Article de méthode

Évaluation de l’Inclusion d’Exon induite par Splice commutation oligonucléotides antisens de fibroblastes de patients de SMA

DOI :

10.3791/57530

⸱

11 mai 2018

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Muscular Dystrophy Canada Research Chair, Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Induire l’inclusion exon (modulation d’épissure) et expression de SMN pour l’atrophie musculaire spinale (SMA) de sauvetage ont démontré différents oligonucléotides antisens (NAO). Nous décrivons ici un protocole pour lipotransfection AON induire l’inclusion d’exon du gène SMN2 et les méthodes d’évaluation pour déterminer l’efficacité chez les patients fibroblastes SMA.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atrophie musculaire spinale (SMA), une maladie neurologique mortelle causée par la perte du SMN1, présente un cas unique dans le domaine des oligonucléotides antisens (AON)-médiation thérapeutique. Tandis que SMN1 mutations sont responsables de la maladie, Nao ciblant les sites d’épissage intronic silencieux (ISS) SMN2, y compris nusinersen approuvé par la FDA, a été démontré pour restaurer expression SMN et atténuer les symptômes. Actuellement, de nombreuses études portant sur la thérapie AON pour SMA se concentrent sur l’étude des nouvelles chimies AON ciblage SMN2 qui peut être plus efficace et moins toxique que nusinersen. Nous décrivons ici un protocole pour l’évaluation de in vitro de l’inclusion d’exon à l’aide de lipotransfection de Nao, suivie de la chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR), PCR quantitative (qPCR) et Western Blot. Cette méthode peut être utilisée pour différents types de chimies AON. En utilisant cette méthode, nous démontrons que Nao composé d’alternance des acides nucléiques verrouillés (LNA) et nucléotides de l’ADN (LNA/ADN mixmers) conduisent à efficace de SMN2 exon inclusion et de restauration des protéines SMN à une concentration très faible et par conséquent, LNA / Oligonucléotides antisens axée sur les mixmer de l’ADN peuvent être une stratégie thérapeutique séduisante pour traiter l’épissage défauts causés par des maladies génétiques. La méthode évaluation in vitro décrite ici est rapide, facile et assez sensible à l’essai de divers nouveaux NAO.

Introduction

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Atrophie musculaire spinale (SMA) est un trouble neuromusculaire mortels hérité dans une transmission autosomique récessive. Elle est caractérisée par la dégradation des neurones moteurs et tronc progressive et branche musculaire paralysie1,2. La majorité des événements de SMA est due à une mutation homozygote dans le gène de la survie des neurones moteurs 1 (SMN1)3. Le gène de la survie des neurones moteurs 2 (SMN2) est un doublon inverse du SMN1et a une séquence presque identique différant par seulement cinq bases4,5. Une transition de C-à-T en SMN2 situé dans l’exon 7 rend le gène presque ne fonctionne pas parce que la mutation conduit à l’essentiel exon 7 étant exclu dans près de 90 % des transcriptions de SMN2 (Figure 1a). MRNA SMN2 manquant exon 7 ne peut pas compenser la fonction SMN1 parce que son produit protéique est instable et se dégrade rapidement.

La thérapie antisense a récemment émergé comme une stratégie prometteuse pour le traitement des SMA6. La récente approbation de nusinersen par la U.S. Food et pharmaceutiques (FDA) en fait le premier médicament disponible pour traiter la SMA7. Nusinersen est un oligonucléotide antisens 18-mer (AON) avec une modification de la 2 '-O-methoxyethyl (MOE) et une colonne vertébrale phosphorothioate. Le médicament cible le silencieux épissage intronic N1 (ISS-N1) situé dans l’intron 7 du gène SMN2 . Liaison de la nusinersen à ISS-N1 favorise la récupération de l’expression des protéines SMN pleine longueur fonctionnelle du gène SMN2 endogène en induisant l’exon 7 inclusion (Figure 1a)8,9,10 . Actuellement, de nombreuses études portant sur la thérapie AON pour SMA se concentrent sur l’étude des chimies AON roman qui peuvent être plus efficace et moins toxique que nusinersen. Il a été démontré que Nao avec autres chimies induire aussi efficacement inclusion exon dans l’exon SMN2 7 fois in vitro et in vivo11,12,13.

