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Article de méthode

Intégrer la cytométrie en imagerie et transcriptomique profilage pour évaluer l’altération CD1d endocytose traite

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DOI :

10.3791/57528

⸱

29 octobre 2018

 ,  , 
1Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Cytométrie en flux d’imagerie fournit une approche idéale pour détecter la modification morphologique et fonctionnelle des cellules aux niveaux individuel et populationnelles. Fonction d’endocytose perturbée pour présentation des antigènes lipidiques dans les cellules dendritiques humaines exposés à des polluants a été démontrée avec un combiné transcriptomique profilage de l’expression génique et démonstration morphologique de la protéine traite.

Résumé

Les analyses populationnelles de l’altération morphologique et fonctionnelle des protéines intervenant dans l’endocytose sont difficiles en raison de la demande de capture d’image à une analyse d’image plane et statistique unicellulaire à un niveau populationnelle. Pour surmonter cette difficulté, nous avons utilisé d’imagerie cytométrie et transcriptomique profilage (RNA-seq) pour déterminer la localisation sous-cellulaire altérée de l’amas de protéine de différenciation 1D (CD1d) associée à l’expression des gènes intervenant dans l’endocytose altérée chez l’homme les cellules dendritiques (CD), qui ont été exposés à la common liphophile air pollutant benzo [a] pyrène. La co-localisation de CD1d et protéines intervenant dans l’endocytose marqueur Lamp1 parmi des milliers de cellules images capturées avec écoulement cytometry d’imagerie a été analysée à l’aide d’idées et ImageJ-Fidji programmes. Nombreuses images cellulaires avec des protéines CD1d et Lamp1 co colorées ont été visualisées après blocage sur CD1d+Lamp1+ DCs idées. La co-localisation CD1d et Lamp1 améliorée sur BaP, l’exposition a été démontrée plus loin à l’aide de diagrammes de dispersion binariser, testé avec des coefficients de Mander pour co localisées d’intensité et tracés selon le pourcentage de zones co localisées à l’aide de ImageJ-Fidji. Nos données fournissent une approche instrumentale et bioinformatiques avantageuse pour mesurer la co-localisation de la protéine au niveau cellulaire unique et populationnelle, soutenant un résultat fonctionnel avec facultés affaiblies d’altération transcriptomique chez les humains exposés à des polluants Contrôleurs de domaine.

Introduction

Présentation de l’antigène implique en général des protéines intracellulaires traite, qui a été souvent étudié en utilisant la caractérisation morphologique et détermination des caractéristiques phénotypiques des antigène présentant des cellules1,2,3 . Pour intégrer les avantages de l’imagerie et les méthodes de phénotypage, nous décrivons une plate-forme d’analyse d’imagerie au niveau de la population à démontrer une colocalisation de protéine altérée dans les cellules dendritiques humaines (DCs) tant de cellule unique. Dans la présentation des antigènes peptidiques, complex majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I molécules lier un peptide court (8-10 résidus) dans le réticulum endoplasmique pour activer classiques CD8+ T des cellules, tandis que les molécules MHC classe II lient un relativement plus longue peptide (~ 20 résidus) dans des compartiments endocytose pour activer classiques CD4 des cellules de+ T1,4. En revanche, les lipides spécifiques T cellules sont activées par CD1 protéines avec des antigènes lipidiques chargés principalement dans des compartiments endocytose5,6. Présentation des antigènes lipidiques exige la fourniture des lipides métabolites produits en lipide métabolisme7,8,9,10 et le chargement des métabolites de lipides fonctionnels aux protéines CD1 endocytose compartiments5,6. Dans ce contexte, différents facteurs cellulaires modulant la présentation des antigènes lipidiques, en particulier dans l’exposition dans l’environnement des polluants lipophiles et désordres du système immunitaire, sont essentiels pour être défini. Dans cette étude, nous avons utilisé analyse transcriptomique, image profilage et analyse d’imagerie cellulaire et populationnelle de DCs de macrophages dérivés de monocytes humains afin de déterminer la protéine intervenant dans l’endocytose traite contribuant à la présentation des antigènes lipidiques à l’exposition à des polluants. Certes, cette plate-forme combinée peut être appliquée à l’étude traite des protéines subcellulaire et colocalisation dans différents processus biologiques.

