Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour la visualisation de projection des motoneurones et arborisation axone dans des embryons de souris transgéniques Hb9::GFP . Après immunostaining des neurones moteurs, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence nappe de lumière aux embryons d’image analyse quantitative. Le présent Protocole s’applique à d’autres processus de navigation neurone du système nerveux central.

Abstract

Les neurones moteurs spinaux (MNs) étendent leurs axones pour communiquer avec leurs cibles innervating, contrôlant ainsi le mouvement et les tâches complexes chez les vertébrés. Ainsi, il est essentiel de découvrir les mécanismes moléculaires de comment moteur axones Placez-vous, arborize et innervent leur musculature périphérique cible pendant le développement et la dégénérescence. Bien que les lignées de souris transgéniques Hb9::GFP ont longtemps servi de visualiser les trajectoires de l’axone moteur durant le développement embryonnaire, des descriptions détaillées de l’ensemble de l’arborisation terminale axon restent incomplets en raison de la complexité du modèle et limitations de la microscopie optique actuelle. Nous décrivons ici un protocole amélioré qui combine la microscopie de fluorescence de nappe de lumière (LSFM) et analyse d’images robuste qualitativement et quantitativement visualiser des axones moteurs de développement. Ce système peut être facilement adopté pour traverser mutants génétiques ou des modèles de maladies MN avec des lignes Hb9::GFP , révélant de nouveaux mécanismes moléculaires qui conduisent à des irrégularités dans la navigation de l’axone moteur et arborisation.

Introduction

MNs de la colonne vertébrale sont la partie du système nerveux central mais innervent des muscles périphériques pour contrôler le mouvement. Dans la pays en développement de la moelle épinière, progéniteurs MN (PMN) sont établis selon les signaux émanant de la notochorde et des somites adjacents. Toutes différencient MNs post-mitotiques sont ensuite générés à partir de PMN, éventuellement donnant lieu à une série de sous-types de MN le long de l’axe Rostro de la moelle épinière^1,2. La colonne vertébrale MNs sont topographiquement et anatomiquement bien organisés. Leur arrangement morphologique est en corrélation avec la position de leurs cibles respectives dans la périphérie de³. En atteignant leurs objectifs de muscle, axones recevoir des facteurs neurotrophiques cellulaires et exogènes que les inciter à s’étendre et de la branche plus loin dans les muscles. Innervation et défauts ramifications peuvent contribuer à l’échec pour former des jonctions neuromusculaires (NMJ). Par exemple, des facteurs neurotrophiques gliales (GDNF)-Pea3 induite est indispensable pour ces axones dans maximus cutanée (CM) et^4,5les muscles grand dorsal (LD). En outre, des embryons de souris knock-out DINE montrent défectueuse arborisation des nerfs phréniques dans le diaphragme, provoquant la mortalité et une insuffisance respiratoire immédiatement après la naissance de^6,7. Cette dernière étape de maturation de MN (c.-à-d., projection axonale et ramification) est donc essentielle pour assurer la communication entre les neurones et les cellules cibles.

Pour afficher les modèles de l’arborisation, chercheurs procéder normalement à imagerie confocale ou microscopie de fluorescence biphotonique sectionnés ou entier-montent des échantillons^8,9,10. Deux de ces techniques de microscopie génèrent acceptable résolution et profondeur de pénétration. Microscopie de fluorescence biphotonique implique l’excitation des fluorophores par absorption simultanée de deux photons de faible énergie,¹¹. Puisque l’excitation biphotonique utilise le rayonnement infrarouge, la fréquence d’excitation baisse contribue à la diffusion réduite et meilleure pénétration tissulaire jusqu'à 1 mm dans les tissus, permettant ainsi l’imagerie avec une plus grande profondeur. Microscopie confocale supprime par les filtres de signaux de l’out-of-focus et recueille uniquement la lumière dans le plan focal¹². Avec cette approche, images des échantillons provenant des plans focaux différents peuvent être combinés pour produire une image tridimensionnelle de (3D) via une fonction de Z-pile. Néanmoins, intensité du signal est réduite car la plupart de la lumière est bloquée et les ouvertures numériques hautes obscurcir la profondeur de champ. Plus important encore, les deux techniques contribuent au photovieillissement sévère et phototoxicité puisque l’échantillon entier reçoit illumination même lorsque qu’un avion est imagé à un moment donné.