Acides nucléiques verrouillés (LNA) sont des analogues de RNA chimiquement modifiés contenant un pont méthylène reliant le 4′ -carbone avec la 2′ -oxygène dans les furanoses structure (Figure 1b)14,15. Comparé à l’ADN ou d’ARN, LNA ont une affinité accrue pour la liaison aux séquences d’ARN complémentaires et ont l’avantage d’être très résistant aux nucléases endogènes. La chimie de la LNA a été appliquée pour une utilisation comme sondes d’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et qPCR16,17. Par ailleurs, il est utilisé pour réguler l’expression génique in vitro et in vivo. GapmeR Nao sont une combinaison de molécules d’ADN simple brin flanqué de LNA plusieurs extrémités 5′ et 3′. Ils démantèlent l’expression des gènes en se liant complémentaires de l’ARNm ciblés, obligeant à être dégradé par les activés de la RNase H18. Mixmers LNA/ADN sont Nao qui se composent de nucléotides d’ADN intégrés entre LNA. Présenté dans cette orientation ils peuvent lier miRNA inhibe sa fonction (LNA-antimiR)19. Certains LNA-antimiRs ont atteint le développement clinique. Pour obtenir des exemples, miravirsen (AntimiR-122) est un LNA-antimiR qui inhibe miR-122 pour traiter l’infection par le virus de l’hépatite C et plusieurs essais cliniques de Phase II sont actuellement en cours de19,20. Récemment, il a été démontré que LNA/ADN mixmers peut aussi moduler RNA épissage21. Il peut lier une séquence spécifique d’ADN messagère et induire exon skipping en dystrophine ARNm et exon inclusion dans SMN2 mRNA in vitro13,22.

Dans cet article, nous décrivons une méthodologie pour l’induction de l’inclusion d’exon à l’aide de la NAO et l’évaluation de l’efficacité au niveau de l’ARN et de protéine. Pour illustrer cette méthode, nous avons utilisé le mixmers LNA/ADN ciblage ISS-N1 dans l’intron 7 de SMN2. Nao transfectés dans des cellules de patients de SMA par lipotransfection induite par l’inclusion d’exon 7 dans la transcription finale de SMN2 et l’augmentation de la production de protéine SMN. Un des avantages d’à l’aide de LNA/ADN mixmers pour induire l’inclusion de l’exon est que la concentration effective pour la transfection est significativement plus faible que les autres chimies13. Cette méthode peut être utilisée pour de nombreux autres Nao sauf phosphorodiamidate morpholino oligomères (OMP), qui, en raison de leur charge neutre, doivent entrer dans les cellules par endocytose induite par le réactif de transfection co Endo-Porter.

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Protocole

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1. culture cellulaire

  1. Fibroblastes patients de SMA de la culture dans le milieu (Dulbecco modifié Eagle moyen 1:1-12 (jambon) avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 0,5 % pénicilline/streptomycine) dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.
  2. Déterminer la concentration de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées et diluer les cellules à 1 x 105 cellules/mL dans le milieu de croissance, puis les semences sur la plaque appropriée. Utiliser 12 plats (1 mL / puits) pour la RT-PCR ou qPCR.
  3. Incuber les boîtes pendant 24 h dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.

