Explorant le Microbiome racine : extraire les données de la communauté bactérienne du sol, rhizosphère et racine endosphère

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour obtenir des données de séquence amplicon du sol, la rhizosphère et racine endosphère microbiomes. Cette information peut être utilisée pour étudier la composition et la diversité des communautés microbiennes associées aux plantes et est adaptée pour l’utilisation avec un large éventail d’espèces végétales.

Résumé

L’interaction intime entre la plante hôte et les microorganismes associés est cruciale dans la détermination de remise en forme de plante et peut favoriser l’amélioration de la tolérance aux stress abiotiques et aux maladies. Le microbiome usine peut être très complexes et à faible coût, haut débit méthodes telles que l’amplicon basée sur le séquençage du gène de l’ARNr 16 s sont souvent préférées pour caractériser sa composition microbienne et sa diversité. Toutefois, le choix d’une méthodologie appropriée lorsqu’il procède à de telles expériences est essentiel pour réduire les préjugés qui peuvent compliquer l’analyse et des comparaisons entre les études et les échantillons. Ce protocole décrit en détail une méthode normalisée pour la collecte et l’extraction de l’ADN d’échantillons de sol, rhizosphère et racine. En outre, nous mettre en évidence un pipeline bien établi 16 s rRNA amplicon séquençage qui permet l’exploration de la composition des communautés bactériennes dans ces échantillons et peut facilement être adaptées pour d’autres gènes marqueurs. Ce gazoduc a été validé pour une variété d’espèces de plantes, y compris le sorgho, le maïs, blé, fraise et agave et peut aider à surmonter les problèmes associés à la contamination des organelles de la plante.

Introduction

Associées aux plantes microbiomes se composent des communautés microbiennes dynamiques et complexes, composées de bactéries, archées, virus, champignons et autres micro-organismes eucaryotes. Outre leur rôle bien étudié en provoquant des maladies des plantes, associées aux plantes microbes peuvent également influencera phytosanitaire en améliorer la tolérance aux stress biotiques et abiotiques, promouvoir la disponibilité des nutriments et l’amélioration de la croissance des plantes par le biais la production des phytohormones. Pour cette raison, un intérêt particulier existe pour caractériser les taxons qui associent à la plante racine endosphères, rhizosphères et le....

Protocole

1. collecte et séparation des racines endosphère, la rhizosphère et des échantillons de sol

1. Avant d’entrer dans le champ, l’eau ultrapure (au moins 90 mL d’eau par exemple) autoclave pour stériliser. Préparer, tampon de retrait épiphyte (au moins 25 mL par exemple) en ajoutant 6,75 g de KH₂PO₄, 8,75 g K₂HPO₄et 1 mL de Triton X-100, à 1 L d’eau stérile. Stériliser le tampon à l’aide d’un filtre à vide avec 0.2 µm taille de pores.
   1. Pour les étapes 1,2 à 1,5, porter des gants propres stérilisés avec de l’éthanol à toutes les fois et remplacer les gants entre chaque échantillon pour prévenir la contamination. St....

Résultats

Exécutant le protocole recommandé devrait se traduire par un ensemble de données indexées lectures jumelé-fin qui peut être assorti à chaque échantillon et assignés à une ou l’autre bactérienne des unités taxonomiques opérationnelles (UTO) ou une séquence exacte variante (ESV, également dénommé amplicon variante de séquence (ASV) et sub-operational unité taxonomique (sOTU)), selon l’analyse en aval. Afin d’obtenir des données sur les séquences de haute qualité, il faut à chaque étape pour.......

