite ampoule
StéréomicroscopeLeica BiosystemsLeica M80En remplacement de notre stéréomicroscope qui a été abandonné par le fabricant (StereoMaster de FisherScientific)
Electro Square PoratorBTX Harvard ApparatusECM 830
Tweezertrodes, plaqué plattinum, 3mmBTX Harvard Apparatus45-0487
25G 1 1/2Becton Dickinson & Co305127
Leica VT1000S Microtome à lame vibranteLeica BiosystemsVT1000S
GEM, Lame de rasoir à un seul tranchantMicroscopie électronique Sciences71952-10Retirez l’extrémité émoussée avant de l’insérer dans l’espace désigné de la lame du vibratome
µ ;-Slide 8 puitsIbidi80827Paquet de 15
insertsde culture cellulaire MillicellMillipore-SigmaPICM0RG5030 mm, PTFE hydrophile, 0,4 & micro ; m pore, paquet de 50.  ;
Microscope Leica DMi6000Leica MicrosystemsN/A
Disque rotatif Tête confocale Ultraview VoxPerkin ElmerN/A
Volocity 6.0 Logiciel d’acquisitionImprovision/Perkin ElmerN/A
LiveCell Stage Système d’incubation supérieurDispositifs de pathologieLC30030Assure le contrôle de la température, du CO2 et de l’humidité.  ;
Microscope confocal SP8Leica
mCherry-Lifeact-7Addgene54491Cadeau de Michael Davidson
Fast Green FCFMillipore-SigmaF7258-25GFlacon 25G, certifié par la Biological Stain Commission

Références

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