Sur le plan technique, localisation subcellulaire de protéine a été démontrée généralement à l’aide de la microscopie confocale et statistiquement analysées dans un nombre limité de cellules détectées1,2,3,11. En outre, cytométrie en flux a été largement appliquée aux populations de cellules de porte avec des signaux de co teinté de plusieurs protéines à un niveau cellulaire12; Toutefois, cela n’a pas une visualisation détaillée de colocalisation de protéine subcellulaire. Pour réaliser des analyses complètes et statistiques de pourcentage colocalisation de protéine au niveau cellulaire et la population, nous incorporons imagerie approches de profilage et d’analyse afin de déterminer les caractéristiques de la co-localisation de protéine avec biologique pertinence. Plus précisément, nous utilisons cytométrie en flux d’imagerie pour détecter la co-localisation de CD1d et protéine 1 (Lamp1) de la membrane lysosomale associés aux protéines dans cette étude. Le dosage des molécules épididymaire était auparavant difficile à accomplir à l’échelle populationnelle. Dans cette étude, nous avons adapté le programme de ImageJ-Fidji à examiner le pourcentage de colocalisation de protéine avec un grand nombre de cellules co colorées au niveau cellulaire populationnelle tant individuels. Plus précisément, nous avons mesuré des zones localisées de co, intensité et la taille populationnelle pour étayer la conclusion que la protéine CD1d a été largement conservée dans des compartiments endocytose fin de DCs humaines dans une exposition à un polluant lipophiles de benzo [a] pyrène (BaP)13 . Ce combiné cellulaire et la population d’imagerie analyse a fourni des résultats hautement reproductibles, complets et statistiquement significatives de colocalisation CD1d-Lamp1 pertinente pour la présentation des antigènes lipidiques inhibé.

Le transcriptome de DCs humains exposés au BaP a fortement soutenu l’hypothèse que le métabolisme des lipides endocytose et CD1d endocytose trafic ont porté atteinte aux exposition BaP. Pour tester cette hypothèse, nous avons appliqué la cytométrie en flux d’imagerie pour profiler les images de population DC qui ont été colorées conjointement avec plusieurs protéines dont CD1d, endocytose marqueurs et DC. Enfin, les cellules colorées co analysés statistiquement pour illustrer le pourcentage d’intensité et de zones de colocalisation CD1d et Lamp1.

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Protocole

Les protocoles humaines dans cette étude ont été approuvées par l’Institutional Review Board de l’Université de Cincinnati et toutes les méthodes ont été effectuées conformément aux directives et règlements. Des échantillons de sang provenant de donneurs sains ont été obtenues depuis le centre Hoxworth de sang au centre médical de l’Université de Cincinnati.

1. transcriptomique profilage de DCs de macrophages dérivés de monocytes humains exposés à des polluants

