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Article de méthode

Adéno-associés de livraison induite par le Virus de CRISPR gène cardiaque édition chez la souris

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DOI :

10.3791/57560

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2 août 2018

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1Department of Surgery, Davis Heart and Lung Research Institute, Biomedical Sciences Graduate Program, Biophysics Graduate Program, Ohio State University Wexner Medical Center

Dans cet article

Résumé

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour réaliser en vivo gène cardiaque édition chez la souris à l’aide de Virus recombinant de Adeno-Associated (rAAV)-mediated livraison de CRISPR. Ce protocole propose une stratégie thérapeutique prometteuse pour traiter la cardiomyopathie dystrophique dans la dystrophie musculaire de Duchenne et peut être utilisé pour générer des knockout spécifique cardiaque chez les souris après la naissance.

Résumé

Le système (CRISPR) répéter en cluster, régulièrement dois‑je, court palindrome a grandement facilité le génie du génome dans les cellules cultivées et les organismes vivants d’une grande variété d’espèces. La technologie CRISPR a aussi été utilisée comme thérapeutiques novatrices pour un certain nombre de maladies humaines. Validation des données sont très encourageantes, comme exemplifié par des études récentes qui démontrent la faisabilité et l’efficacité du gène modification thérapeutique approche pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) à l’aide d’un modèle murin. En particulier, injection intraveineuse et intrapéritonéale de la rh.74 de sérotype recombinant virus adeno-associé (rAAV) (rAAVrh.74) a permis une prestation cardiaque efficace des Staphylococcus aureus protéine associée à la CRISPR 9 (SaCas9) et deux Guide de RNAs (gRNA) pour supprimer une région génomique avec un codon mutant dans l’exon 23 du gène Dmd de souris. La même approche peut également servir d’assommer le gène d’intérêt et d’étudier leur fonction cardiaque chez les souris après la naissance lorsque le gRNA est conçu pour cibler la région codante du gène. Dans ce protocole, nous montrent en détail comment l’ingénieur vecteur rAAVrh.74-CRISPR et l’accouchement cardiaque très efficace chez les souris néonatales.

Introduction

La cluster, dois‑je régulièrement et brève palindromique répéter (CRISPR) technologie représente la plus récente avancée dans l’ingénierie du génome et a révolutionné la pratique actuelle de la génétique dans les cellules et des organismes. Axée sur les CRISPR génome édition utilise un seul guide RNA (gRNA) pour diriger une endonucléase CRISPR associés tels que les protéines associées aux CRISPR 9 (Cas9) et Cpf1 à une cible d’ADN génomique complémentaire dans l’ordre à le protospacer codée par le gRNA avec un protospacer spécifiques motif adjacent (PAM)1,2. La PAM varie en fonction de l’espèce bactérienne du gène Cas9 ou Cpf1. La nucléase Cas9 plus couramment utilisée, dérivée de Streptococcus pyogenes (SpCas9) reconnaît une séquence de PAM de NGG qui se trouve directement en aval de la séquence cible dans l’ADN génomique, sur le brin non ciblés. Sur le site de la cible, les protéines Cas9 et Cpf1 de générer une interruption de double-brin (DSB), qui est alors réparée via intrinsèques mécanismes de réparation ADN cellulaires y compris la fin non homologue rejoindre (NHEJ) et axés sur l’homologie réparation (HDR) voies3, 4. En l’absence d’une matrice d’ADN de recombinaison homologue, l’ORD est principalement réparé par la voie NHEJ erreurs, ce qui peut entraîner dans les insertions ou les suppressions (indels) des nucléotides, causant des mutations de déphasage si l’ORD ont été créé dans le codage région d’un gène5,6. Ainsi, le système CRISPR a été employé couramment à l’ingénieur mutations perte de fonction différents modèles cellulaires et des organismes entiers, afin d’étudier la fonction d’un gène. En outre, le catalytiquement inactif Cas9 et Cpf1 ont été développés pour transcription et épigénétiquement modulent l’expression des gènes de cible7,8.

