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Article de méthode

Traitement intracerebroventriculaire avec resiniferatoxine et tests de douleur chez les souris

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⸱

DOI :

10.3791/57570

⸱

2 septembre 2020

 ,  , 
1Laboratory of Clinical Pharmacy and Pharmacology, Musashino University, 2Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Musashino University

Dans cet article

Résumé

Le récepteur transitoire potentiel de type 1 (TRPV1) dans la région supraspinale a été suggéré pour jouer certains rôles dans la fonction cérébrale. Décrit ici est un protocole pour l’injection intracerebroventriculaire de resiniferatoxin pour la désensibilisation supraspinale TRPV1 chez les souris. Des procédures pour certains tests de douleur sont également présentées.

Résumé

Le récepteur transitoire potentiel vanilloid type 1 (TRPV1), un canal thermosensible de cation, est connu pour déclencher la douleur dans les nerfs périphériques. En plus de sa fonction périphérique, sa participation aux fonctions cérébrales a également été suggérée. La resiniferatoxine (RTX), un agoniste ultrapotent TRPV1, a été connue pour induire la désensibilisation à long terme de TRPV1, et cette désensibilisation a été une approche alternative pour étudier la pertinence physiologique des cellules exprimant TRPV1. Ici, nous décrivons un protocole pour le traitement intracerebroventriculaire (c.c.v.) avec RTX chez les souris. Les procédures sont décrites pour tester la nociception à la stimulation périphérique TRPV1 (essai RTX) et la stimulation mécanique (test de pression de la queue) puis suivent. Bien que les réponses nociceptives des souris qui avaient été administrées RTX i.c.v. étaient comparables à celles des groupes témoins, les souris administrées par RTX-i.c.v.étaient insensibles à l’effet analgésique de l’acétaminophène, ce qui suggère que le traitement i.c.v. RTX peut induire une désensibilisation supraspinal-sélective TRPV1. Ce modèle de souris peut être utilisé comme un système expérimental pratique pour étudier le rôle de TRPV1 dans la fonction cérébrale/supraspinale. Ces techniques peuvent également être appliquées à des études des actions centrales d’autres médicaments.

Introduction

Les animaux reçoivent divers stimuli physiques et chimiques de leur environnement grâce à des capteurs sur les nerfs périphériques. Le récepteur transitoire potentiel vanilloid type 1 (TRPV1) est l’un des canaux thermosensibles, non sélectifs cation qui agissent comme capteurs de chaleur1,2, et l’activation et / ou la modulation de TRPV1 est connu pour être une étape clé pour la nociception dans les contextes normaux et inflammatoires3. Bien que le modèle d’expression globale soit controversé, l’expression de TRPV1 a également été suggérée dans les régions supraspinales, étant impliquée dans diverses activités de cerveau (y compris nociception4, thermorégulation5, anxiété6, trouble d’hyperactivité de déficit d’attention7, et épilepsie8). En outre, il a été récemment suggéré que l’acétaminophène, un analgésique largement utilisé, sert de médiateur à l’activation du TRPV1 central pour obtenir son action analgésique9,10.

L’administration d’un agoniste trpv1 excédentaire, y compris la capsaïcine et la résine (RTX) aux animaux conduit à la mort de neurones TRPV1 positifs et à une désensibilisation durable aux agonistesTRPV1 11,12. Combinée à l’application locale (intrathécal13,14, intracisternale15,16,17, et intraganglional18), cette approche d’ablation chimique a fourni une autre façon d’étudier les fonctions physiologiques de TRPV1. Nous avons récemment signalé que l’injection intracerebroventriculaire (c.c.v.) de RTX inhibe l’effet analgésique de l’acétaminophène chez les souris, suggérant la désensibilisation supraspinal-sélective trpv119. Dans ce manuscrit, nous présentons le protocole précis pour l’injection i.c.v. et les tests de douleur subséquents.

L’injection directe de médicaments dans les ventricules du cerveau permet d’étudier leurs effets centraux tout en minimisant les effets périphériques. La procédure d’injection i.c.v. présentée ici est une modification de la méthode rapportée par Haley et McCormick20. Cette méthode est simple impliquant l’insertion d’une aiguille d’injection dans les ventricules latéraux par la suture coronale et ne nécessite aucun équipement spécial ou des procédures chirurgicales pour la cannulation.

L’application locale périphérique des agonistes trpv1 évoque une sensation de douleur brûlante et une inflammation neurogénique. Les souris qui sont traitées systématiquement avec RTX, et les souris TRPV1-KO, sont insensibles à cette stimulation13. Nous avons effectué l’injection intraplantaire de RTX (test RTX) pour confirmer la préservation du TRPV1 périphérique dans RTX-i.c.v. Souris. Cette méthode est une modification du test de formaline classique21.