2. la transfection de mixmer LNA/ADN

  1. Assurer la confluence de la cellule d’environ 65 à 80 % pour une efficacité optimale de la transfection.
  2. Dégel de 10 μM LNA/ADN mixmers lentement sur la glace.
  3. Dans un tube de 1,5 mL, préparer une solution de x mixmer 20 en ajoutant le mixmers aux médias privés de sérum afin que le volume final atteigne 50 μL.
  4. Mélanger la solution de mixmer avec 50 μL de médias privés de sérum contenant le réactif de transfection de 3 % (ratio de 1:1).
  5. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
  6. Ajouter 900 μl sérum milieu avec 5 % FBS dans chaque tube.
  7. Aspirer les anciens médias de la plaque et les remplacer par 1 mL de solution de mixmer LNA/ADN contenant le réactif de transfection.
  8. Incuber les cellules pendant 24-48 h à 37 ° C dans un incubateur à CO2 .

3. extraction de l’ARN

  1. Enlever le milieu et ajouter 1 mL de réactif de thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium aux cellules. Laver le fond des temps ainsi plusieurs guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme et percevoir dans des tubes de 1,5 mL.
  2. Vortex à haute vitesse pendant 30 s et conserver à-80 ° C pendant 1 h ou toute une nuit.
  3. Laisser décongeler à température ambiante et vortex bien.
  4. Ajouter 200 chloroforme µL, agiter vigoureusement pendant 15 s et incuber à température ambiante pendant 3 min.
  5. Centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  6. Recueillir la phase aqueuse limpide haut de la page dans un nouveau tube. Veillez à éviter la collecte de l’interphase blanche qui se forme entre les phases supérieures et inférieures.
  7. Ajouter 500 µL isopropanol et 1 µL 8 µg/µL glycogène (grade de RNA). Vortexer pendant 10 s et incuber à température ambiante pendant 10 min ou à-20 ° C jusqu’au lendemain.
  8. Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C et retirer tout le liquide surnageant. Une pastille blanche se forme sur le fond du tube.
  9. Ajouter 1 mL d’éthanol à 75 % froid et centrifuger à 7 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
  10. Retirer tout l’éthanol et sécher le culot à la température ambiante jusqu'à ce qu’aucun éthanol n’est laissé dans le tube.
  11. Dissoudre le culot dans 30 µL DNase/RNase d’eau libre et incuber pendant 10 min à 60 ° C.
  12. Mesurer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre (à 260 nm) et ajuster la concentration en ARN à 50 ng/µL.

4. one step RT-PCR pour mesurer le taux d’inclusion exon de SMN2

  1. Mix 12,5 µL de 2 x tampon de réaction de RT-PCR, mélange de 1,0 µL d’enzyme RT-PCR en une étape, 0,5 µL de chaque amorce (SMN2 avant : 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 inverse : 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH vers l’avant : 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH inverse : 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µL d’ARN total (50 ng/µL), et 8,5 µL de RNase/DNase-libre de l’eau distillée.
  2. Après que ADNc est synthétisé à 50 ° C pendant 15 min, commencer à la réaction de PCR. Amplifier l’exon SMN2 6-8, avec 30 cycles PCR (94 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 25 s). Amplifier la GAPDH avec 20 cycles PCR (94 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 20 s).
  3. Ajouter 5 μL 6 x chargement de teinture du produit de PCR et charger 5 µL du mélange dans un gel d’agarose de 2 % et pendant 40 min à 100 V.
  4. Le gel d’image et de les analyser à l’aide de logiciels ImageJ.
  5. Mesurer l’intensité des bandes de Δ7 et de bandes de pleine longueur. Pour calculer le taux d’inclusion de l’exon 7 la valeur de l’intensité des (longs) / (album + Δ7 SMN2).