Plus récemment, les SpCas9 et les SaCas9 (dérivé de Staphylococcus aureus) ont été emballés dans des vecteurs recombinants virus adeno-associé (rAAV) pour la correction de gène postnatal dans les modèles animaux de maladies humaines, en particulier, de Duchenne musculaire de Duchenne (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD est une maladie récessive liée à le X mortelle causée par des mutations dans le gène DMD , qui encode la dystrophine protéine16,17, affectant environ un dans 3500 naissances de garçons selon dépistage néonatal18 , 19. il est caractérisé par une faiblesse musculaire progressive et gaspiller. Les patients DMD perdent généralement la capacité de marcher entre 10 et 12 ans et meurent d’insuffisance respiratoire et/ou cardiaque à l’âge de 20-30 ans20. Notamment, la cardiomyopathie se développe à > 90 % des patients DMD et représente la principale cause de décès chez les patients DMD21,22. Bien que déflazacort (un médicament anti-inflammatoire) et Eteplirsen (un exon skipping médecine pour ignorer l’exon 51) ont récemment été approuvés pour DMD par la Food and Drug Administration (FDA)23,24, aucun de ces traitements corriger l’anomalie génétique dans l’ADN génomique. La souris mdx, qui porte une mutation ponctuelle au exon 23 du gène de la dystrophine, a été largement utilisée comme un modèle DMD25. En outre, nous avons démontré précédemment que l’expression de la dystrophine fonctionnelle a été restaurée par la suppression dans le cadre de l’ADN génomique couvrant les exons, 21, 22 et 23 dans les muscles squelettiques des souris mdx à l’aide d’intramusculaire Ad-SpCas9/gRNA livraison9 et dans les muscles du cœur de mdx/utrophine+/- souris à l’aide de livraison de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA par voie intraveineuse et intrapéritonéale26.

Dans ce protocole, nous décrivons en détail toutes les étapes dans l’édition de gène cardiaque postnatale pour restaurer la dystrophine dans mdx/utrophine+/- souris à l’aide de vecteurs de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, de gRNA conception à l’analyse de la dystrophine dans les sections de muscle de coeur.

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Protocole

Les animaux utilisés dans le présent protocole sont gardés à l’Ohio State University laboratoire Animal ressources conformément aux directives d’utilisation des animaux. Toutes les études animales ont été autorisés par l’animalier institutionnel, utilisation et Comité d’examen de l’Ohio State University.