Discussion

Ce protocole montre un pipeline établi pour explorer la racine endosphère, la rhizosphère et compositions de communauté microbienne du sol, de l’échantillonnage sur le terrain pour le traitement des échantillons et le séquençage en aval. Experimentation microbiomes associés à racine présente des difficultés particulières, dû en partie aux difficultés inhérentes à l’échantillonnage du sol. Les sols sont très variables en fonction des propriétés physiques et chimiques, et les différentes conditions du sol peuvent être sépa.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,1 à 10/20 et micro ; L pointes de micropipette filtrées	USA Scientific	1120-3810	Peut remplacer par un équivalent d’autres fournisseurs.
Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml	USA Scientific	1615-5510	Peut être remplacé par un équivalent d’autres fournisseurs.
10 et micro ; L Pipette multicanaux	Eppendorf	3122000027	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
10 et micro ; L, 100 et micro ; L, et 1000 µ ; L micropipettes	Eppendorf	3120000909	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
100 et micro ; L Pipette multicanaux	Eppendorf	3122000043	Peut remplacer par un équivalent d’autres fournisseurs.
1000 et micro ; L pointes de micropipette filtrées	USA Scientific	1122-1830	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Tubes de microcentrifugation de 2 mL	USA Scientific	1620-2700	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Tamis de sol de 2 mm	Fournisseurs forestiers	60141009	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
200 et micro ; L pointes de micropipette filtrées	USA Scientific	1120-8810	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Réservoirs de 25 mL	VWR International LLC	89094-664	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Fioles coniques de 50 mL	Thermo Fisher Scientific	352098	peut être remplacée par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Filtres à vide de 500 ml (0,2 & micro ; taille des pores)	VWR International LLC	156-4020
Microplaques à 96 puits	USA Scientific	655900
Plaques PCR à 96 puits	BioRad	HSP9631
Agencourt AMPure XP billes	Thermo Fisher Scientific	NC9933872	Mode d’emploi : https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf
Feuille d’aluminium	Boardwalk	7124	Peut être remplacée par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Balance analytique avec une résolution de 0,001 g	Ohaus Pioneer	PA323	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Échosoniseur Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001
Albumine sérique bovine (BSA) 20 mg/mL	Centrifugeuse New England Biolabs	B9000S
	Eppendorf	5811000908	Y compris 50 ml et 96 puits Adaptateurs de seau à plaques de 50 ml et 96 puits
Gants cryogéniques	Millipore Sigma	Z183490	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Kit DNeasy PowerClean (en option)	Qiagen Inc.	12877-50	Anciennement MoBio
DNeasy PowerSoil kit	Qiagen Inc.	12888-100	Précédemment MoBio
Glace carbonique	Tout	NA
DynaMag-2	Thermo Fisher Scientific	12321D	Ne pas substituer
l’éthanol	VWR International LLC	89125-188	Peut remplacer par un équivalent d’autres fournisseurs.
Sacs de congélation de la taille d’un gallon	Ziploc	NA	Peut être remplacé par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Gemini EM Lecteur de microplaques	Dispositifs moléculaires	EM	Peut utiliser un autre fluorimètre qui lit les plaques à 96 puits par le haut.
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Blouse de laboratoire	Workrite	J1367	Peut être remplacée par un équivalent d’autres fournisseurs.
Liquide N2	Tout	NA	Peut être remplacé par un équivalent d’autres fournisseurs.
Liquide N2 dewar	Thermo Fisher Scientific	4150-9000	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Système de purification d’eau ultra-pure Milli-Q	Millipore Sigma	SYNS0R0WW
Mini-centrifugeuse	Eppendorf	5404000014
Eau de qualité moléculaire	Thermo Fisher Scientific	4387937	Peut être remplacée par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Mortiers	VWR International LLC	89038-150	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Gants en nitrile	Thermo Fisher Scientific	19167032B	Peut être remplacé par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Essuie-tout	VWR International LLC	BWK6212	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Film d’étanchéité de plaque PCR	Thermo Fisher Scientific	NC9684493
Tubes de bande PCR	USA Scientific	1402-2700
Pilons	VWR International LLC	89038-166	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Spatules en plastique	LevGo, Inc.	17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)	Thermo Fisher Scientific	13000014
PNAs - chloroplaste et mitochondriale	PNA Bio	NA	Assurez-vous de vérifier la séquence bioinformatique
Lunettes de protection	Millipore Sigma	Z759015	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Fluorimètre Qubit 3.0	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Kit de dosage Qubit dsDNA HS	Thermo Fisher Scientific	Q32854
Maillet en caoutchouc (en option)	Ace Hardware	2258622	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Cisailles ou ciseaux	VWR International LLC	89259-936	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Pelle	Home Depot	2597400	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Collecteur de carottes de sol (petit diamètre : < 1 pouce)	Ben Meadows	221700	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Flacons pulvérisateurs	Santa Cruz Biotechnology	sc-395278	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Amorces standard dessalées à code-barres (10 & micro ; M) (Tableau 1)	IDT	NA	4 nmole Ultramer DNA Oligo avec dessalage standard. L’adaptateur NGS et l’amorce de séquençage (Tableau 1) sont conçus pour être utilisés avec Illumina MiSeq en utilisant la chimie v3.
Thermocycleur	Thermo Fisher Scientific	E950040015	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.
Peser les bateaux	Spectrum Chemicals	B6001W	Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.