Pour contourner ces lacunes, LSFM est devenu une alternative favorisée, avec l’avantage d’être rapide et efficace à la lumière et les moins phototoxique^13,14. En outre, LSFM permet l’imagerie multi-vues. Cette approche est particulièrement adaptée à la visualisation des axones moteurs et leurs terminaux de dispersion comme ils se propagent dans l’espace 3D. LSFM surpasse les deux autres options parce que les échantillons sont montés sur une scène qui permet la rotation autour d’un axe vertical et les mouvements le long des x, y et les axes z. Cette configuration permet non seulement pour une vue bloqué au minimum de l’échantillon, mais aussi le choix d’un chemin de l’illumination souhaitable, une lacune de la microscopie biphotonique et confocale, qui nécessitent le montage d’échantillons sur une lame plate. LSFM est donc l’outil plus approprié pour l’imagerie 3D d’arborisation axon et pour la quantification des terminaisons nerveuses moteur dans des embryons de souris.

Protocol

Tous les animaux vivants ont été entretenus dans un agent pathogène spécifique gratuit (SPF) animalerie, approuvé et supervisé par IACUC de l’Academia Sinica.

1. la fixation

1. Recueillir des embryons de jour embryonnaire 12,5 (E12.5) puis décapiter et éviscérer leur.
2. Difficulté les embryons individuellement en plaques 24 puits avec 1 mL/puits de paraformaldéhyde fraîchement préparée de 4 % en 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS) du jour au lendemain. Incuber à 4 ° C dans un agitateur.
3. Lavez les embryons fixes au moins 3 x, chacun pendant 5-10 min, avec 1 mL de PBS 1 x et incuber une nuit à 4 ° C dans un agitateur pour enlever le paraformaldéhyde résiduelle.

2. ensemble-Mont Immunostaining

1. Permeabilize chaque embryon dans 1 mL de 0,5 % PBS-Triton-X-100 (PBST) durant la nuit à 4 ° C dans un agitateur.
2. Bloquer chaque échantillon avec 1 mL de 10 % FBS préparé dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C dans un agitateur.
3. Incuber l’embryon avec 1 mL d’anticorps primaire anti-GFP (1:1, 000 dilution à 10 % FBS) à 4 ° C pendant 72 h avec agitation constante pour intensifier le signal GFP des nerfs moteurs.
4. Après l’incubation de l’anticorps primaire, se laver avec 1 mL de 0,5 % PBST au cours des 1-2 jours à 4 ° C dans un agitateur, changeant le 0,5 % PBST au moins trois fois.
5. Appliquer 1 mL d’anticorps secondaire (1:1, 000 dilution à 10 % FBS) et incuber pendant la nuit dans l’obscurité à 4 ° C sous agitation constante.
6. Laver 3 x avec 1 mL de 0,5 % PBST à 4 ° C dans un agitateur au cours des 2 ou 3 jours. Conserver les échantillons dans du PBS 1 x à 4 ° C jusqu'à la veille de l’imagerie.
   Remarque : Les embryons peuvent être disséqués en segments plus petits avant d’effacer, selon celle qui part des embryons sont projeté. Les membres antérieurs sont conservés dans cette approche expérimentale (Figure 1 a).
7. Incuber l’embryon dans un réactif de compensation commerciale avec un indice de réfraction ND 1.49 dans un tube de 1,5 mL, abri de la lumière à température ambiante pendant la nuit, afin de restituer l’embryon transparent pour l’imagerie.
   NOTE : Le volume de la compensation de réactif est environ cinq fois celle du volume de l’échantillon.