1. conception et clonage de gRNAs dans le vecteur CRISPR

  1. Sélectionnez 2 gRNAs ciblant la dystrophine intron 20 et intron 23 (i20 et i23) pour SaCas9 : i20 : 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT et i23 : 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (la séquence de PAM est soulignée et en italiques).
    Remarque : Les sites cibles pour i20 et i23 sont environ 23 kilo paires de bases (KPB) loin. Pour perturber un gène codant, deux gRNAs ciblant les exons communs avec le PAM NNGRRT séquence de SaCas9 (préférence NNGAAT, NNGGGT et NNGAGT) et distance au sein de 20 kbp sont recommandés.
  2. Utilisez les paramètres suivants de la PCR de recuire les oligos gRNA (100 µmol/L) 1 x tampon de recuit (5 x recuit stock tampon contient 0,5 mol/L K-acétate, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acétate, pH7.4) : 95 ° C 10 min, 90 cycles 95 à 59 ° C avec un 0,4 ° C diminue par cycle de 20 s, 90 cycles de 59 à 32 ° C avec une diminution de 0,3 ° C par cycle pendant 20 s, 20 cycles de 32 à 26 ° C, avec une diminution de 0,3 ° C par cycle pendant 20 s.
  3. Ligaturer les oligos gRNA recuit dans le pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA à l’aide de BsaI et T4 DNA ligase dans une réaction (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA 1 µL recuit oligos, 1,5 µL 10 x T4 DNA ligase tampon, 0,5 µL T4 DNA ligase, 1 µL BsaI, 10 µL ddH2O ), par la condition suivante de réaction dans un cycler PCR : 5 cycles de 37 ° C 5 min et 16 ° C 10 min ; 37 ° C 20 min ; 80 ° C 5 min.
  4. Transformer le produit de la ligature 15 µL de 30 cellules compétentes µL, plaque de cellules dans la gélose avec 100 µg/mL d’ampicilline et la culture à 37 ° C pendant 24 h.
  5. Ramasser des colonies et de la culture dans un milieu LB contenant 100 µg/mL ampicilline à 37 ° C, 250 tr/min dans un incubateur shaker pendant 3-4 h 5-10.
  6. Les colonies par PCR de l’écran : 10 µL 2 x mélange maître PCR, 8 µL ddH2O, culture d’e. Coli 1 µL, 1 µL 10 µmol/L U6-forward amorce, 1 µL i20 ou i23 gRNA inverse primaire. Les paramètres de cycle de PCR : 95 ° C 5 min, 35 cycles de 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30.
  7. Préparer 5 mL culture des clones positifs par ajouter 4 mL frais LB containing100 moyenne µg/mL ampicilline et culture pendant une nuit à 37 ° C, 250 tr/min.
  8. Purifier l’ADN en utilisant le kit d’extraction de plasmide approprié de plasmide et vérifiez le plasmide par Sanger sequencing avec l’amorce de U6-vers l’avant.
  9. La culture de cellules C2C12 DMEM additionné de 10 % de SVF et 1 % Pen-Strep jusqu'à confluence d’environ 70 % pour le test du gène édition efficacité des plasmides.
  10. Electroporate un total de 5 µg SaCas9/gRNA mélange de plasmide dans le rapport molaire de 1:1 dans les cellules de 1 x 106 C2C12 selon le protocole du fabricant.
  11. Après la transfection après 48 h, récolter les cellules C2C12 et extraire l’ADN génomique.
  12. Utilisez 100 ng ADN génomique en tant que modèle pour effectuer la réaction de PCR pour locus dystrophine souris : apprêt 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA en avant (1 µL 10 µmol/L), inverser l’apprêt 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL 10 µmol/L), 10 µL 2 x la PCR vert master mix, 7 ddH2O µL, 1 µL () ADN génomique 100 ng). Utilisent la PCR cyclisme conditions que 95 ° C 5 min, 35 cycles de 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s (72 ° C 30 s) et 72 ° C 2 min.

2. le rAAV Production

  1. À la pour culture des cellules, cellules de AD293 sur 20 à 40 de 15 cm plats de graines et maintenir en DMEM additionné de 10 % de SVF et 1 % Pen-Strep jusqu'à confluence de ~ 90 % pour la transfection.
  2. Diluer 3 plasmides avec 200 µL réduit moyen de sérum (par plat) : 1) 10 µg pHelper ; pXR 2) 5 µg (rh.74 ou autres sérotypes) et 3) un total de 5 µg de mélange pX601-i20 et pX601-i23 (ratio 1:1). Effectuer la transfection polyéthylènimine (PEI) en mélangeant avec 80 µL PEI et incuber à température ambiante pendant 10 min. ajouter le mélange sur les cultures de cellules de AD293 d’une manière goutte à goutte.
  3. Pour la production de virus AAV, après transfection de 72 h de post, utilisez un grattoir de cellules de recueillir aussi bien les médias et les boulettes de cellule AD293 par centrifugation à 1100 x g pendant 10 minutes.
  4. Remettre en suspension les granules cellulaires dans le tampon de lyse rAAV 15 mL (50 mmol/L Base Tris, 150 mmol/L de NaCl, pH 8,5) suivies de 3 cycles de gel-dégel avec une alternance d’incubation dans l’azote liquide et un bain d’eau de 42 ° C. Stocker les lysats cellulaires à-80 ° C pour le futur traitement si elles ne sont pas traités immédiatement.
  5. Les milieux de culture du filtre avec un filtre de 0,45 µm et ajoutez un 40 % PEG8000 2,5 mol/L de NaCl à une concentration finale de 8 %. Incuber le mélange à 4 ° C pendant 1 h et centrifuger à 1100 x g pendant 15 min.
  6. Remettre en suspension les boulettes dans le tampon de lyse rAAV et combiner avec des lysats de cellules de l’étape 2.3, suivie par un traitement benzonase (50 U/mL) à 37 ° C pendant 1 h.
  7. Centrifuger le rAAV imprégnées de benzonase contenant le mélange 1100 x g pendant 15 min à 4 ° C, puis enregistrez le surnageant (le rAAV brut préparation).

