Method Article

Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière

DOI:

10.3791/57546

⸱

May 11th, 2018

 ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici un protocole pour la visualisation de projection des motoneurones et arborisation axone dans des embryons de souris transgéniques Hb9::GFP . Après immunostaining des neurones moteurs, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence nappe de lumière aux embryons d’image analyse quantitative. Le présent Protocole s’applique à d’autres processus de navigation neurone du système nerveux central.

Abstract

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Les neurones moteurs spinaux (MNs) étendent leurs axones pour communiquer avec leurs cibles innervating, contrôlant ainsi le mouvement et les tâches complexes chez les vertébrés. Ainsi, il est essentiel de découvrir les mécanismes moléculaires de comment moteur axones Placez-vous, arborize et innervent leur musculature périphérique cible pendant le développement et la dégénérescence. Bien que les lignées de souris transgéniques Hb9::GFP ont longtemps servi de visualiser les trajectoires de l’axone moteur durant le développement embryonnaire, des descriptions détaillées de l’ensemble de l’arborisation terminale axon restent incomplets en raison de la complexité du modèle et limitations de la microscopie optique actuelle. Nous décrivons ici un protocole amélioré qui combine la microscopie de fluorescence de nappe de lumière (LSFM) et analyse d’images robuste qualitativement et quantitativement visualiser des axones moteurs de développement. Ce système peut être facilement adopté pour traverser mutants génétiques ou des modèles de maladies MN avec des lignes Hb9::GFP , révélant de nouveaux mécanismes moléculaires qui conduisent à des irrégularités dans la navigation de l’axone moteur et arborisation.

Introduction

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MNs de la colonne vertébrale sont la partie du système nerveux central mais innervent des muscles périphériques pour contrôler le mouvement. Dans la pays en développement de la moelle épinière, progéniteurs MN (PMN) sont établis selon les signaux émanant de la notochorde et des somites adjacents. Toutes différencient MNs post-mitotiques sont ensuite générés à partir de PMN, éventuellement donnant lieu à une série de sous-types de MN le long de l’axe Rostro de la moelle épinière1,2. La colonne vertébrale MNs sont topographiquement et anatomiquement bien organisés. Leur arrangement morphologique est en corrélati....

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Protocol

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Tous les animaux vivants ont été entretenus dans un agent pathogène spécifique gratuit (SPF) animalerie, approuvé et supervisé par IACUC de l’Academia Sinica.

1. la fixation

  1. Recueillir des embryons de jour embryonnaire 12,5 (E12.5) puis décapiter et éviscérer leur.
  2. Difficulté les embryons individuellement en plaques 24 puits avec 1 mL/puits de paraformaldéhyde fraîchement préparée de 4 % en 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS) du jour au lendemain. Incuber à 4 ° C dans un agitateur.
  3. Lavez les embryons fixes au moins 3 x, chacun pendant 5-10 min, avec 1 mL de PBS 1 x et incuber une nuit à 4 ° C dans ....

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Results

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LSFM fournit une visualisation 3D détaillée d’arborisation de trajectoire et axon MN chez la souris embryons. Sous champ lumineux, tissus apparaissent complètement transparents après une immersion dans le réactif de compensation commerciale. Aucun retrait ou gonflement de l’échantillon a été remarqué après une semaine de stockage en apurant réactif avant l’imagerie. Sous le canal de la fluorescence, neurones moteurs sont étiquetés avec GFP transgéniquement expresse (film 1

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Discussion

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Plusieurs étapes dans le protocole peuvent être soumis à des changements dans certaines circonstances. Par exemple, la durée de fixation varie selon l’âge des embryons, variant de 2 h à 1 ou plusieurs jours à l’aide de paraformaldéhyde fraîchement faites. Étant donné que la fixation est effectuée avant toute monture immunomarquage, des anticorps qui sont sensibles aux protéines de réticulation, méthanol peut servir un autre agent fixateur. Pour un rapport signal sur bruit élevé sur la coloration, il est nécessaire d’opti.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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LSFM expériences et analyse des données ont été réalisées en partie en utilisant les microscopes optiques avancés de la Division du Service de l’Instrument à l’Academia Sinica et avec l’aide de Mme Shen Shu-Chen. Nous remercions Mme Sue-Ping Lee de l’Imaging Core Facility de IMB pour une assistance technique considérable avec l’analyse d’image Imaris. Scientifique anglais édition Core les microbilles ont examiné le manuscrit. Ce travail est financé par l’Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), plus (104-2311-B-001-030-MY3) et INDH (INRH-EX106-10315NC).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hb9 ::GFPLe laboratoire Jackson005029Recueillir les embryons du jour embryonnaire 12.5 (E12.5)
4 % Paraformaldéhyde (PFA)Pour 200ml : Ajouter 20ml 10X PBS, 8g PFA dans ddH2O. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH (10N). Filtrer, stériliser et conserver à -20 °C.
Tampon phosphate salin 10X (PBS 10X)Pour 1L : Ajouter 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4 et compléter avec de la ddH2O. Autoclave et magasin chez RT.
Triton X-100SigmaX100-500ML
Sérum de veau fœtalThermoFisher26140079
Mouton polyclonal anti-GFPAbD Serotec4745-10511:1000
Alexa Fluor 488 âne anti-moutonInvitrogenA-110151:1000
RapiClear 1.49 réactif nettoyantSunJin LabRC149001
1.5ml micro tubeSarstedt72.690.001
24 puits plaqueThermoFisher142475
5 SA Pince à épilerideal-tek3480641
Iris Ciseaux striaght sharp/sharpAesculapBC110R
Scalpels de microchirurgie, à usage uniqueAesculapBA365
Microscope de dissectionNikonSMZ800
ShakerTKSRS-01
Lightsheet Z.1microscope Carl Zeiss Microscopie
Imaris 8.4.0 logiciel d’analyse d’imagesBitplane, Zurich, Suisse
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9 ::GFP souris)The Jackson Laboratory005029

References

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  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M.

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