Il a été rapporté que les souris traitées systématiquement avec des souris RTX et TRPV1-KO montrent un seuil normal pour les stimuli mécaniques11,13,22. Ici, nous présentons une procédure pour le test de pression de la queue pour tester les changements dans l’effet analgésique de l’acétaminophène.

Toutes ces procédures sont orthodoxes et polyvalentes, et peuvent être appliquées à des études d’autres médicaments.

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Protocole

Tous les protocoles expérimentaux utilisés ici ont été approuvés par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Université de Musashino. Les souris mâles ddY (SLC, Shizuoka, Japon) ont été conservées pendant au moins 7 jours dans le cadre d’un cycle de 12 h de lumière/obscurité avant d’avoir des expériences avec de l’eau et des aliments ad libitum. Des souris de 5 ou 6 semaines ont été utilisées pour les expériences.

1. Préparation de médicaments

  1. Rtx
    REMARQUE : La solution RTX alcoolique peut causer de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires. Assurez-vous d’utiliser des gants et des lunettes en caoutchouc pour vous protéger lors de la manipulation. Cette solution stock peut être utilisée pendant 6 mois.
    1. Ajouter 500 μL d’éthanol à 1 mg de RTX.
    2. Ajouter 500 μL de polyoxyéthylène (20) monooléate sorbitan à la solution ci-dessus et vortex bien.
    3. Ajouter 4 mL de solution saline physiologique au mélange et bien vortex.
    4. Aliquot 40 μL de la solution dans des tubes à vis de 1,5 m L et les stocker à -40 °C.
  2. Acétaminophène
    1. Ajouter une solution propylèneglycol de 20 % w/v à l’acétaminophène à une concentration de 30 mg/mL, et dissoudre avec un sonicateur. Puisque l’acétaminophène peut se précipiter à température ambiante plusieurs heures après la dissolution, préparer juste avant l’utilisation ou garder la solution au chaud jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.

2. Injection sous-cutanée ou intracerebroventriculaire de RTX

  1. Décongeler la solution en stock préparée en 1.1. ci-dessus et le diluer à 20 μg/mL dans le liquide céphalo-rachidien saline ou artificiel (ACSF) composé de (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 glucose, 1,3 MgSO4, 2,5 CaCl2 équilibré avec 95% O2 et 5% CO2 (pH 7.2).
  2. Anesthésiez les souris avec du sel de sodium pentobarbital (60 mg/kg, intrapéritoneally), et vérifiez la perte du réflexe de droit.
  3. Pour le traitement s.c., injectez rtx (20 μg/mL) dans l’arrière du cou à un volume de 0,1 mL/10 g de poids corporel. Pour le groupe témoin, injectez le véhicule (10 % d’éthanol, 10 % de polyoxyéthylène (20) de sorbitan monooléate et 80 % de solution saline) de la même manière.
  4. Pour le traitement i.c.v., injectez 5 μL de RTX (20 μg/mL) dans le ventricule latéral droit. Pour le groupe témoin, injectez le véhicule (10 % d’éthanol, 10 % de polyoxyéthylène (20) de sorbitan et 80 % d’ACSF) de la même manière.
    1. Passer une aiguille jetable de 27 G à travers un tube métallique (0,8 mm d’I.D.) pour exposer la pointe de 3,0 à 3,5 mm de l’aiguille (figure 1A).
    2. Désinfecter la tête de la souris avec 70% d’alcool, et tenir fermement les os squamosal de la souris avec les doigts (Figure 1B).
      NOTE: Faites attention aux positions des protubérances squamosales, puisque ces protubérances serviront de repères pour l’injection.
    3. Déplacez l’aiguille sur le cuir chevelu, et trouver la suture sagittale que la pointe de l’aiguille est accroché à la suture.
    4. Déplacez la pointe d’environ 1 mm vers la droite, puis déplacez la pointe rostrally, et trouver la suture coronale comme avec 2.4.3. (Figure 1B).
    5. Insérez l’aiguille lentement et verticalement, injectez la solution RTX en environ 10 secondes et maintenez-la pendant environ 10 secondes.
    6. Retirez l’aiguille lentement et retournez la souris dans sa cage. Les saignements sont généralement minimes ou absents. Si des saignements majeurs se produisent, l’utilisation d’une autre souris doit être envisagée.
  5. Assignez les souris prétraitées comme sujets pour le test RTX ou le test de pression de la queue (étape 3 et 4, respectivement).