3. rAAV, Purification et Concentration

  1. Charger la préparation rAAV brut sur un gradient d’iodixanol dans un tube ultracentrifugeuse dans l’ordre suivant du haut vers le bas : brut AAV lysat (environ 15 mL), 8 mL 15 % Iodixanol, 6 mL 25 % Iodixanol, 5 mL 40 % Iodixanol, 5 mL 58 % Iodixanol. Remplissez le volume restant vide du tube vers le haut à l’aide de 1 x DPBS.
  2. Centrifuger les échantillons à 230 000 x g dans un rotor ultracentrifugeuse pendant 120 min à 10 ° C et recueillir 3-4 mL de la fraction de 40 % dégradé contenant les particules rAAV avec une aiguille 18 G.
  3. Diluer les particules rAAV avec 1 x DPBS et centrifuger à l’aide de l’unité de filtration centrifuge (MWCO 100 kDa). Répétez cette étape pour les 3 - 5 fois et enfin se concentrer à la préparation du rAAV à 300-500 µL.

4. le rAAV titrage

  1. Extraire l’ADN génomique de 2 µL concentré rAAV, précipitée avec 3 M NaOAc dans l’éthanol et remettre dans 20 µL ddH2O.
  2. Obtenir la courbe d’étalonnage rAAV quantification par dilution en série du plasmide pX601 : 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 copies dans chaque 10 µL ddH2O. diluer le rAAV imprégnées d’insecticide DNAase échantillons en 01:10, 01:50, 1/100 et 1/1000.
  3. Définir son titre rAAV par PCR en temps réel quantitative (qPCR) à l’aide de qPCR Kit selon les instructions du fabricant dans un système de PCR en temps réel : 1 µL 10 µmol/L de chaque amorce (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC et 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL 2 x mélange maître PCR, 1 µL dilué rAAV échantillons et 2 µL ddH2O. exécutent la réaction avec les paramètres suivants : 95 ° C 3 mn, 45 cycles [95 ° C 5 sec et 61 ° C 20 sec].

5. par voie intraveineuse et une Injection intrapéritonéale de rAAVrh.74-CRISPR en néonatal mdx/utrophine+/- souris

  1. Immobilisez les mdx/utrophine+/- souriceaux (jour 3) en plaçant sur la glace pendant 1 min et ensuite administrer avec 1 x 1012 particules virales dans 50 µL par souris systémique via une approche rétro-orbitaire ou une injection intrapéritonéale.
  2. Laissez les souris récupérer et les remettre dans leurs cages maison. A dix semaines après l’administration du rAAV, euthanasier les souris par une exposition au CO2 pour prélèvement tissulaire.
  3. Clin d’oeil-gel tissus pour extraction de l’ADN et l’ARN génomiques et utilisation refroidissement isopentane dans l’azote liquide pour geler les tissus avec la température de coupe optimale pour cryosectioning.