5. quantitative PCR (qPCR) pour mesurer le taux d’inclusion exon de SMN2

  1. Pour la synthèse de cDNA, mélanger 1 µL Oligo dT, 1 µL dNTPs de 10 mM et 11 µL total RNA (50 ng/µL). Incuber à 65 ° C pendant 5 min.
  2. Placer les échantillons sur la glace et ajouter 4 µL 5 x tampon, 1 µL 0,1 M TNT, 1 inhibiteur de RNase µL et 1 µL de la transcriptase inverse dans chaque échantillon.
  3. Incuber à 50 ° C pendant 60 minutes et faire chauffer jusqu'à 80 ° C pendant 10 min arrêter la réaction. L’ACQ peut être conservé à-20 ° C.
  4. Diluer les ADNc eau exempte de RNase (dilution 1:5). Mix 10 µL 2 x mélange d’enzymatique de qPCR SYBR Green, amorce de 10 µM de chaque 0,8 µL (pleine longueur SMN2 avant : inverse de SMN2 standard, 5′-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3′ : 5′-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3′, Δ7 SMN2 avant : 5′ - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 inverse : 5′-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3′, GAPDH avant : 5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′, GAPDH inverser : 5′-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3′), 3 µL dilué ARNC et l’eau exempte de RNase 5,4 µL.
  5. Démarrer la réaction de qPCR. Les conditions d’utilisation : 95 ° C pendant 30 s, puis un cycle de 40 répéter à 95 ° C pour 5 s et 60 ° C pendant 20 s.
  6. Calculer l’expression relative de pleine longueur SMN2 à GAPDH ou Δ7 SMN2et normaliser les cellules non traitées avec l’algorithme de ΔΔCt.

6. Western Blot

  1. Éliminer le milieu de la transfection des cellules et laver avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) une fois.
  2. Ajouter 100 µL de tampon de lyse avec un inhibiteur de la protéase.
  3. Détacher les cellules du fond de chaque puits à l’aide d’un grattoir de cellules stériles et recueillir dans des tubes de 1,5 mL. Incuber les échantillons sur la glace pendant 30 min.
  4. Traverser cellule lysat aiguille 21 G 10 fois pour écraser les cellules.
  5. Centrifuger à 20 800 x g pendant 15 min à 4 ° C et recueillir le liquide surnageant dans nouveaux tubes de 1,5 mL. L’échantillon peut être stocké dans un congélateur à-80 ° C.
  6. Déterminer la concentration de protéines à l’aide d’un Kit de dosage de protéines BCA et ajuster la concentration à 1,0 µg/µL.
  7. Échantillons de Mix 5 µL et 5 µL 2 x tampon échantillon de sodium dodecyl sulfate (SDS) (10 % SDS ; 14 % 0,5 M solution Tris-HCl pH 6,7 ; 1 % 0,5 M EDTA-2Na solution mère, pH 8,0 ; 20 % glycérol ; colorant bleu de bromophénol de 0,004 %, 5 % de β-mercaptoéthanol) et chauffer à 70 ° C pendant 10 min.
  8. Charger les échantillons dans un 4-12 % protéines Bis-Tris gélifie et fonctionner pendant 1 h à 150 V.
  9. Tremper un épais papier filtre dans chaque tampon : (tampon concentré anode : 0,3 M Tris-HCl, 20 % de méthanol ; tampon anode : 0,03 M Tris-HCl, 20 % de méthanol ; tampon de cathode : 25 mM Tris, 20 % de méthanol, de l’acide 6-amino-n-hexanoïque 40 mM, SDS de 0,01 %).
  10. Tremper une polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane dans le méthanol pendant 20 s, puis transférez-le dans le tampon de l’anode.
  11. Equilibrer le gel SDS-page avec le tampon de cathode pendant 5-10 min sous agitation.
  12. Placez les papiers filtres, membranes PVDF et le gel sur une machine de transfert semi-sec, comme suit : concentré anode tampon papier/anode tampon papier/PVDF membrane/protéine gel/cathode tampon papier (Figure 2).
  13. Couvrez la pile et démarrer le transfert à 20 V pendant 30 min.
  14. Après le transfert, rincez la membrane en PVDF avec PBST (PBS avec 0,05 % Tween 20) une fois.
  15. Bloquer la membrane à température ambiante pendant 30 min dans le lait écrémé en poudre 5 % dissous dans du PBST ou à 4 ° C pour la nuit.
  16. Diluer un anticorps anti-SMN de souris purifié et un anticorps de lapin anti-Cofilin 1/10 000 en 5 % lait écrémé en poudre dans du PBST. Incubez la membrane dedans pendant 1 h à température ambiante ou à 4 ° C durant la nuit.
  17. Laver 3 fois avec PBST pendant 10 min.
  18. Diluer l’anticorps secondaires (conjugué HRP chèvre anti-souris et anti-lapin IgG (H + L)) à 1/10 000 à 5 % de lait écrémé en poudre dans le PBST. Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité.
  19. Laver la membrane 3 fois avec PBST pendant 10 min.
  20. Détecter le signal de bande à l’aide de la chimiluminescence Western blotting kit de détection.