3. Test RTX

REMARQUE : Les tests sont effectués entre 10h00 et 17h00. La salle d’essai est maintenue à 200 lux et 24-26 °C.

  1. Une semaine après les prétraitements avec RTX (étape 2.), transférer les souris à la salle d’essai au moins 60 min avant de commencer le test.
  2. Pesez et placez chaque souris individuellement dans une cage en plexiglas (29,5 × 17,5 × 13,5 cm3 hauteur) au moins 30 min avant de commencer l’essai afin de lui permettre de s’acclimater à l’environnement.
    REMARQUE : L’ordre des tests doit être contrebalancé entre les groupes de prétraitement.
  3. Administrer l’acétaminophène (300 mg/kg) à la souris intraperitoneally 20 min avant le test.
  4. Tenez la souris lâchement dans un petit sac en tissu et insérez une aiguille de calibre 30 dans le talon de la patte arrière droite. Avancez l’aiguille sous-cutanéement jusqu’à proximité des plaquettes de marche et injectez 20 μL de solution RTX (0,05 μg/mL).
  5. Mesurer la période de léchage / comportement mordant dans la région de la patte affectée dans chaque bloc de 5 minutes.

4. Essai de pression de queue

REMARQUE : Un compteur de pression de type Randall-Selitto est utilisé pour évaluer le seuil de nociception mécanique aiguë. Les tests sont effectués entre 10h00 et 17h00. La salle d’essai est maintenue à 200 lux et 24-26 °C.

  1. Une semaine après les prétraitements avec RTX (étape 2.), transférer les souris à la salle d’essai, et peser et placer chaque souris individuellement dans une cage en plexiglas.
  2. Marquer les taches à 1,5 et 2,5 cm à partir de la base de la queue.
  3. Tenez la souris lâchement dans un petit sac en tissu, et appliquez la pression aux taches avec une sonde émoussée.
    REMARQUE : Une pression de coupure de 250 g est imposée pour éviter les dommages tissulaires.
  4. Déterminez la pression requise pour provoquer un comportement d’échappement (fouet, torsion et grincement de queue) et calculez le seuil nociceptif en faisant la moyenne de la pression déterminée aux deux endroits.
  5. Répétez les étapes 4.3. à 4.4. toutes les 15 minutes.
  6. Après avoir obtenu la ligne de base, administrer l’acétaminophène (300 mg/kg) à la souris intraperitoneally. Après l’administration, répétez les étapes 4.3. et 4,4 toutes les 15 minutes.

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Résultats

Les souris traitées par c.c.v. ne présentent aucune anomalie apparente dans leur apparence, leurs activités spontanées, leur poids corporel19 et leur température corporelle (groupe traité par le véhicule, 38,4 ± 0,3 °C, n = 6; Groupe traité par RTX, 38,7 ± 0,2 °C, n = 6).

Figure 2A-B montre la réactivité des souris traitées par s.c.- ou c.c.v. à l’injection i...

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Discussion

L’étape la plus critique de ces expériences est le succès de l’injection d’i.c.v. La technique d’injection i.c.v. utilisée ici est assez simple mais nécessite une certaine pratique. Avant les expériences, la pratique avec des colorants (p. ex. 0,5 % de bleu trypan en solution saline) est recommandée. Si l’injection est effectuée correctement, une marque d’aiguille doit être évidente sur la suture coronale et le colorant injecté doit être présent dans le ventricule contralatéral et le troisième ventricule. En outre, l’ins...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts à déclarer

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RésinifératoxineLKT LaboratoriesR1774utilisée pour les prétraitements s.c./i.c.v. et le test RTX
AcétaminophèneIWAKI SEIYAKUoffert par IWAKI SEIYAKU
Sel de sodium pentobarbitalTokyo Chemical IndustryP0776utilisé pour l’anesthésie
Éthanol (99.5)Wako Pure Chemical Industries057-00456utilisé pour dissoudre RTX
Polyoxyéthylène(20) Monooléate de sorbitanWako Pure Chemical Industries161-21621utilisé pour dissoudre RTX
25 μ ; L microseringueHamilton1702LTutilisée pour l’injection i.c.v.
100 μ ; Microseringue LHamilton1710LTutilisée pour l’injection intraplantaire
Aiguille jetable de calibre 26TERUMONN-2613Sutilisée pour l’injection i.c.v.
Aiguille jetable de calibre 30NIPRO01134utilisée pour l’injection intraplantaire
ManomètreUgo BasileAnalgésique Type 7200utilisé pour le test de pression de queue

Références

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