6. l’analyse du gène cible, édition des résultats

  1. Analyse PCR de l’ADN génomique
    1. Isoler l’ADN génomique des tissus cardiaques du mdx/utrophine+/- de souris traitée avec ou sans rAAV au total.
    2. Utilisent le même protocole en étape 1.12 pour analyse par PCR.
  2. Analyse de RT-PCR de l’expression de la dystrophine
    1. Extraire l’ARN total des tissus cardiaques avec le kit d’extraction d’ARN après le manuel du constructeur.
    2. Pour effectuer la transcription inverse, pré-traiter l’ARN total avec une DNase RNase-libre et utiliser 5 µg d’ARN traitée comme modèle pour la synthèse de cDNA de premier-brin avec le kit de transcription inverse.
    3. Utiliser le produit de la transcription inverse pour analyse de RT-PCR de l’expression de la dystrophine avec les amorces de cDNA de dystrophine : 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT et 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
  3. Estimer le gène retouche d’efficacité en analyse qPCR
    1. Estimer le gène édition efficacité par RT-PCR quantitative pour détecter la réduction de l’exon contenant 22 relevés de notes à l’aide de l’apprêt avant (exon 21) : 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA et l’amorce de marche arrière (exon 23) : 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Utilisez Gapdh comme un gène de référence avec l’amorce vers l’avant : 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC et l’amorce de marche arrière : 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
    2. Exécutez la PCR quantitative en temps réel (qPCR) en utilisant le qPCR Kit selon les instructions du fabricant dans un système de PCR en temps réel et les conditions de la réaction de 2 étapes : 95 ° C 3 mn, 45 cycles de 95 ° C 5 sec et 61 ° C 30 sec.
  4. Immunofluorescence souillant pour analyser l’expression de la dystrophine
    1. Couper les tissus congelés, à l’aide d’un cryostat à une épaisseur de 10 µm. Fix les coupes congelées avec 4 % de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 15 min.
    2. Laver 2 fois avec du PBS et incuber avec bloquant la solution (10 % de sérum de cheval) pendant 1 h.
    3. Incuber l’anticorps primaire anti-dystrophine, à 4 ° C durant la nuit.
    4. Laver les lames avec PBS 3 x 5 min et incuber avec anticorps secondaires fluorescents (1/500) à température ambiante pendant 1 h.
    5. Monter les diapositives à l’aide du milieu de montage au DAPI et d’imagerie avec un microscope confocal inversé.

7. hors-cible analyse par dosage T7E1

  1. Prédire les sites potentiels de hors-cible à l’aide de la CRISPR en ligne des outils de conception tels que < http://crispr.mit.edu>.
  2. Amplifier les régions génomiques recouvrir la partie supérieure de 5 à 10 sites potentiels de hors-cible par PCR : genomic DNA 200 ng, 1 µL haute-fidélité ADN polymérase, mélange de PCR tampon 5 µL 10 x 1,5 µL 10 µmol/L de propres amorces avant et arrière, réglage du volume total à 50 µL avec ddH2O.
  3. Exécuter les produits PCR par électrophorèse, extraire et purifier l’ADN en utilisant un gel extraction kit. Mesurer la concentration de spectrophotomètres.
  4. Promouvoir la formation hétéroduplex par dénaturation et re-recuit les amplicons purifiées lentement dans le 2.1 de tampon à l’aide d’un cycler PCR. Utilisez les mêmes conditions de cyclisme comme il est indiqué à l’étape 1.2.
  5. Digérer les produits re-recuits pendant 30 min à 37 ° C avec de l’enzyme de T7E1 0,5 µL et d’analyser la réaction par électrophorèse de gel d’agarose à 1-2 %.
    Remarque : Les amplicons peuvent également être analysés par séquençage ciblé en profondeur.

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Résultats

L’efficacité de la gRNAs pour induire la suppression de la région de l’ADN génomique cible doit être évaluée dans des cultures cellulaires avant l’emballage dans le rAAV pour études in vivo. À cette fin, le gRNAs et les constructions exprimant le SaCas9 étaient électroporation C2C12 cellules et l’ADN génomique a été analysée par PCR avec des amorces bordant les sites cibles (Figure 1). Un produit PCR de ~ 500 bp indique la suppression réussie de l’ADN génomiq...

