Intégrer la cytométrie en imagerie et transcriptomique profilage pour évaluer l’altération CD1d endocytose traite

Summary

Cytométrie en flux d’imagerie fournit une approche idéale pour détecter la modification morphologique et fonctionnelle des cellules aux niveaux individuel et populationnelles. Fonction d’endocytose perturbée pour présentation des antigènes lipidiques dans les cellules dendritiques humaines exposés à des polluants a été démontrée avec un combiné transcriptomique profilage de l’expression génique et démonstration morphologique de la protéine traite.

Abstract

Les analyses populationnelles de l’altération morphologique et fonctionnelle des protéines intervenant dans l’endocytose sont difficiles en raison de la demande de capture d’image à une analyse d’image plane et statistique unicellulaire à un niveau populationnelle. Pour surmonter cette difficulté, nous avons utilisé d’imagerie cytométrie et transcriptomique profilage (RNA-seq) pour déterminer la localisation sous-cellulaire altérée de l’amas de protéine de différenciation 1D (CD1d) associée à l’expression des gènes intervenant dans l’endocytose altérée chez l’homme les cellules dendritiques (CD), qui ont été exposés à la common liphophile air pollutant benzo [a] pyrène. La co-localisation de CD1d et protéines intervenant dans l’endocytose marqueur Lamp1 parmi des milliers de cellules images capturées avec écoulement cytometry d’imagerie a été analysée à l’aide d’idées et ImageJ-Fidji programmes. Nombreuses images cellulaires avec des protéines CD1d et Lamp1 co colorées ont été visualisées après blocage sur CD1d⁺Lamp1⁺ DCs idées. La co-localisation CD1d et Lamp1 améliorée sur BaP, l’exposition a été démontrée plus loin à l’aide de diagrammes de dispersion binariser, testé avec des coefficients de Mander pour co localisées d’intensité et tracés selon le pourcentage de zones co localisées à l’aide de ImageJ-Fidji. Nos données fournissent une approche instrumentale et bioinformatiques avantageuse pour mesurer la co-localisation de la protéine au niveau cellulaire unique et populationnelle, soutenant un résultat fonctionnel avec facultés affaiblies d’altération transcriptomique chez les humains exposés à des polluants Contrôleurs de domaine.

Introduction

Présentation de l’antigène implique en général des protéines intracellulaires traite, qui a été souvent étudié en utilisant la caractérisation morphologique et détermination des caractéristiques phénotypiques des antigène présentant des cellules^1,2,3 . Pour intégrer les avantages de l’imagerie et les méthodes de phénotypage, nous décrivons une plate-forme d’analyse d’imagerie au niveau de la population à démontrer une colocalisation de protéine altérée dans les cellules dendritiques humaines (DCs) tant de cellule unique. Dans la présentation des antigènes peptidiques, complex....

Protocol

Les protocoles humaines dans cette étude ont été approuvées par l’Institutional Review Board de l’Université de Cincinnati et toutes les méthodes ont été effectuées conformément aux directives et règlements. Des échantillons de sang provenant de donneurs sains ont été obtenues depuis le centre Hoxworth de sang au centre médical de l’Université de Cincinnati.

1. transcriptomique profilage de DCs de macrophages dérivés de monocytes humains exposés à des polluants

1. Extraction de l’ARN totale de DCs BaP-exposés
   1. Différencier les DCs humaines à l’aide de cytokines GM-CSF et IL-4 et exposer DCs au BaP pendant 4 jours,

Results

Les polluants lipophiles BaP modifie des groupes de gènes intervenant dans l’endocytose dans DCs de macrophages dérivés de monocytes DCs. homme humains de chaque donateur (n = 3) ont été incubées en présence de BaP et triés pour DCs classiques, qui ont été utilisés plus de RNA extraction et transcriptomique d’analyse tel que décrit . Lors de la normalisation de l’expression des gènes, les gènes modifiés entre groupes BaP-exposés et non exposés ont été regroupés selon la corrélation foncti.......

Discussion

Confirmation fonctionnelle d’une voie de gène est difficile, en raison de l’expression génique largement contaminé impliquant de multiples voies et la difficulté d’intégrer les activités cellulaires individuelles et populationnelles. Nous avons utilisé d’imagerie cytométrie à spécifiquement test CD1d traite des compartiments de l’endocytose. Cytométrie en flux d’imagerie intègre la mesure populationnelle des cellules et la démonstration individuelle de colocalisation subcellulaire des protéines multiples. Microscopie con.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transcriptomique	Illumina	HiSeq 2500 v4	Système Illumina HiSeq
ImagingStream X	Millipore	100220	Imagerie cytométrie en flux
mirVana Kit d’isolement des miARN	Thermo Fisher		Extraction totale de l’ARN
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent			du contrôle qualité de l’ARN total
Veriti 96 puits Thermocycleur Thermo			Fisher PCR, réaction enzymatique
NEBNext Module d’isolement magnétique de l’ARNm poly(A)  ;	New England Biolab		Purification de l’ARN PolyA
Système automatisé SMARTer Apollo	Purification de l’ARN	Takara
NEBNext Ultra Kit de préparation de la bibliothèque d’ARN pour Illumina	New England Biolab		Préparation de la bibliothèque
Agencourt AMPure XP Perles magnétiques Beckman	Coulter		Purification de l’ADN  ;
2100 Bioanalyseur	Agilent		Library QC, analyse de la distribution de taille
Kit d’ADN haute sensibilité Agilent			Library QC, analyse de la distribution de taille
QuantStudio 5 Système de PCR en temps réel (Thermo Fisher)Quantification	de la bibliothèque	Thermo Fisher
NEBNext Library Quant Kit Quantification
Génération	de cluster de la bibliothèque	cBot Illumina
de cluster TruSeq SR v3 - cBot &ndash ; HS	Illumina		Library cluster generation
HiSeq 1000	Séquençage	Illumina
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 cycles)	Séquençage	Illumina
Phycoérythrine/Cyanine 7 (PE/Cy7)	Bio Legend	L243
Phycoérythrine/Cyanine 5 (PE/Cy5)	Bio Legend	3.9
Violet brillant 421	Bio Legend	L161
PE-anti-souris IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a(H4A3)