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Résultats

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À l’aide de fibroblastes de patients SMA, nous avons ciblé la région ISS-N1 de silencieux dans l’intron 7 du gène SMN2 avec huit mixmers LNA/ADN antisens différents qui ont été transfectées à une concentration de nM 5 (Figure 3). Chacun de la mixmers contenait un squelette mis à jour le phosphorothioated qui leur a permis de résister à la détérioration de la nucléase. Pour évaluer l’efficacité de le mixmers, le taux de SMN2 exon 7 inclusion ...

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Discussion

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La méthode évaluation in vitro décrite ici est rapide, facile et assez sensible pour l’essai des plus diverses. Ce protocole est largement applicable à exon skipping et l’inclusion d’autres gènes et divers types de cellules. En outre, la plupart chimies AON (sauf PMOs) peuvent transfecter à l’aide de cette méthode. Nao peut réglementer l’épissage d’un pré-ARNm des gènes endogènes et artificiellement introduits et peut être co-transfectées avec des vecteurs de plasmide porteur de gènes ciblés.

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs remercient Nicole McRorie pour aider avec les expériences. Ce travail a été soutenu par la faculté de l’Université de l’Alberta de médecine et dentisterie, Slipchuk SMA subvention de recherche de recherche Fondation, les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), les amis du Fonds de recherche de Cumming de Garrett, HM Toupin neurologique Fonds de la recherche scientifique, la dystrophie musculaire Canada, la Fondation canadienne pour l’Innovation, entreprise de l’Alberta et l’enseignement postsecondaire et les femmes et les enfants Health Research Institute (WCHRI).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
FibroblastesSMA Coriell NIGMS dépôt de cellules génétiques humainesGM03813
milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher11320033
Sérum de veau fœtalSigma-AldrichF1051
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher15140122
Trypsine-EDTA (0,05 %), rougede phénolThermo Fisher25300062
Milieu privé de sérumThermo Fisher31985070
Réactif de transfectionThermo Fisher15338100
thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium (TRIzol)Thermo Fisher15596-018
AmorcesSéquence 5' à 3'SMN2
en avant :  ;CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 à l’envers :  ;TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH en avant :  ;TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH inverser :  ;GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR Amorces
pleine longueur SMN2 avant :GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT
pleine longueur SMN2 arrière :  ;CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH en avant :  ;GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH reverse :AGGGATCTCGCTCCTGGAA
ChloroformSigma-AldrichP3803
Glycogène, grade ARNThermo FisherR0551
Logiciel
Inhibiteur de cocktail de protéase  ;Roche11836153001
Tampon cathodique0,025 M Base Tris + 40  ; Acide 6-aminocaproïque mM + 20 %
de tampon0,03 M de base Tris + 20 % de tampon
d’anode concentré de0,3 M de base Tris + 20 %
méthanol bêta-mercaptoéthanolMilliporeES-007-E
  ;GE10600021
Tampon de chargement/d’échantillonnage pour Western blotNuPage InvitrogenNP007
One-Step RT-PCR kit  ;Qiagen  ;210210
dNTPClontech3040
RT-PCR ImageJ d’anode de méthanol méthanol de Membrane PVDF

Références

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valuation de l inclusion des exonsexon 7 de SMN2protocole de lipotransfectionanalyse par RT PCRPCR quantitativeWestern Blotmixmers LNA ADNth rapie par oligonucl otides antisens

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