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Discussion

Dans ce protocole, nous détaillons toutes les étapes nécessaires à la réalisation en vivo gène cardiaque édition chez les souris post-natal utilisant livraison induite par le rAAVrh.74 de SaCas9 et deux gRNAs. Comme mentionné plus haut, cette approche peut être utilisée pour restaurer l’expression de la dystrophine dans les souris dystrophiques tel que décrit dans notre travail27, mais il pourrait aussi permettre des études de génétique inverse rapide des gènes cardiaques chez des souris ...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêt n’existe.

Remerciements

R.H. est pris en charge par le U.S. National Institutes of subventions de santé (R01HL116546 et AR064241 R01).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alexa Fluor 555 chèvre anti-lapin IgGThermo Fisher ScientificA-21428
Benzonase NucléaseSigma-AldrichE1014
Bio Safety CabinetsThermo Fisher Scientific13471300 Series A2 Classe II, Type A2
BsaINew England BioLabs IncRO535S
Cellules compétentesAgilent Technologies
Boîtes de culture cellulaire, 150mmNest Scientific USA715001
CryostatLeica BiosystemsLeica CM3050S
DMEMThermo Fisher ScientificMT10017CVCorning cellgro
Dystrophineanticorps Spring BioscienceE2660
Fast-Ion Midi Plasmdi KitsIBIScientific IB47111
FBSThermo Fisher Scientific26-140-079
Unité de filtration, 0,45&mu ; mThermo Fisher Scientific166-0045
GoTaq Master MixesPromegaM7122
Mini kit plasmide à grande vitesseIBI ScientificIB47102
Sérum de chevalAbcamab139501
Isotemp 2239 Bain-marieThermo Fisher Scientific15-460-11Q
Isotemp Heat BlockThermo Fisher Scientific11-718
Microscope confocal inverséCarl Zeiss Microscopy, LLCLSM 780
LightCycler 480 instrumentRoche5015243001LightCycler 480 Instrument II
Centrifugeuse grande capacitéThermo Fisher Scientific46-910Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
MicrocentrifugeuseThermo Fisher Scientific75002445Spectrophotomètres Sorvall Legend Micro 21R
Nanodrop Thermo ScientificND2000CLAPTOPNanoDrop&trade ; 2000/2000c
Oligos pour i20-F IntegratedDNA TechnologiesCACCgGGCGT
TGAAATTCTCATTAC
Oligos pour i20-RIntegrated DNA TechnologiesAAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc ;
Oligos pour i23-FIntegrated DNA TechnologiesCACCgCACCGATGAGAGGG
AAAGGTC
Oligos pour i23-RDNA TechnologiesGACCTTTCCCTCTCATCGGTGc
OligosIntegrated DNA Technologies
OptiPrep Density Gradient MediumSigma-AldrichD1556-250ML
OptiMEMThermo Fisher Scientific
PEG8000Sigma-Aldrich89510-1kg-F
PolyéthyléniminePolysciences23966
Protéinase KSigma-AldrichP2308
Tube centrifuge Quick-SealBeckman Coulter Inc342414
QIAquick Kit d’extraction de gelQiagen28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR KitsAlkali ScientificQS2005
RevertAid RT Reverse Transcription KitThermo Fisher ScientificK1691
RotorBeckman Coulter Inc337922Type 70Ti
T4 DNA ligaseNew England BioLabs IncM0202S
ThermocycleurBio-rad1861096
TRIzol RéactifThermo Fisher Scientific15596026
UltracentrifugeuseBeckman Coulter Inc8043-30-1192Optima le-80k
MilliporeSigmaUFC510096
VECTASHIELD Milieu de montage avec DAPIVector Laboratories, IncH-1200
200314 Integrated 31985070 Unité de filtration ultracentrifuge

Références

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