3. LSFM (2 – 3 h)

1. Montage de l’échantillon
   1. Mis en place 5 X / 0,1 optique de l’éclairage et 5 X / 0,16 optique de détection. Assemblez le porte-échantillon et le capillaire de l’échantillon (1,5 mm de diamètre intérieur, vert) et placez-les dans le microscope.
      Remarque : Reportez-vous au manuel de fonctionnement du microscope pour les procédures d’installation détaillées.
   2. Monter l’embryon comme suit :
      1. Préparer l’embout de la pipette P200 en coupant la partie supérieure afin qu’elle s’adapte au diamètre du capillaire et enlever la partie triangulaire (~ 3 mm) pour la fixation de l’échantillon.
      2. Faire fondre la fin mitigée de l’embout de la pipette à l’aide d’une petite flamme.
      3. Éteindre la flamme et de fixer rapidement l’embryon verticalement sur la fin fondue.
      4. Monter la partie supérieure de l’embout de la pipette avec l’échantillon capillaire.
   3. Laisser le tampon de la chambre s’équilibrer avec l’embryon pendant 1 min débarrasser des débris ou des bulles.
   4. En utilisant le logiciel d’imagerie, sélectionnez Locate capillaire sous l’onglet Rechercher et réglez x, y, axes z pour positionner le capillaire de l’échantillon.
   5. Sélectionnez l’échantillon de localiser et de zoom à 0,6 X de se concentrer sur l’embryon. Faire pivoter l’embryon pour s’assurer que l’axe longitudinal de la branche image s’aligne sur le trajet optique des deux sources lumineuses (Figure 1 b).
2. Acquisition d’images
   1. Sous l’onglet Acquisition , définir les paramètres de parcours lumineux tels que les objectifs de détection, laser blocage filtre séparateur de faisceau, caméras et lasers.
      Remarque : Le canal de la GFP est utilisé dans cette expérience (longueur d’onde Excitation : 488 nm ; filtre d’émission : BP 505 à 545 nm, séparateur de faisceau : SPS LP 560).
   2. Cochez la case scan de pivot pour la réduction de l’ombre.
   3. Définir les paramètres d’acquisition : profondeur de couleur, 16 bits ; Zoom, 0,36-0,7 X ; illumination de simple-côté (gauche/droite) ou double-côté éclairage.
   4. Cliquez sur continue , puis définir l’intensité du laser, durée d’exposition, puissance laser et position de la nappe de lumière d’acquérir des images plus nettes.
      Remarque : La puissance du laser est maintenue aussi basse que possible réduire au minimum le photovieillissement.
   5. Appuyez sur STOP pour mettre fin à une acquisition d’images.
3. Acquisition de multidimensionnelle
   1. Définir la z-pile en déplaçant la position Z pour la première et la dernière image. Cliquez sur Optimal pour définir le nombre de tranche.
   2. Cliquez sur Démarrer expérience pour acquérir la z-pile sélectionnée.
   3. Lorsque c’est fait, enregistrez l’image au format .czi.
4. Traitement de l’image (facultatif)
   1. Procéder à la fusion double côté sous le canal de Lightsheet traitement si dual-side illumination est appliquée. MultiView de traitement n’est nécessaire si plusieurs vues sont acquis pour combiner des images sous plusieurs angles.
   2. Créer une image 2D en utilisant les données de pixels plus hautes intensité le long de l’axe de projection sous le canal de la Projection d’intensité maximale .
   3. Sous canal de copie , cliquez sur sous-ensemble pour sélectionner des sous-ensembles d’images du jeu original.

4. la quantification de l’arborisation Axon (30 Min pour chaque nerf individuel)