  1. Extraction de l’ARN totale de DCs BaP-exposés
    1. Différencier les DCs humaines à l’aide de cytokines GM-CSF et IL-4 et exposer DCs au BaP pendant 4 jours,13.
    2. Trier DCs exposés au BaP utilisant l’écoulement cytometry basé sur les marqueurs de surface exprimées (lignée–HLA-DR,+), dont la majorité se compose de DCs classiques (CD11c+CD1c+)13. En général, trier les 10 000 contrôleurs de domaine dans le milieu de culture contenant 10 % FBS, centrifuger DCs à 600 x g et 4 ° C pendant 6 min et retirez immédiatement le surnageant par aspiration à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL.
    3. Une fois que le surnageant est éliminé par aspiration, lyse le culot cellulaire en ajoutant 0,4 mL de tampon de lyse/liaison depuis le kit d’isolation d’ARN pour le stockage à-80 ° C avant l’extraction de l’ARN.
    4. Utiliser le kit d’isolation d’ARN avec le protocole d’extraction ARN total pour extraire le RNA total14. Mesurer l’intégrité de RNA à l’aide d’un Bioanalyzer15.
  2. Analyse transcriptomique des DCs triés (Figure 1 a)
    1. Préparer la bibliothèque à l’aide d’un kit de préparation d’ARN bibliothèque de RNA-seq. Bref, fragmentent l’ARN polyA (~ 200 bp), inverse transcrire les fragments pour le 1er volet du cDNA et suivi par la deuxième synthèse de cDNA de brin étiquetée avec dUTP.
    2. Ligaturer ADNc double brin à l’adaptateur avec une structure en épingle après purification de perle, fin-réparation et dA-tailing. Les résidus d’uracile dans le 2ème brin de la boucle d’ADNc et adaptateur avec enzyme utilisateur (réactif de l’Excision uracile-spécifique) pour maintenir la spécificité du strand et ouvrir la boucle de l’adaptateur pour PCR de l’accise.
      1. Effectuer 13 cycles de PCR avec des amorces universelles et indice spécifique afin d’enrichir la bibliothèque indexée. Nettoyer la bibliothèque et exécuté sur une puce de Bioanalyzer ADN haute sensibilité pour vérifier la qualité de la bibliothèque et la distribution de la taille.
    3. Utiliser un kit de quantification de bibliothèque et un système PCR en temps réel combinées avec des informations de taille de bibliothèque pour calculer concentration bibliothèque via une méthode de la courbe d’étalonnage.
    4. Proportionnellement poule individuellement indexées bibliothèques compatibles et ajuster la concentration totale finale à 15 h. Effectuer la génération de cluster de bibliothèque et la bibliothèque avec une valeur de lecture simple 1 x 50 bp pour produire 25 millions de lectures par exemple de séquence.
  3. Séquençage
    1. Charger le séquençage et l’indexation des réactifs pour les paniers de réactif SBS et PE, respectivement. Placer les réactifs dans un bain d’eau de qualité laboratoire pendant 1 h jusqu'à ce que toute la glace a fondu et les réactifs dans chaque bouteille/tube sont mélangés correctement.
    2. Préparer le mélange de l’ICB en ajoutant l’enzyme décongelé de colorant et de-20 ° C à la bouteille et mélanger. Préparer une solution de NaOH selon les instructions de séquençage. Placez tous les réactifs à 4 ° C jusqu’au moment de l’utiliser.
    3. Pendant les 1 h période d’attente, allumez le séquenceur. Attendez que le lecteur DONOTEJECT de comparaître et de connecter l’ordinateur à un lecteur réseau.
    4. Lancer le logiciel de commande de sequencer.
    5. Préparer 2 L de solution de lavage entretien contenant 0,5 % de Tween 20 et 0,03 % de ProClin 300 qualité en laboratoire l’eau.
    6. Dans le panier de réactif SBS, ajouter environ 100 mL de solution de lavage entretien à chacun des 8 bouteilles et bouchons de l’entonnoir pour les bouteilles. Dans le panier de réactif de PE, ajouter environ 12 mL de solution de lavage entretien à chacun des dix tubes coniques 15 mL et jeter les bouchons.
    7. Charger les deux paniers avec les bouteilles/tubes remplie de solution pour le séquenceur.
    8. Dans le logiciel de commande de sequencer, choisissez le cycle de lavage entretien ; Suivez les instructions à l’écran pour nettoyer le circuit de fluide de séquenceur jusqu'à ce que le processus est terminé.
    9. Commencer un nouveau départ dans l’onglet « Séquence » du logiciel ; diriger les données de sortie à un lecteur réseau. Choisissez les paramètres pour lecture seule 1 x 50 bp avec les bibliothèques de l’indice unique multiplexé.
    10. Éventuellement, ouvrir une session dans le moyeu de séquence BaseSpace afin que le statut de séquençage peut être contrôlé à distance via un ordinateur ou un téléphone intelligent.
    11. Télécharger un exemple de feuille de démultiplexage et renseignent le réactif selon l’exigence du logiciel.
    12. Charger les réactifs SBS et PE à l’aide du séquenceur. Amorcez le système avec une cellule de flux utilisés (~ 15 min).
    13. Une fois terminée la génération de cluster (~4.5 h), sortez la cellule de flux, vaporiser légèrement la cellule de flux d’eau et essuyer, sécher avec du papier de la lentille. Légèrement la cellule de flux de pulvérisation avec l’éthanol à 95 % et séchez-le. Sous une lumière pour vous assurer que la surface soit propre sans débris ou les résidus de sel.
    14. Une fois terminée l’étape de Prime, charger la cellule d’écoulement en cluster et démarrer le séquençage. Le logiciel de visualisation de l’analyse de séquence démarre automatiquement.
    15. Surveiller la qualité de données de séquençage par SAV dont la densité de cluster, filtre passe-bande lectures, cluster pass filtre %, % ≥Q30, % de legs de phase/la prophase, QC, etc. , que cela aide à comprendre la qualité des données et le dépannage de l’indexation.
    16. Changer le joint de cellule de flux et d’effectuer un lavage d’entretien après que le séquençage est terminé. Le séquenceur est prêt pour la prochaine exécution.
  4. Analyse bioinformatique
    1. Effectuer la bioinformatique RNA-seq données analyse13.

2. voie analyse des profils de transcriptomique (Figure 1 b)

  1. Taille-bordure Bioconductor permet de comparer la résultante gene expression intensité comtes entre des contrôleurs de domaine BaP-exposés et non exposés de trois donateurs. Ensuite, identifier des gènes différentiellement exprimés entre des contrôleurs de domaine BaP-exposés et non exposés, basés sur la variation absolue de pli (> 2 plis) et la découverte de fausse taux de valeurs (FDR) - ajusté p-(< 0,05).
  2. Pour prédire les groupes fonctionnels d’expression différentielle des gènes exprimés, utilisez le paquet de logiciel de ToppCluster pour rechercher les gènes modifiés contre plusieurs bases de données y compris KEGG et REACTOME et générer des données clusters. ToppCluster utilise le test de hypergéométrique pour obtenir un enrichissement fonctionnel via le gène liste enrichissement analyse16.
  3. Outre l’entrée les résultats de ces groupes de fonction Cytoscape17,18 Version 3.3.0, une plate-forme logicielle de source ouverte largement utilisée pour la visualisation de réseaux complexes. Ainsi, les gènes impliqués dans les différents groupes ou voies, y compris les groupes intervenant dans l’endocytose et le métabolisme des lipides, sont présentés dans un réseau avec l’annotation de la couleur du changement sans moyenne pli de gene expression (Figure 1 b)13.