1. Ouvrez le fichier image dans le logiciel d’analyse d’imagerie (par défaut, l’image qui contient les données XYZ est ouvert en mode Surpass et comme un point de vue 3D-rendu).
2. Ajuster la couleur de l’image, luminosité et contraste à l’aide de la fenêtre de Réglage de l’affichage (Edit | Réglage de l’affichage montrent) pour détecter les filaments basées sur le contraste de l’intensité locale.
3. Cliquez sur l’icône Ajouter nouveaux Filaments et sélectionnez l’algorithme Autopath (pas de boucle) dans le menu déroulant.
4. Sélectionnez la région d’intérêt (dans ce cas, l’axone segmentation d’intérêt). Cliquez sur suivant lorsque vous avez terminé.
5. Définir les points de départ et semences en attribuant les mesures de diamètre plus grand et plus mince, ce qui peuvent être mesurées en utilisant le mode de la tranche .
6. Attribuer un point de départ au bord de la région d’intérêt. Pour obtenir le manuel ajout ou la suppression des points de départ, d’abord changer le mode de pointeur (naviguer | Sélectionnez) et puis MAJ + clic-droit sur les points d’intérêt.
7. Sélectionnez manuelles seuils pour les points de la graine pour s’assurer que tous l’arborisation visible est marqué. Changer le mode de pointeur (naviguer | Sélectionnez) et puis MAJ + clic gauche sur les points d’intérêt pour manuellement ajouter ou supprimer des points de la graine.
   Remarque : Il est important de supprimer manuellement les signaux et les bruits de fond des nerfs voisins.
8. Cochez la case Supprimer les graines points autour de points de départ.
9. Vérifiez supprimer déconnecté segments afin de permettre l’exclusion des points qui sont trop loin et qui peuvent représenter des bruits de fond. Indiquer la Longueur maximale de Gap à l’étape suivante pour définir la limite supérieure de l’exclusion.
10. Ajustez le seuil pour la soustraction de fond, qui utilise un filtre gaussien pour estimer l’intensité de l’arrière-plan de chaque voxel.
11. La valeur seuil automatique pour diamètre de dendrite en utilisant l’algorithme approximatif transversale .
12. Ignorez les étapes pour le calcul de la colonne vertébrale.
13. Terminer le processus et choisissez le style désiré et la couleur.
14. Décochez la case de volume dans les Propriétés pour afficher uniquement les axones reconstituées.
15. Sous l’onglet statistiques , sélectionnez détaillée. Utiliser des filaments de no. Dendrite Terminal Points pour quantifier les terminaisons nerveuses moteur comme indicateur de l’arborisation axone moteur.
    NOTE : Les statistique annotation peut être ajoutée si vous le souhaitez.
16. Exporter l’image de l’axone reconstruit comme un fichier .tif.

Results

LSFM fournit une visualisation 3D détaillée d’arborisation de trajectoire et axon MN chez la souris embryons. Sous champ lumineux, tissus apparaissent complètement transparents après une immersion dans le réactif de compensation commerciale. Aucun retrait ou gonflement de l’échantillon a été remarqué après une semaine de stockage en apurant réactif avant l’imagerie. Sous le canal de la fluorescence, neurones moteurs sont étiquetés avec GFP transgéniquement expresse (film 1

Discussion

Plusieurs étapes dans le protocole peuvent être soumis à des changements dans certaines circonstances. Par exemple, la durée de fixation varie selon l’âge des embryons, variant de 2 h à 1 ou plusieurs jours à l’aide de paraformaldéhyde fraîchement faites. Étant donné que la fixation est effectuée avant toute monture immunomarquage, des anticorps qui sont sensibles aux protéines de réticulation, méthanol peut servir un autre agent fixateur. Pour un rapport signal sur bruit élevé sur la coloration, il est nécessaire d’opti...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hb9 ::GFP	Le laboratoire Jackson	005029	Recueillir les embryons du jour embryonnaire 12.5 (E12.5)
4 % Paraformaldéhyde (PFA)			Pour 200ml : Ajouter 20ml 10X PBS, 8g PFA dans ddH2O. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH (10N). Filtrer, stériliser et conserver à -20 °C.
Tampon phosphate salin 10X (PBS 10X)			Pour 1L : Ajouter 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4 et compléter avec de la ddH2O. Autoclave et magasin chez RT.
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
Sérum de veau fœtal	ThermoFisher	26140079
Mouton polyclonal anti-GFP	AbD Serotec	4745-1051	1:1000
Alexa Fluor 488 âne anti-mouton	Invitrogen	A-11015	1:1000
RapiClear 1.49 réactif nettoyant	SunJin Lab	RC149001
1.5ml micro tube	Sarstedt	72.690.001
24 puits plaque	ThermoFisher	142475
5 SA Pince à épiler	ideal-tek	3480641
Iris Ciseaux striaght sharp/sharp	Aesculap	BC110R
Scalpels de microchirurgie, à usage unique	Aesculap	BA365
Microscope de dissection	Nikon	SMZ800
Shaker	TKS	RS-01
Lightsheet Z.1	microscope Carl Zeiss Microscopie
Imaris 8.4.0 logiciel d’analyse d’images	Bitplane, Zurich, Suisse
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9 ::GFP souris)	The Jackson Laboratory	005029