3. imagerie cytométrie de CD1d et Lamp1 colocalisation

  1. Anticorps d’étiquetage de DCs BaP-exposés
    1. Exposer 0,5 x 106 DCs humaines à 5,94 mM BaP pendant 4 jours à 37 ° C dans 2 mL de Dulbecco complet milieu Eagle modifié. Récolter DCs par centrifugation à 400 g pendant 10 min. bloc la DCs différenciée en incubant les cellules avec bloqueur de sérum humain et anti-humain Fc receptor anticorps pendant 10 min dans la glace, y compris les anticorps anti-CD16, CD32 et CD64.
    2. Incuber Violet brillant 421-anti-CD1c (L161), teindre de phycoérythrine/cyanine 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR et PE/Cy5-anti-CD11c avec DCs pendant 20 min dans la glace. Le tableau 1 montre cette liste des anticorps.
    3. Difficulté de DCs avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS et leur permeabilize avec tampon de lavage perméabilisation. Effectuer la coloration intracellulaire avec un mélange de PE marquée purifiée anti-humain CD1d (51,1) et marqué Alexa Fluor 647 anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
  2. Imagerie des mesure de cytométrie de débit (Figure 2)
    1. Analyse des échantillons colorés à l’aide d’un cytomètre de flux d’imagerie à la base de cytométrie en flux de l’hôpital pour enfants de Cincinnati en utilisant un objectif X 40 à 300 pixels pour une cellule avec environ 10 mm de diamètre. Taille d’un pixel est d’environ 0,5 mm de 0,5 mm de l’objet.
    2. Acquisition de 10 000 images cellulaires de manière impartiale, selon les instructions du fabricant.

4. imagerie Analyses d’Images de cytométrie en flux

  1. Analyse de colocalisation à l’aide de logiciels d’idées (Figure 2)
    1. Effectuer une compensation avec single tachée par rapport aux échantillons non teinté en réglant l’intensité de la fluorescence des échantillons non teinté le seuil, y compris non colorés exposés au BaP DCs avec BaP autofluorescence, comme données de cytométrie en flux régulier analyse.
    2. Porte de coloration des cellules afin d’obtenir des sous-ensembles d’HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ cellules (Figure 2 a) et afficher les images cellulaire dans les sous-ensembles fermées (Figure 2 b).
    3. Enregistrer les images de cellule dans un format png, basé sur deux critères d’inclusion technique, la présence visuelle de forts signaux co tachées et localisation sous-cellulaire des protéines CD1d et Lamp1, pour les analyses de co-localisation avec ImageJ-Fidji (Figure 2 b).
  2. Logiciels ImageJ-Fidji permet d’effectuer des analyses de colocalisation (Figure 3).
    1. Préparer les fichiers image en fusionnant les 100 images enregistrées cellule pour DCs humaines non exposés et exposés au BaP, respectivement (Figure 3 a).
    2. Analyser CD1d (rouge) et Lamp1 colocalisation (vert) à l’aide d’un diagramme de dispersion.
      1. Exécutez le programme d’ImageJ-Fidji. Ouvrir le fichier .png avec 100 images de cellules (Figure 3 b et 4 a Figure) : « fichier | Ouvrir ».
      2. Fractionner l’image avec les canaux rouges et verts fusionnées en deux images avec un rouge ou un canal vert : « Image | Couleur | Fractionner des chaînes ».
      3. Dessiner un diagramme de dispersion en utilisant les commandes « Analyze | Colocalisation | Seuil de colocalisation ». Enregistrez le diagramme de dispersion à l’aide de la touche « PrintScreen » .
    3. Calculer les coefficients de colocalisation de Mander pour chaque image cellulaire unique (n = 100) (Figure 4 b)
      1. Sélectionnez une image de cellule unique sur le fichier image avec split chaînes à l’aide de la "ovale » outil de sélection.
      2. Utiliser les commandes « Analyze | Colocalisation | Seuil de colocalisation ». Sélectionnez « Channel 1 » dans la boîte de dialogue de la région d’intérêt (ROI). Garder toutes les options de calcul, y compris « Mander à l’aide de seuils » pour chaque image de la cellule.
      3. Répétez ce calcul pour toutes les images de 100 cellules.
      4. Enregistrer et ouvrir les résultats à l’aide d’une feuille de calcul.
      5. Tracer la moyenne et les erreurs-types pour les « Coefficients de binariser Massé » (n = 100, 0 signifie aucune colocalisation et 1 signifie colocalisation parfaite). Test t de Student permet de calculer la valeur de p pour la comparaison entre les groupes de BaP-exposés et non exposés (Figure 4 b).
    4. Calculer le pourcentage d’intensité pixel seuillée co localisée entre CD1d et Lamp1 pour plusieurs images de cellules (n = 100) (Figure 4).
      1. Utiliser le même protocole d’analyse en 4.2.3 et en outre, sélectionnez l' option de résultat « % intensité seuil épididymaire ».
      2. Effectuer cette analyse ainsi que les coefficients de colocalisation de Massé.
      3. De même, tracer la moyenne et les erreurs-types pour % intensité épididymaire entre CD1d et Lamp1. Test t de Student permet de calculer la valeur de p pour la comparaison entre les groupes de BaP-exposés et non exposés (Figure 4).

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Résultats

Les polluants lipophiles BaP modifie des groupes de gènes intervenant dans l’endocytose dans DCs de macrophages dérivés de monocytes DCs. homme humains de chaque donateur (n = 3) ont été incubées en présence de BaP et triés pour DCs classiques, qui ont été utilisés plus de RNA extraction et transcriptomique d’analyse tel que décrit . Lors de la normalisation de l’expression des gènes, les gènes modifiés entre groupes BaP-exposés et non exposés ont été regroupés selon la corrélation foncti...

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Discussion

Confirmation fonctionnelle d’une voie de gène est difficile, en raison de l’expression génique largement contaminé impliquant de multiples voies et la difficulté d’intégrer les activités cellulaires individuelles et populationnelles. Nous avons utilisé d’imagerie cytométrie à spécifiquement test CD1d traite des compartiments de l’endocytose. Cytométrie en flux d’imagerie intègre la mesure populationnelle des cellules et la démonstration individuelle de colocalisation subcellulaire des protéines multiples. Microscopie con...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Remerciements

Les auteurs remercient Robert Giulitto (Centre de sang Hoxworth) pour les échantillons de sang humain et Dr Liang Niu pour la normalisation de l’expression génique lit. Nous remercions également les subventions de l’Institut National of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for Environmental génétique (CEG) projetpilote (S.H.), Institut National des allergies et maladies infectieuses (AI115358) (S.H.), Université de Cincinnati University Research Council award (S.H.) et l’Université de Cincinnati College de médecine Enhancement financement de base (X. Z.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
TranscriptomiqueIlluminaHiSeq 2500 v4Système Illumina HiSeq
ImagingStream XMillipore100220Imagerie cytométrie en flux
mirVana Kit d’isolement des miARNThermo FisherExtraction totale de l’ARN
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilentdu contrôle qualité de l’ARN total
Veriti 96 puits Thermocycleur Thermo Fisher PCR, réaction enzymatique
NEBNext Module d’isolement magnétique de l’ARNm poly(A)  ;New England BiolabPurification de l’ARN PolyA
Système automatisé SMARTer ApolloPurification de l’ARNTakara
NEBNext Ultra Kit de préparation de la bibliothèque d’ARN pour IlluminaNew England BiolabPréparation de la bibliothèque
Agencourt AMPure XP Perles magnétiques BeckmanCoulterPurification de l’ADN  ;
2100 BioanalyseurAgilentLibrary QC, analyse de la distribution de taille
Kit d’ADN haute sensibilité AgilentLibrary QC, analyse de la distribution de taille
QuantStudio 5 Système de PCR en temps réel (Thermo Fisher)Quantificationde la bibliothèqueThermo Fisher
NEBNext Library Quant Kit Quantification
Générationde cluster de la bibliothèquecBot Illumina
de cluster TruSeq SR v3 - cBot &ndash ; HSIlluminaLibrary cluster generation
HiSeq 1000SéquençageIllumina
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 cycles)SéquençageIllumina
Phycoérythrine/Cyanine 7 (PE/Cy7)Bio LegendL243
Phycoérythrine/Cyanine 5 (PE/Cy5)Bio Legend3.9
Violet brillant 421Bio LegendL161
PE-anti-souris IgG2bBio Legend51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)Bio LegendCD107a(H4A3)
Analyse PolyA de la bibliothèque New England Biolab Kit

Références

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